Dự đoán sinh khả dụng của thuốc dựa trên cấu trúc hóa học, tương tác thuốc glycoprotein P và tương tác thuốc Cyp3A4

Nhận biết các yếu tố hạn chế quá trình hấp thu của thuốc cũng như dự đoán chính xác sinh khả dụng của thuốc là một thách thức lớn đối với người làm khoa học và luôn đòi hỏi những nghiên

GLYCOPROTEIN P

VÀ TƯƠNG TÁC THUỐC - CYP3A4

HÀ NỘI - 2016 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÓA HỌC, TƯƠNG TÁC THUỐC - GLYCOPROTEIN P

VÀ TƯƠNG TÁC THUỐC - CYP3A4

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Lời cảm ơn

Trước hết với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin được gửi lời cảm ơn

chân thành tới TS.Phạm Thế Hải, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành

nhiều thời gian và tâm huyết tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến DS.Trịnh Tuấn Dũng, người

theo sát em trong suốt tiến trình giúp em vượt qua khó khăn, bỡ ngỡ

Em cũng rất cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Dược lực,bộ môn Hóa dược

cùng PGS.TS.Nguyễn Thu Hằng, em Hoàng Văn Quân - N3K67 đã hỗ trợ,

giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô trong trường đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức và dìu dắt em trong suốt 5 năm rèn luyện và học tập tại trường

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, gia đình và người thân đã luôn quan tâm chăm sóc, tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, ngày 6 tháng 5 năm 2016 Sinh viên

Cao Thị Duyên

MỤC LỤC Trang

DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1.DƯỢCĐỘNGHỌCTRONGNGHIÊNCỨUVÀPHÁTTRIỂNTHUỐC .3

1.2.SINHKHẢDỤNGCỦATHUỐCUỐNG 3

1.3.HẤPTHUQUATHÀNHRUỘT 5

1.3.1 Khuếch tán thụ động 6

1.3.2 Vận chuyển tích cực 6

1.4 ẢNH HƯỞNG CỦA GLYCOPROTEIN P (PGP) VÀ CYTOCHROM P450CYP3A4LÊNSINHKHẢDỤNGTHUỐCUỐNG 7

1.4.1 Glycoprotein P (Pgp) 7

1.4.2 Cytochrom P450 CYP3A4 8

1.4.3 Tính hiệp đồng giữa Pgp và CYP3A4 9

1.5.MÔHÌNHTHỰCNGHIỆMDỰĐOÁNSINHKHẢDỤNG 9

1.6.MÔHÌNHMÁYTÍNHDỰĐOÁNSINHKHẢDỤNG(INSILICO) 11

1.6.1 Mô hình dược động học sinh lý (PBPK) 11

1.6.2 Mô hình hoá tin (Cheminformatics) 12

1.6.3 Tình hình nghiên cứu xây dựng mô hình QSPR dự đoán sinh khả dụng 14

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 18

2.1.NGUYÊNLIỆU 18

2.2.NỘIDUNGVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 18

2.2.1 Tính toán các tham số phân tử đặc trưng cho cấu trúc (TSPT) 18

2.2.2 Phát triển các mô hình QSPR 19

2.2.2.1 Thiết kế tập huấn luyện và tập kiểm tra 20

2.2.2.2 Lựa chọn tham số phân tử 20

2.2.2.3 Xây dựng mô hình QSPR 21

2.2.2.4 Đánh giá các mô hình xây dựng được 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 24

3.1.MÔHÌNHDỰĐOÁNCƠCHẤTPGPVÀCYP3A4 24

3.2.MÔHÌNHDỰĐOÁNSINHKHẢDỤNG 26

3.2. ĐỘ TIN CẬY CỦAMÔ HÌNH VÀ SOSÁNH VỚI CÁC NGHIÊNCỨU ĐÃĐƯỢCTHỰCHIỆNTRÊNTHẾGIỚI 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

QSAR/QSPR Tương quan định lượng giữa cấu trúc và tác dụng/tính chất

Fg Phần trăm thuốc không bị chuyển hóa tại ruột

ADME Hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ

In silico Nghiên cứu trên máy tính

In vitro Nghiên cứu trong ống nghiệm

In vivo Nghiên cứu trên cơ thể động vật

OECD Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 3.1 Mô hình dự đoán cơ chất Pgp và CYP3A4 24

2 Bảng 3.2 Ý nghĩa các TSPT được lựa chọn trong mô hình cây 26

3 Bảng 3.3 Ma trận mờ và kết quả dự đoán mô hình cây trên tập

kiểm tra

29

4 Bảng 3.4 Cơ sở dữ liệu của tập huấn luyện 30

5 Bảng 3.5 Cơ sở dữ liệu của tập kiểm tra 39

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Hình 1.1 Quá trình hấp thu của thuốc qua đường tiêu hóa 4

2 Hình 1.2 Các cơ chế vận chuyển thuốc qua niêm mạc ruột 5

3 Hình 1.3 Ưu nhược điểm của các mô hình thực nghiệm trong

dự đoán sinh khả dụng của thuốc uống trên người

10

4 Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát của mô hình cây quyết định 22

5 Hình 3.1 Sơ đồ cây phân lớp sinh khả dụng (12 nút trong, 14

nút lá)

26

6 Hình 3.2 Độ chính xác (%Q) của mô hình cây sau khi đánh giá

nội và đánh giá ngoại

28

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sinh khả dụng (F) là thông số quan trọng của sự hấp thu, được tính bằng

tỷ lệ (%) thuốc vào đến vòng tuần hoàn chung ở dạng còn hoạt tính so với liều

đã dùng Nhận biết các yếu tố hạn chế quá trình hấp thu của thuốc cũng như

dự đoán chính xác sinh khả dụng của thuốc là một thách thức lớn đối với người làm khoa học và luôn đòi hỏi những nghiên cứu mới, hướng đi mới bên cạnh các phương pháp truyền thống nhằm phát triển các thuốc hiệu quả và an toàn hơn cho người bệnh Một trong các phương pháp mới, được ứng dụng khá thành công trong dự đoán sớm sinh khả dụng cũng như các tính chất dược động học và độc tính khác của thuốc là mô hình tương quan định lượng giữa

cấu trúc và tính chất của thuốc (Quantitative Structure–Property

Relationship- QSPR) Mô hình QSPR có thể được dùng để dự đoán sinh khả

dụng cho tập hợp rất lớn các hợp chất, chỉ cần tính toán được các tham số phân tử của chúng Ngoài ra, các mô hình QSPR cho phép nghiên cứu sâu bản chất lý/hóa và các tương tác của quá trình dược động học Do đó phương pháp này có thể được áp dụng trong toàn bộ quá trình phát hiện và phát triển thuốc

tiền lâm sàng, từ tối ưu hóa các hit tới sàng lọc các hợp chất cho các thử nghiệm in vivo

Mặt khác, trong rất nhiều yếu tố tham gia quá trình chuyển hóa bước một như các protein vận chuyển màng tế bào (ABC, SLC, SLCO ) hay các cytochrome P450 (CYP2C, CYP2D, CYP3A ), bơm tống xuất glycoprotein

P (Pgp) và enzyme chuyển hóa CYP3A4 là hai yếu tố chính hạn chế sự hấp thu của thuốc Đa số các thuốc trên thị trường có tương tác với cả hai yếu tố trên Cơ chế hoạt động của Pgp và CYP3A4, mặc dù còn nhiều tranh cãi nhưng luôn thể hiện tính hiệp đồng mạnh trong chuyển hóa bước một của các thuốc tại ruột và gan Để đánh giá khả năng hấp thu của các thuốc dùng đường uống, không thể không xét đến hai yếu tố này Tuy nhiên hiện nay các

2

mô hình QSPR dự đoán sinh khả dụng đã được phát triển đang bỏ qua tương

tác thuốc quan trọng này, đặc biệt đối với các thuốc là cơ chất của cả Pgp và

CYP3A4 Điều đó dẫn đến độ chính xác của các mô hình không cao và tính

ứng dụng còn hạn chế

Do đó, tôi hướng tới nâng cao chất lượng mô hình QSPR và tiến hành đề

tài “Dự đoán sinh khả dụng của thuốc dựa trên cấu trúc hóa học, tương

tác thuốc - glycoprotein P và tương tác thuốc - CYP3A4” với mục tiêu:

- Xây dựng được mô hình dự đoán sinh khả dụng của thuốc dựa trên cấu

trúc hóa học, tương tác thuốc – Glycoprotein P và tương tác thuốc –

CYP3A4

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 DƯỢC ĐỘNG HỌC TRONG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN THUỐC

Nghiên cứu và phát triển thuốc là một quá trình rất khó khăn, tốn kém cả

về thời gian và tiền bạc Ước tính phải mất 15 năm để đưa một hoạt chất mới

ra thị trường, với chi phí trong khoảng 800 triệu – 1,7 tỷ USD [52] Tuy nhiên, tỷ lệ thành công của các nghiên cứu phát triển thuốc lại rất thấp Mỗi năm có hàng triệu hợp chất được thử nghiệm bởi các công ty dược trên toàn thế giới nhưng số lượng thuốc mới đến được với thị trường chỉ vỏn vẹn khoảng 25 đầu thuốc [8] Một trong những nguyên nhân chính gây nên hiệu suất thấp của quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc là vì các ứng viên mới không thỏa mãn các tiêu chí về dược động học cần thiết Trong thập kỷ 90 có tới hơn 40% chất mới gặp vấn đề liên quan đến hấp thu, phân bố, chuyển hóa hay thải trừ (gọi chung là ADME) và phải dừng bước trên con đường thành thuốc Sau năm 2000, thế giới đã quan tâm hơn đến các vấn đề này Tuy nhiên

tỷ lệ thất bại vì nguyên nhân liên quan đến ADME vẫn còn khá cao (trên 10%) [21], [36], [56] Do đó, các nhà nghiên cứu đã và đang cố gắng tìm ra các phương pháp mới nhằm sàng lọc loại bỏ các thuốc có dược động học không phù hợp, trước khi tiếp tục thực hiện các thử nghiệm lâm sàng

1.2 SINH KHẢ DỤNG CỦA THUỐC UỐNG

Hấp thu là giai đoạn đầu tiên trong quá trình dược động học của thuốc Nó được định nghĩa là sự vận chuyển thuốc từ vị trí đưa thuốc vào hệ tuần hoàn chung của cơ thể Hình 1.1 minh họa cho các quá trình của thuốc dạng rắn từ sau khi uống cho đến khi xâm nhập vào vòng tuần hoàn

4

Hình 1.1 Quá trình hấp thu của thuốc qua đường tiêu hóa

Quá trình hấp thu thuốc qua đường tiêu hóa là một quá trình phức tạp, chịu ảnh hưởng của hàng loạt các yếu tố thuộc về sinh lý cơ thể, các đặc tính hóa lý của hợp chất thuốc cũng như dạng bào chế của nó Nghiên cứu về hấp thu có vai trò to lớn trong việc sàng lọc các thuốc tiềm năng, đặc biệt đối với các thuốc dùng đường uống

Sinh khả dụng (F) là thông số quan trọng của sự hấp thu, được tính bằng

tỷ lệ (%) thuốc vào đến vòng tuần hoàn chung ở dạng còn hoạt tính so với liều

đã dùng Đối với thuốc dùng đường uống, sinh khả dụng là kết quả của một chuỗi các quá trình từ khi thuốc đi vào đường tiêu hóa, thấm qua niêm mạc ruột, theo tĩnh mạch cửa tới gan trước khi vào vòng tuần hoàn để đi đến các

cơ quan bộ phận khác trong cơ thể Sinh khả dụng đường uống thường có giá trị < 1 và được mô tả bằng phương trình:

Fh Fg Fa

với Fa là phần trăm hấp thu của thuốc tại ruột, Fg là phần trăm thuốc không bị chuyển hóa tại ruột, Fh là phần trăm thuốc không bị chuyển hóa bước một tại gan

Nhận biết các yếu tố hạn chế quá trình hấp thu của thuốc cũng như dự đoán chính xác các thông số đặc trưng cho quá trình này, ví dụ như Fa hay F là một thách thức lớn đối với người làm khoa học và luôn đòi hỏi những nghiên cứu

5

mới, hướng đi mới bên cạnh các phương pháp truyền thống nhằm phát triển

các thuốc hiệu quả và an toàn hơn cho người bệnh

1.3 HẤP THU QUA THÀNH RUỘT

Hấp thu qua thành ruột (Fa) được định nghĩa là lượng thuốc đi qua các tế

bào mô ruột, vào tĩnh mạch cửa tới gan dưới dạng không thay đổi Ruột non

là nơi hấp thu tốt nhất với hầu hết các thuốc dùng đường uống Nhìn chung,

sự khác biệt giữa giá trị của Fa và F của thuốc uống chủ yếu là do chuyển hóa

bước đầu qua gan (F ≤ Fa) Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng hơn

một nửa các thuốc có sinh khả dụng và độ hấp thu qua thành ruột tương tự

nhau [48] Vì vậy, hấp thu qua thành ruột được coi là dấu hiệu dự đoán sinh

khả dụng của một thuốc dùng đường uống

Hai cơ chế vận chuyển quan trọng nhất của thuốc qua niêm mạc ruột là

khuếch tán thụ động (passive diffusion) và vận chuyển tích cực qua chất

mang (active/carrier mediated transport), ngoài ra thuốc có thể được vận

chuyển từ ruột non vào hệ mao mạch qua một số cơ chế vận chuyển đặc biệt

khác như ẩm bào, thực bào, lọc qua các kênh protein chứa đầy nước xuyên

qua màng (Hình 1.2)

Hình 1.2 Các cơ chế vận chuyển thuốc qua niêm mạc ruột

6

1.3.1 Khuếch tán thụ động

Khuếch tán thụ động hay sự thấm là quá trình thuốc khuếch tán từ nơi có

nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp Sự khuếch tán thụ động của thuốc tuân theo định luật Fick Hai con đường của khuếch tán thụ động là transcellular và paracellular Trong transcellular khuếch tán, phân tử thuốc thấm qua các tế bào đỉnh của biểu mô ruột, khuếch tán qua bào tương bên trong tế bào, cuối cùng khuếch tán qua màng đáy và hấp thu vào máu Các phân tử thuốc có kích thước nhỏ, thân dầu được khuếch tán nhanh chóng vào máu theo cơ chế này Nhiều nghiên cứu đã chứng minh phần lớn các thuốc được vận chuyển theo con đường thấm qua các tế bào đỉnh của biểu mô ruột Vì thế các mô hình thực nghiệm và lý thuyết mô phỏng vận chuyển thuốc theo cơ chế này

thường được quan tâm đặc biệt

Khác với transcellular khuếch tán, paracellular khuếch tán là hình thức khuếch tán qua khoảng kẽ giữa hai tế bào biểu mô niêm mạc ruột, thích hợp với các phân tử thuốc nhỏ, các cation, các thuốc thân nước (khối lượng phân

tử < 200 Dalton và log P < 0) Do khoảng kẽ giữa hai tế bào biểu mô chỉ chiếm một diện tích bề mặt nhỏ (0,1% - 0,01% diện tích màng ruột), càng về phần phía sau của ruột non các khoảng kẽ càng thu hẹp, vì vậy hình thức paracellular khuếch tán không có nhiều vai trò đối với sự hấp thu thuốc qua đường tiêu hóa

1.3.2 Vận chuyển tích cực

Vận chuyển tích cực là hình thức vận chuyển thuốc qua màng tế bào có sử dụng các chất mang trung gian (carrier mediated transport) là các phân tử protein nằm phía ngoài màng tế bào Đây là một quá trình hoạt động cần năng lượng từ ATP, không tuân theo định luật Fick, khác với cơ chế vận chuyển khuếch tán thụ động Đặc trưng của các chất mang này là tính đặc hiệu, mỗi chất mang chỉ vận chuyển những cơ chất có cấu trúc phù hợp Những kênh

sự phi tuyến tính của quá trình hấp thu, và có thể ảnh hưởng đến các quá trình dược động học khác của thuốc

Ở người, các chất vận chuyển có bản chất là di / tri-peptide transporter (hPepT1) nằm ở đỉnh tế bào màng ruột Những chất vận chuyển hPepT1 tạo điều kiện cho sự hấp thu một số thuốc ở ruột như các kháng sinh beta lactam,

và các chất ức chế angitension Một số chất vận chuyển có bản chất là các polypeptide ở người có vai trò vận chuyển các anion hữu cơ được tìm thấy ở ruột và đại tràng cụ thể là OATP-B (SLC21A9), OATP-D (SLC21A11) và OATP-E (SLC21A12) Trong ruột non và đỉnh màng tế bào Caco-2 có mặt các chất vận chuyển cation hữu cơ (SLC22A), OCTN2 (SLC22A5) Tuy nhiên, trên lâm sàng tầm quan trọng của OCTN2 đối với sự hấp thu của thuốc không được rõ Hệ thống vận chuyển các nucleoside, axit amin, glucose và acid mật cũng hiện diện trong ruột

1.4 ẢNH HƯỞNG CỦA GLYCOPROTEIN P (Pgp) VÀ CYTOCHROM P450 CYP3A4 LÊN SINH KHẢ DỤNG THUỐC UỐNG

1.4.1 Glycoprotein P (Pgp)

P-glycoprotein (Pgp) là một loại chất vận chuyển hoạt động như những rào cản sinh lý có vai trò tống xuất các chất độc ra khỏi tế bào Pgp có mặt ở khắp các tổ chức trong cơ thể, chủ yếu được tìm thấy trong các tế bào biểu mô

có vai trò bài tiết bao gồm các tế bào biểu mô lót ruột già, ruột non, tế bào

8

tụy, tuyến thượng thận, tế bào nội mô mạch máu, gan, não, và biểu hiện hoạt động quá mức trên các tế bào ung thư Ở người Pgp có 2 loại, loại I (MDR1 / ABCB1) là một kênh vận chuyển thuốc, trong khi loại II (MDR2 / 3 / ABCB4) vận chuyển phosphatidylcholine vào đường mật Hàng trăm cơ chất (thường là các chất kỵ nước, có trọng lượng phân tử 250-1850 Dalton) có cấu trúc đa dạng có thể bị các Pgp vận chuyển ra khỏi tế bào như các thuốc chống ung thư, ức chế miễn dịch, kích thích tố steroid, thuốc chẹn kênh canxi, thuốc chẹn beta-adrenoreceptor, glycosid tim… Vai trò của Pgp là bảo vệ các tổ chức nhạy cảm khỏi các chất độc, ngăn cản chúng xâm nhập vào bào tương và tống xuất chúng ra bên ngoài Các Pgp này cũng tham gia vào sự bài tiết các chất chuyển hóa trong đường mật, đường tiết niệu, lòng ruột Do đó làm giảm sinh khả dụng đường uống và thời gian lưu của thuốc trong cơ thể Các biện pháp ức chế hoạt động của các Pgp nhằm tăng sinh khả dụng của thuốc đã được phát triển nhằm tối ưu hiệu quả sử dụng thuốc (VD : các thuốc trong hóa trị liệu ung thư) Pgp có thể bị ức chế theo 3 cơ chế: 1/ Cạnh tranh vị trí gắn (Atorvastatin cạnh tranh với digoxin gắn vào Pgp làm tăng nồng độ digoxin khi uống hai thuốc này cùng nhau); 2/ Thủy phân ATP làm mất năng lượng hoạt động của các Pgp; 3/ Thay đổi cấu trúc toàn vẹn của màng tế bào

1.4.2 Cytochrom P450 CYP3A4

Cytochrom P450 (CYP450) là một liên họ lớn chứa các hemoprotein xúc tác rất nhiều phản ứng enzyme khác nhau để chuyển hoá các chất nội sinh và ngoại sinh Tới nay người ta đã tìm được 18 họ và 43 chi thuộc CYP450 Trong số đó, chỉ có ba họ CYP1, CYP2 và CYP3 được xem là chịu trách nhiệm chính trong chuyển hoá thuốc Ở người, CYP3A4 là isoform chính của

họ enzyme CYP3A, có mặt với lượng lớn trên ruột và gan, chiếm tới hơn 60% lượng CYP có mặt trên tế bào gan và 70% lượng CYP trên tế bào niêm mạc ruột CYP3A4 thuộc hệ thống enzyme chuyển hóa cytochrome P450 oxidase

9

(EC 1.14.14.1), có khả năng chuyển hóa tới hơn 50% các thuốc hiện lưu hành trên thị trường [18] CYP3A4 chủ yếu xúc tác quá trình oxy hoá các hợp chất thân dầu có tính base và trung tính, vị trí tác dụng của nó lại rất đàn hồi, có khả năng tăng kích cỡ lên tới hơn 90%, nhờ đó cho phép một lượng lớn các

cơ chất có thể gắn vào, từ những phân tử nhỏ cho tới những đại phân tử với khối lượng lên tới vài nghìn Dalton [16]

1.4.3 Tính hiệp đồng giữa Pgp và CYP3A4

Dựa trên đặc điểm phân bố trên ruột, gan và thận cũng như đặc điểm cấu trúc các cơ chất, giới khoa học tin rằng cơ chế hoạt động của CYP3A4 và Pgp

có nhiều điểm chung, đồng thời tương hỗ nhau nhằm hạn chế tối đa quá trình hấp thu của cơ chất [41], [43], [45], [46] Trên tế bào biểu mô thành ruột

(enterocytes), Pgp nằm trên vùng đỉnh (apical) tống xuất các thuốc ngược trở

lại đường tiêu hóa, giúp CYP3A4 có thể tiếp xúc nhiều lần với cơ chất, nhờ

đó tối ưu hóa khả năng chuyển hóa và giảm nồng độ thuốc tại vị trí hấp thu do CYP3A4 không bị bão hòa Ngược lại, trên tế bào gan, thuốc sẽ tiếp xúc với lượng lớn CYP3A4 nội bào, trước khi bị vận chuyển đa số tới mật nhờ Pgp

Do đó, thuốc là cơ chất của cả CYP3A4 và Pgp thường có sinh khả dụng rất thấp [43]

1.5 MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM DỰ ĐOÁN SINH KHẢ DỤNG

Trong thực nghiệm, sinh khả dụng có thể được xác định trực tiếp bằng mô

hình động vật thí nghiệm in vivo hoặc tính toán gián tiếp từ các thông số hấp thu đo được trên các mô hình cơ quan cô lập in situ hay trong ống nghiệm in

vitro Mô hình in vivo dĩ nhiên chính xác nhất vì phản ánh đầy đủ quá trình

sinh lý trong cơ thể Tuy nhiên các mô hình được thực hiện trên động vật thường đòi hỏi lượng thuốc thử cao hơn lượng sẵn có trong giai đoạn đầu của nghiên cứu Đồng thời, việc thử không chọn lọc thuốc trên động vật không chỉ

10

tiêu tốn nhiều thời gian và tiền bạc mà còn dễ bị phản đối về mặt đạo đức

[64] Sự ra đời của các phương pháp in vitro đã hỗ trợ, thậm chí có thể thay thế các phương pháp in vivo trong nghiên cứu dự đoán hấp thu và tính thấm của thuốc qua màng sinh học [60] Các mô hình in vitro bao gồm mô hình

màng thấm (VD Màng thấm nhân tạo song song PAMPA) và mô hình nuôi cấy tế bào (VD Tế bào dòng thận chó MDCK hay biểu mô ung thư ruột kết trên người Caco-2) hiện đang được sử dụng ngày càng rộng rãi trong nghiên

cứu và phát triển thuốc mới [63] Nhìn chung phương pháp in vitro đã cải

thiện phần nào về khả năng sàng lọc cũng như “tránh” vấp phải các vấn đề liên quan đến đạo đức Hình 1.3 mô tả ưu thế và nhược điểm của từng mô hình

Hình 1.3 Ưu nhược điểm của các mô hình thực nghiệm trong dự đoán sinh

khả dụng của thuốc uống trên người

Trong các mô hình thực nghiệm, in situ có thể được xem là mô hình trung gian giữa in vivo và in vitro Trong mô hình này, khoang bụng của động vật

thí nghiệm được bộc lộ Các đoạn ruột khác nhau có thể được cô lập với các

cơ quan khác Để thuận tiện trong định lượng, các thí nghiệm thường được thiết kế nhằm đánh giá biến thiên nồng độ thuốc tại vị trí hấp thu Phương

pháp này có ưu thế so với in vitro là duy trì được tưới máu, cho phép lấy mẫu

chủ động do đó có thể áp dụng nghiên cứu nhiều cơ chế hấp thu khác nhau

11

Ngoài ra, mô hình tương đối đơn giản trong khâu mổ và lấy mẫu, chi phí và

thời gian nghiên cứu thấp hơn so với mô hình in vivo truyền thống [15] Hiện nay có hai mô hình in situ được sử dụng rộng rãi nhất, đó là mô hình vòng lặp

khép kín của Doluiso [14] và mô hình bước đơn (vòng lặp mở) của Higuchi [19]

1.6 MÔ HÌNH MÁY TÍNH DỰ ĐOÁN SINH KHẢ DỤNG (IN SILICO)

Hiện nay có một thực tế là số lượng hợp chất mới được tổng hợp cũng như được phát hiện trong tự nhiên đang tăng lên với tốc độ chóng mặt Hiệp hội hóa chất Hoa Kỳ ghi nhận tổng cộng hơn 92 triệu hóa chất và 65 triệu chuỗi đã có trong đăng ký CAS, với hơn 15 000 hợp chất mới được bổ sung mỗi ngày tính tới tháng 3 năm 2015 (theo http://www.cas.org/index) Yêu cầu đánh giá sớm sinh khả dụng cũng như các tính chất dược động học và độc tính khác của hợp chất dẫn đường đã khiến giới khoa học và ngành công nghiệp dược chuyển hướng quan tâm tới phương pháp nghiên cứu mới, hoàn

toàn dựa trên máy tính, gọi tắt là phương pháp in silico nhằm phân biệt với các phương pháp in vivo và in vitro [47]

Phương pháp in silico trong nghiên cứu hấp thu và sinh khả dụng được

chia thành hai nhóm chính, phụ thuộc vào đặc điểm của các biến được sử

dụng: mô hình hóa tin (Cheminformatics) và mô hình dược động học sinh lý (Physiologically Based Pharmacokinetic Modeling)

1.6.1 Mô hình dược động học sinh lý (PBPK)

Mô hình PBPK dựa trên nguyên tắc đa ngăn của cơ thể nhằm mô phỏng quá trình sinh lý từ khi thuốc đi vào cơ thể đến khi thuốc được đào thải ra ngoài Trong mô hình này, các cơ quan có cùng đặc điểm giải phẫu và sinh lý, bao gồm đường tiêu hóa là cơ quan hấp thu, cơ quan thải trừ bao gồm gan và

thải…, mô hình sinh lý có thể mô tả chính xác biến thiên nồng độ vs thời gian

của một thuốc trong cơ thể sau khi thuốc được đưa vào bằng đường uống [59] Xét về mặt cấu trúc, mô hình sinh lý có lợi thế về khả năng mô phỏng tốt quá trình hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ (ADME) của thuốc Tuy nhiên các quá trình này đều là quá trình động học và được biểu diễn bằng các phương trình vi phân rất phức tạp, đòi hỏi phải sử dụng các phần mềm chuyên dụng để giải như R, MATLAB… Mặc dù một số phần mềm tích hợp sẵn các

mô hình sinh lý như GastroplusTM

, iDEATM, PK-Sim®, Intellipharm®PK hay Symcyp® [31], [64] đã được phát triển có thể dùng để dự đoán sinh khả dụng, khả năng kiểm chứng của các mô hình này còn hạn chế cộng với giá thành khá đắt và việc không xem xét mối tương quan cấu trúc-tính chất của thuốc là những hạn chế chính Ngoài ra việc nhập các thông số sinh lý (đôi khi là các

số đo tiền lâm sàng và lâm sàng) vào phần mềm không cho phép sàng lọc số lượng lớn các thuốc cũng như gây sai số trong dự đoán [10]

1.6.2 Mô hình hoá tin (Cheminformatics)

Trái ngược với các mô hình sinh lý, các mô hình hóa tin chủ yếu dựa trên

mối tương quan định lượng cấu trúc- tính chất (Quantitative Structure-

Property Relationship, QSPR) nhằm xây dựng các phương trình toán học

(tuyến tính hoặc không tuyến tính) tính toán sinh khả dụng của thuốc [9] Trong suốt hai thập kỷ qua, các mô hình QSPR đã trở thành công cụ ngày càng quan trọng để nghiên cứu các quá trình sinh-hóa phức tạp trong phát triển thuốc mới, đặc biệt trong mô tả các quá trình dược động học [12] Đối với một thuốc, các thông số dược động học như sinh khả dụng được xem là có

13

mối tương quan định lượng với thông tin cấu trúc phân tử (các tham số liên

quan đến động học phân tử, dược tính hay pharmacophore, đồng đẳng hay

homology, lượng tử, cấu trúc topo, cấu trúc không gian 3D hay 4D, đặc điểm

hóa lý như pH, pKa, tính tan, phân cực…) Kỹ thuật xây dựng mô hình QSPR cũng rất đa dạng, bao gồm các kỹ thuật thống kê như hồi quy tuyến tính

(Linear regression), hồi quy logistic (Logistic regression), phân tích phân nhóm (Linear discriminant analysis, Cluster analysis…) Ngoài ra các kỹ

thuật học máy (giám sát và không giám sát) như mạng nơ-ron nhân tạo

(Multilayer perceptron, Self organizing map, Bayesiane…), cây quyết định (Decision tree, Random forest), k láng giềng gần nhất hay máy vector hỗ trợ (Support vector machine) cũng được sử dụng rất nhiều trong xây dựng mô

hình QSPR [10], [57] Nhìn chung, hấp thu là một quá trình động học, đa chiều và phi tuyến tính, do đó các kỹ thuật xây dựng mô hình thống kê cổ điển thường không cho kết quả tốt và đáng tin cậy Các kỹ thuật học máy, mặc dù phức tạp hơn về mặt toán học, hiện đang được ưu tiên sử dụng trong xây dựng mô hình QSPR dự đoán sinh khả dụng nói riêng và các thông số ADME nói chung [10]

Khi mô hình QSPR được xây dựng thành công, bất kỳ hợp chất nào, bao gồm cả những chất chưa từng được tổng hợp, có thể dễ dàng được sàng lọc trên máy tính nhằm phát hiện các hợp chất có đặc điểm dược động học mong muốn Sau đó, chúng có thể được tổng hợp và thử nghiệm hoạt tính với cơ hội thành công cao hơn Mô hình QSPR có thể được dùng để dự đoán sinh khả dụng cho tập hợp rất lớn các hợp chất, chỉ cần tính toán được các tham số phân tử của chúng Vì vậy phương pháp QSPR giúp tiết kiệm chi phí và rút ngắn thời gian phát triển một thuốc mới Ngoài khả năng dự đoán cấu trúc, các mô hình QSPR cho phép nghiên cứu sâu bản chất lý/hóa và các tương tác của quá trình dược động học [42] Do đó phương pháp nghiên cứu này có thể

14

được áp dụng trong toàn bộ quá trình phát hiện và phát triển thuốc tiền lâm

sàng, từ tối ưu hóa các hit tới sàng lọc các hợp chất cho các thử nghiệm in

vivo Nhằm kiểm định chất lượng của các mô hình QSPR, Tổ chức Hợp tác và

Phát triển Kinh tế OECD đã đưa ra năm nguyên lý mà một mô hình QSPR

phải thỏa mãn: (i) enpoint cụ thể, (ii) thuật toán rõ ràng, (iii) có tập xác định,

(iv) thước đo độ thích hợp, độ chuẩn xác và khả năng dự đoán của mô hình, (v) giải thích tham số, nếu có thể [30]

1.6.3 Tình hình nghiên cứu xây dựng mô hình QSPR dự đoán sinh khả dụng

Nhằm khảo sát tình hình nghiên cứu trên thế giới liên quan đến ứng dụng

và phát triển các mô hình QSPR dự đoán độ hấp thu và sinh khả dụng của thuốc, chúng tôi đã tiến hành rà soát các công bố dựa trên tham chiếu chéo từ các cơ sở dữ liệu (CSDL) online sau:

Science Direct (http://www.sciencedirect.com), ISI Web of Science (http://apps.isiknowledge.com) và PUBMED (http://www.nbci.nlm.nih.gov) trong khoảng thời gian 15 năm (1997 – 2012) [9] Từ khóa tìm kiếm bao gồm:

pharmacokinetic, ADME, intestinal absorption, bioavailability, QSAR/QSPR, prediction và in silico

Khảo sát chỉ dựa trên các bài báo có nội dung liên quan đến mô hình

QSPR về tương quan giữa biến sinh học (phần trăm hấp thu qua ruột Fa, sinh khả dụng F và tính thấm in vitro có thể dùng để ngoại suy ra giá trị Fa) với

các tham số cấu trúc Bài tổng quan hay các nghiên cứu thử nghiệm phần mềm bản quyền đều không được thống kê

Kết quả của khảo sát bao gồm 57 công trình đã được công bố thỏa mãn tiêu chí tìm kiếm Trong đó có 11 bài báo nghiên cứu sinh khả dụng bằng

phương pháp QSPR, 7 trong số đó dự đoán giá trị F bằng các phương pháp

15

hồi quy, 4 bài còn lại dùng mô hình phân lớp Mô hình QSPR về sinh khả dụng chỉ thực sự bắt đầu được quan tâm từ năm 2000, với các công trình của Andrew, Bennett và Xu [6] và của Yoshida và Topliss [51] Số lượng công bố vẫn tăng tuy nhiên vẫn còn ít so với các đề tài ứng dụng phương pháp QSPR cho các vấn đề khác Một vài điểm đáng lưu ý như sau:

So sánh số lượng xuất bản tính theo quốc gia cho thấy Mỹ và Nhật là hai quốc gia dẫn đầu, tiếp theo là Thụy Điển, Trung Quốc và Cuba, chiếm tới hơn 60% số lượng ấn phẩm trong giai đoạn 1997-2012 Trong đó Việt Nam chưa

có nghiên cứu nào liên quan đến đề tài này

Về cơ sở dữ liệu, chủ yếu các nghiên cứu sử dụng số liệu từ cuốn

Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, cũng

như số liệu thu thập trong các bài báo của Moda et al., Wang et al và Yoshida et al [34], [39], [40], [51], [62] Số lượng các hợp chất vẫn còn hạn

chế (~600 thuốc) vì chủ yếu những CSDL về sinh khả dụng lớn đều là số liệu thu thập và tổng hợp nội bộ của các công ty dược trên thế giới, VD GSK [44]

Về loại mô hình, khảo sát cho thấy đa số các nghiên cứu tập trung phát triển mô hình dự đoán sinh khả dụng bằng phương pháp hồi quy Mặc dù

phương pháp này giúp xác định giá trị F cụ thể, sai số của kết quả là rất lớn

Lý do chính là vì quá trình hấp thu là một quá trình sinh/lý/hóa rất phức tạp, phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, bao gồm độ tan, tính thấm, tốc độ tháo rỗng, dạng bào chế, chuyển hóa bước một tại gan và ruột, bên cạnh các yếu tố liên quan đến cấu trúc hóa học của thuốc Hơn nữa số liệu đo đạc còn phụ thuộc vào một số yếu tố khác như bệnh học, cá thể hay tương tác với thức ăn…

Trong bài khảo sát của mình, Wang et al phân tích 367 thuốc có sinh khả

dụng đo trên người và kết luận rằng chất lượng mô hình QSPR luôn bao gồm một sai số ẩn và sai số tiêu chuẩn tương ứng là 12,1% và 14,5% [47] Trong

16

phân tích mới nhất, Perez et al kết luận rằng mô hình phân lớp là giải pháp

hữu hiệu nhất cho dự đoán chính xác sinh khả dụng của thuốc [9] Với việc

phân chia giá trị F thành các khoảng có ý nghĩa, mô hình phân lớp QSPR vẫn

giữ nguyên được giá trị sử dụng đồng thời giảm thiểu được sai số gây nên do các yếu tố ẩn mà chủ yếu là biến thiên cá thể và điều kiện môi trường Perez

et al cũng tổng hợp các nghiên cứu trước đó và đề xuất phân lớp sinh khả

di truyền là phương pháp lựa chọn biến không phụ thuộc [33] và kỹ thuật

Máy vector hỗ trợ thường cho kết quả tốt trong các nghiên cứu đã đăng

Trong các kỹ thuật học máy, Cây quyết định có thể được xem là lai hóa giữa các kỹ thuật thống kê cổ điển và kỹ thuật học máy và cũng mới được sử dụng trong xây dựng mô hình QSPR dự đoán tính chất ADME, đặc biệt là phần trăm hấp thu, tính thấm và sinh khả dụng của thuốc Không chỉ cho kết quả tốt, Cây quyết định cũng cho phép người dùng đánh giá tác động của từng yếu

tố được lựa chọn trong mô hình, giúp diễn giải kết quả và phân tích được bản chất của mối tương quan giữa sinh khả dụng và cấu trúc hóa học

Về chất lượng của các mô hình thu được, xét riêng đối với các mô hình phân lớp, các công trình đăng tải đến thời điểm khảo sát chưa cho kết quả thực sự tốt Các mô hình QSPR hiện nay so với mô hình đầu tiên phát triển bởi Yoshida và Topliss [51] chưa thực sự cải thiện về độ chuẩn xác (đánh giá

17

bằng thông số chuẩn xác chung %Q cho tập huấn luyện) và khả năng dự đoán (% dự đoán đúng %P của tập kiểm nghiệm) Mô hình của Yoshida và Topliss cho %Q và %P tương ứng là 71 và 60% [51] 8 năm sau, nghiên cứu của Ma

et al [58], sử dụng Máy vector hỗ trợ kết hợp với Thuật giải di truyền, cũng

chỉ cho kết quả dự đoán phân lớp sinh khả dụng với độ chuẩn xác ~ 80% cho phân lớp có hấp thu cao, tuy nhiên đối với các thuốc thuộc nhóm hấp thu thấp, kết quả chỉ là ~25% Khi phân tích dữ liệu được sử dụng trong các bài báo

nêu trên, chúng tôi nhận thấy CSDL được sử dụng trong bài báo của Ma et al

mặc dù số liệu đã tăng lên gấp 3 lần (tới 692 thuốc và hợp chất giống thuốc), lại bao gồm rất nhiều cơ chất của enzyme cytochrome CYP3A4 và các protein

tống xuất, đặc biệt là Pgp [38], [58]

Các phân tích nói trên làm rõ một vấn đề mà các nghiên cứu dự đoán sinh khả dụng đang gặp phải, đó là việc bỏ qua tương tác thuốc/CYP3A4 và thuốc/Pgp Tuy nhiên, việc nhận biết và xác định đặc điểm ưu tiên tương tác giữa thuốc là cơ chất của CYP3A4, Pgp hay cả hai yếu tố này bằng thực nghiệm không hề dễ dàng Các nghiên cứu QSPR hiện nay hoặc dừng lại ở

mô hình dự đoán sinh khả dụng, cơ chất CYP3A4 hay Pgp riêng lẻ, hoặc có phân tích tuy nhiên chỉ là phân tích các kết quả mà chưa đưa ra giải pháp cụ

thể nhằm làm tăng chất lượng mô hình Dựa trên nghiên cứu của Ma et al.,

chúng tôi loại bỏ tất cả các thuốc là cơ chất của cả CYP3A4 và Pgp, độ chính xác của mô hình trong dự đoán các thuốc có sinh khả dụng thấp (<20%) lập tức được cải thiện (từ ~25% lên >50%) Điều đó nói lên rằng, mô hình QSPR

dự đoán sinh khả dụng phải được xây dựng dựa trên nhận biết tiền nghiệm về tương tác giữa thuốc là cơ chất của CYP3A4 và Pgp

18

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU

- Cơ sở dữ liệu (CSDL): Các số liệu liên quan đến sinh khả dụng trên người,

đặc điểm cơ chất hay không của Pgp/CYP3A4 và cấu trúc hóa học của

349 thuốc được thu thập từ các công trình đã được công bố[5], [7], [11],

[17], [22], [23], [24], [26], [27], [32], [35], [37], [49], [50]

6.0, phần mềm xây dựng mô hình STATISTICA bản 8.0 [1]],2], [4]

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Tính toán các tham số phân tử đặc trưng cho cấu trúc (TSPT)

Tham số phân tử là kết quả của một quá trình toán học logic chuyển đổi

thông tin được mã hóa trong cấu trúc hóa học thành một số đặc trưng cho

phân tử đó [61] Các tham số phân tử này cho phép tìm kiếm mối liên hệ cấu

trúc/kết quả cũng như quá trình tìm kiếm dựa trên sự tương đồng về cấu trúc,

hay tìm kiếm các cấu trúc con

Một số lượng lớn các tham số phân tử được sử dụng để mô hình hóa

các thuộc tính của quá trình dược động học của thuốc Trong đó, các tham số

cấu trúc một, hai và ba chiều (1-3D) được chỉ ra là có thể dùng để xây dựng

các mô hình ADME với độ chính xác cao Quá trình lựa chọn các tham số

phân tử phụ thuộc vào mục đích cuối cùng của mô hình được xây dựng

Loại đơn giản nhất (tham số phân tử một chiều – 1D) cung cấp các

thông tin cấu trúc của hợp chất như khối lượng phân tử, số và loại các nguyên

tử/ liên kết trong một công thức giản lược; chẳng hạn, như tổng số nguyên tử,

tổng số mảnh nguyên tử, các nhóm như nhóm aliphatic ethers, hoặc nhóm

amin bậc ba… Các tham số hai chiều 2D dựa trên sự kết nối hay graph của

19

một phân tử và không phụ thuộc vào cấu trúc phân tử và không phụ thuộc vào cấu dạng phân tử Các tham số phân tử ba chiều 3D phản ánh bản chất ba chiều của cấu trúc phân tử (cấu dạng, đồng phân) và không gian xung quanh chúng (hóa học lập thể) [61] Nên sử dụng nhiều loại tham số phân tử với bản chất khác nhau để xây dựng các mô hình QSAR/QSPR

Trong đề tài này sử dụng Dragon phiên bản 6.0 để tính toán các tham

số phân tử Chương trình này bao gồm 4800 loại tham số phân tử, từ những loại đơn giản nhất (1D) đến những loại phức tạp hơn

Tính toán tham số phân tử: Các phân tử trong CSDL được download từ

trang web của PubChem (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi)

dưới dạng đã mã hóa 2D SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry

Specification) 199 tham số thuộc nhóm chức, phân đoạn nguyên tố và tính

Mục tiêu là xây dựng mô hình QSPR dự đoán %F tích hợp 3 yếu tố: đặc

điểm cấu trúc hóa học, tương tác với Pgp và CYP3A4 Do đó, 3 mô hình

QSPR được xây dựng theo các bước như sau:

- Bước 1: Xây dựng 2 mô hình phân tích phân lớp tuyến tính (Linear

discriminant analysis- LDA), dựa trên các tham số phân tử nhằm phân

biệt các hợp chất là cơ chất hay không của Pgp và CYP3A4 Xác xuất

hậu nghiệm (posteriori probability ∆P = %PCơ-chất - %PKhông-cơ-chất) được

ghi nhận cho mỗi mô hình

20

- Bước 2: Sử dụng giá trị ∆P (Bước 1) kết hợp với các tham số phân tử, xây dựng mô hình dạng cây (classification tree- CT) nhằm phân lớp sinh khả dụng của thuốc thành 3 nhóm:

i Nhóm 1: Hấp thu thấp (F < 20%),

ii Nhóm 2: Hấp thu trung bình (F = 20-80%), iii Nhóm 3: Hấp thu cao (F ≥ 80%)

2.2.2.1 Thiết kế tập huấn luyện và tập kiểm tra

Bước đầu tiên được tiến hành sử dụng kỹ thuật phân tích cụm bằng phân

cấp (cluster k-media) (k-MCA) của chương trình STATISTICA [2] Sử dụng

kỹ thuật phân tích cụm các trường hợp (là các hợp chất được mã số thành các biến là các tham số phân tử đặc trưng cho cấu trúc) được nhóm lại với nhau thành các cụm khác nhau tùy thuộc vào mức độ tương đồng về cấu trúc của các hợp chất Trước khi áp dụng các kỹ thuật phân tích cụm, các biến được

tiêu chuẩn hóa (standardized) Trong quá trình tiêu chuẩn hóa, giá trị của các biến được thay thế bằng giá trị được tiêu chuẩn hóa (Std Score) của các biến

ấy được tính toán theo công thức: Std score = (raw score - mean)/Std

deviation Phương pháp này chia mỗi lớp thành các cụm khác nhau (các hợp

chất trong cùng 1 cụm có cấu trúc giống nhau hơn so với các cụm khác) Từ từng cụm trên, lấy ra 291 thuốc (80%) để xây dựng tập huấn luyện và 58 thuốc (20%) các thuốc để xây dựng tập kiểm tra Tập huấn luyện dùng để xây dựng mô hình và tập kiểm tra dùng để đánh giá khả năng dự đoán của mô hình

2.2.2.2 Lựa chọn tham số phân tử

Đối với các kỹ thuật LDA, chúng tôi sử dụng phương pháp Forward

Stepwise (FS) đánh giá trong từng bước để đồng thời thêm vào hay loại bỏ bớt

biến, dựa vào giá trị của p hoặc tỉ số Fisher (F) Từ các biến này sẽ được tiến

hành đánh giá để lựa chọn các tập hợp con tốt nhất các biến Quá trình lựa

21

chọn tập hợp biến tốt nhất sử dụng tiêu chí đánh giá Wilks Lambda (λ), để lựa

chọn những biến có ảnh hưởng lớn nhất đến biến phụ thuộc Các thông số

thống kê chuẩn, như giá trị bình phương của khoảng cách Mahalanobis (D2

),

F và giá trị p tương ứng được sử dụng để đánh giá tập hợp TSPT được lựa

chọn

Đối với kỹ thuật cây quyết định (Classification tree), quy trình lựa chọn

TSPT đã bao gồm trong quá trình tối ưu hóa cấu trúc cây Kích thước cây được lựa chọn thủ công dựa trên kết quả của gần 100 bước chạy giải thuật FACT-style

2.2.2.3 Xây dựng mô hình QSPR

Các kết quả mô hình phân loại (LDA) được đặc trưng bởi một phương trình toán học biểu diễn mối liên hệ giữa kết quả và các biến phụ thuộc:

p p o

f ( )   1 1 2 2    (2.1) Trong đó, a0 là một hằng số, a1 đến ap là các trọng số của các phương trình

bậc một/hồi quy, xi và xj là các biến độc lập thứ i và thứ j Biến phụ thuộc nhận các giá trị liên tục mà dựa vào đó các giá trị xác suất hậu nghiệm được

ghi nhận Các thông số thống kê (Wilks’ λ, F, Mahalanobis distance D2

ra của kiểm tra, nút lá biểu diễn nhãn lớp hoặc sự phân bố của lớp (Hình 2.1)