Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunatpoly (acid lacticcoglycolic) bao polyethylen glycol

Ảnh hưởng của tỷ lệ PEG 2000/PLGA đến đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG bào chế bằng phương pháp phối hợp 1.... Sự thay đổi đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG bào chế bằng p

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO

ARTESUNAT- POLY (ACID LACTIC-CO-GLYCOLIC)

BAO POLYETHYLEN GLYCOL

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO

ARTESUNAT- POLY (ACID LACTIC-CO-GLYCOLIC)

BAO POLYETHYLEN GLYCOL

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến:

PGS TS Nguyễn Ngọc Chiến ThS NCS Hồ Hoàng Nhân

Người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa lý, Bộ môn Bào chế, Bộ môn Công nghiệp Dược, cùng toàn thể các cán bộ công nhân viên Viện công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn này

Nhân dịp này, tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các cán bộ, giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội – Những người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, dìu dắt, giúp tôi có những hành trang vũng chắc trong suốt chặng đường học tập dưới mái trường này

Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới cha mẹ, người thân, bạn bè vì đã luôn động viên, khuyến khích, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn này

Hà Nội, tháng 03 năm 2016

Học viên

Hoàng Thị Hương

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về artesunat 2

1.1.1 Công thức 2

1.1.2 Tính chất 2

1.1.3 Định tính 2

1.1.4 Định lượng 3

1.1.5 Dược động học 3

1.1.6 Tác dụng dược lý 4

1.2 Tổng quan về nano polyme 4

1.2.1 Đặc điểm 4

1.2.2 Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme 5

1.2.3 Đặc điểm phân bố tiểu phân nano dùng tiêm tĩnh mạch 7

1.2.4 Một số phương pháp thu hồi tiểu phân nano polyme 8

1.2.5 Vài nét về chất mang PLGA 10

1.2.6 Vài nét về chất mang PEG 11

1.3 Một số nghiên cứu về artesunat và hệ nano 13

1.3.1 Về tác dụng chống ung thư của artesunat 13

1.3.2 Về hệ nano 13

1.3.3 Về bào chế nano polyme sử dụng PLGA và PEG 17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 21

2.1.1 Nguyên vật liệu 21

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 22

2.2.1 Xây dựng công thức bào chế hệ nano ART-PLGA-PEG 22

2.2.2 Đánh giá đặc tính các tiểu phân nano ART-PLGA-PEG 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Phương pháp bào chế tiểu phân nano artesunat 23

2.3.2 Phương pháp đánh giá đặc tính tiểu phân nano artesunat 25

2.3.3 Phương pháp thiết kế thí nghiệm và xử lý số liệu 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 Kết quả thẩm định một số chỉ tiêu phương pháp định lượng ART bằng HPLC 33 3.1.1 Độ đặc hiệu 33

3.1.2 Độ tuyến tính 33

3.1.3 Độ ổn định hệ thống 34

3.2 Bào chế tiểu phân nano ART theo phương pháp bao hệ ART-PLGA bằng PEG34 3.2.1 Phương pháp phối hợp 1 34

3.2.2 Phương pháp phối hợp 2 37

3.2.3 Phương pháp phối hợp 3 38

3.2.4 Xác định sự có mặt của PEG 38

3.3 Bào chế tiểu phân nano ART theo phương pháp sử dụng PLGA-PEG 39

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế đến đặc tính tiểu phân nano ART-PLGA-PEG 39

3.3.2 Thiết kế thí nghiệm và xây dựng công thức bào chế tối ưu 45

3.3.3 Đánh giá một số đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG 51

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 58

4.1 Về bào chế tiểu phân nano ART theo phương pháp bao hệ ART-PLGA bằng

PEG 58

4.2 Về bào chế tiểu phân nano ART theo phương pháp sử dụng PLGA-PEG 61

4.2.1 Về ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG 62

4.2.2 Về ảnh hưởng của tỷ lệ DC/polyme 63

4.2.3 Về ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80 63

4.2.4 Về ảnh hưởng của tỷ lệ pha hữu cơ/nước 64

4.2.5 Về việc lựa chọn công thức tối ưu 65

4.3 Về độ ổn định tiểu phân nano ART-PLGA-PEG trong thử nghiệm đông đá-rã đông 66

4.4 Về khả năng giải phóng dược chất in vitro 67

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

(phổ hồng ngoại biến đổi)

1

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

XPS

CT

X-Ray Photoelectron Spectroscopy (Phổ huỳnh quang tia X) Công thức

DANH M ỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 2.1 Danh mục nguyên vật liệu, hóa chất sử dụng 21

Bảng 2.2 Thành phần của các mẫu thử 27

Bảng 2.3 Thành phần của các mẫu trắng tá dược 27

Bảng 3.1 Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ART 33

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống 34

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ PEG 2000/PLGA đến đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG bào chế bằng phương pháp phối hợp 1 35

Bảng 3.4 Sự thay đổi đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG bào chế bằng phương pháp phối hợp 1 khi sử dụng PEG 2000 35

Bảng 3.5 Sự thay đổi đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG bào chế bằng phương pháp phối hợp 1 khi sử dụng PEG 4000 36

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thời gian phối hợp đến đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG bào chế bằng phương pháp phối hợp 1 36

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ PEG/PLGA đến đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG bào chế bằng phương pháp phối hợp 2 37

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ PEG 2000/PLGA đến đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG bào chế bằng phương pháp phối hợp 3 38

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG đến đặc tính lý hóa của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG 40

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất/polyme đến đặc tính lý hóa của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG 42

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80 đến đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG 43

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha hữu cơ/nước đến đặc tính lý hóa của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG 44

Bảng 3.13 Ký hiệu và các mức của các biến độc lập 45

Bảng 3.14 Ký hiệu của các biến phụ thuộc và điều kiện tối ưu hóa 45

Bảng 3.15 Các công thức thực nghiệm 46

Bảng 3.16 Kết quả đánh giá các đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG 47

Bảng 3.17 Kết quả tối ưu hóa bằng phần mềm MODDE 8.0 51Bảng 3.18 Một số đặc tính tiểu phân nano bào chế theo công thức tối ưu 51Bảng 3.19 Độ ổn định của KTTP nano ART-PLGA-PEG trong các điều kiện ly tâm khác nhau 53Bảng 3.20 Phần trăm giải phóng tích lũy của ART theo thời gian từ hệ tiểu phân nano ART-PLGA-PEG và hệ ART-PLGA 55Bảng 3.21 Kết quả khớp mô hình và giá trị AIC của các mô hình 57

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của artesunat 2

Hình 1.2 Sự khác nhau giữa siêu vi cầu và siêu vi nang 4

Hình 1.3 Kỹ thuật nhũ hóa và bốc hơi dung môi 6

Hình 1.4 Kỹ thuật nhũ hóa và khuếch tán dung môi 6

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học và sự thủy phân của PLGA 10

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của PEG 11

Hình 1.7 Tiểu phân nano PLGA được bao PEG 12

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART-PLGA-PEG sử dụng phương pháp bao hệ ART-PLGA bằng PEG 24

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART-PEG sử dụng PLGA-PEG 25

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ART 33

Hình 3.2 Phản ứng tạo màu của chất chỉ thị với PLGA và ART (A), với nano bao PEG và nano sử dụng hệ PLGA-PEG trước khi rửa loại Tween 80 (B) và sau khi rửa loại Tween 80 (C) 39

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG đến đặc tính lý hóa của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG 41

Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất/polyme đến đặc tính lý hóa của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG 42

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80 đến đặc tính lý hóa của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG 43

Hình 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha hữu cơ/nước đến đặc tính lý hóa của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG 44

Hình 3.7 Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của nồng độ Tween 80 và tỷ lệ HC/nước đến KTTP nano ART-PLGA-PEG 48

Hình 3.8 Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của nồng độ Tween 80 và tỷ lệ PLGA-PEG đến PDI nano ART-PLGA-PEG 49

Hình 3.9 Mặt đáp thể hiện ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG và tỷ lệ HC/nước đến KTTP nano ART-PLGA-PEG 49

Hình 3.10 Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG và tỷ lệ DC/polyme tới khả năng nạp thuốc của nano ART-PLGA-PEG 50Hình 3.11 Hình ảnh chụp SEM của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG 52Hình 3.12 Ảnh hưởng của các tá dược bảo vệ đến độ ổn định KTTP nano trong thử nghiệm đông đá-rã đông 54Hình 3.13 Đồ thị thể hiện phần trăm giải phóng tích lũy ART từ hệ tiểu phân nano ART-PLGA-PEG và hệ ART-PLGA 56Hình 4.1 Cấu trúc hóa học của copolyme PLGA-PEG 62

ĐẶT VẤN ĐỀ

Artesunat (ART) cũng như các dẫn chất khác của artemisinin được sử dụng

phổ biến trong điều trị bệnh sốt rét, đặc biệt là sốt rét thể não do Plasmodium

falciparum Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy ART có tác dụng chống ung thư trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau như bạch cầu, đại tràng, ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt,… [26], [33], [46] Nhằm làm tăng sinh khả dụng

và tác dụng chống ung thư, công nghệ nano với việc sử dụng các chất mang polyme

đã và đang được nghiên cứu [18], [19], [23],…

Một trong những polyme phân hủy sinh học hiệu quả nhất là poly (acid lactic-co-glycolic) (PLGA) do có khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với nhiều mô và tế bào [44], [47] Tuy nhiên nano polyme PLGA vẫn có hạn chế như khả năng bị bắt giữ bởi hệ thống thực bào của cơ thể, tương tác không đặc hiệu với protein và tế bào [44], [47], [58] Do

đó, polyethylen glycol (PEG) là một polyme thân nước được sử dụng để làm thay đổi đặc tính bề mặt của tiểu phân nano PLGA Chuỗi PEG đóng vai trò như một đám mây thân nước, làm giảm sự hoạt hóa bổ thể, giảm sự tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào, do đó giúp kéo dài thời gian tuần hoàn của hệ nano, tạo cơ hội phân phối thuốc đến các khối u đích và điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất [23], [27], [36], [43],…

Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat-poly (acid

lactic-co-glycolic) bao polyethylen glycol” được thực hiện với các mục tiêu như sau:

1 Xây dựng được công thức bào chế tiểu phân nano artesunat-poly (acid lactic-co-glycolic) bao polyethylen glycol

2 Đánh giá được một số đặc tính lý hóa tiểu phân nano artesunat-poly (acid lactic-co-glycolic) bao polyethylen glycol

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về artesunat

Khối lượng phân tử: 384,4 g/mol [5], [64]

1.1.2 Tính chất

Bột kết tinh trắng, mịn Rất khó tan trong nước (khoảng 52,6 mg/L ở 25°C),

dễ tan trong dicloromethan, rất dễ tan trong aceton và ethanol 96% [5], [64] Artesunat rất dễ bị thủy phân do có nhóm chức lacton và ester (muối natri của ester hemisuccinat của artemisinin) Tốc độ thủy phân phụ thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm và mức độ kiềm Do có nhóm carboxylic trong phân tử nên artesunat có tính acid yếu với pKa ~ 4,35 [5], [64]

1.1.3 Định tính

- Phương pháp đo quang: phổ hồng ngoại [5]

- Phương pháp tạo màu [5]

- Phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao [5], [65]

H3C

CH3

CH3

1.1.4 Định lượng

1.1.4.1 Phương pháp đo quang

Tiến hành thủy phân trong môi trường kiềm rồi đo độ hấp thụ của dung dịch thu được trong vòng 20 phút ở bước sóng 289 ± 1 nm trong cốc đo dày 1 cm, mẫu trắng là dung dịch natri hydroxyd 0,1 N [5]

• Dung dịch chuẩn: 4,0 mg/mL USP Artesunat RS trong Acetonitril

• Dung dịch thử: 4,0 mg/mL chất thử pha trong acetonitril

1.1.5 Dược động học

Sau khi sử dụng artesunat (ART) bị thủy phân nhanh chóng thành chất chuyển hóa có hoạt tính là dihydroartemisinin (DHA) Vì vậy, nồng độ ART trong máu rất thấp Thời gian bán thải khi tiêm tĩnh mạch của ART là khoảng 2,3 đến 4,3 phút, của DHA là 40 đến 64 phút [60]

Dữ liệu dược động học nồng độ trong huyết tương ở dạng không liên kết của artesunat hoặc dihydroartemisinin cần được diễn giải một cách thận trọng vì thuốc

tích tụ chọn lọc trong ký sinh trùng (KST) Trong thí nghiệm in vitro, sự tích tụ của

dihydroartemisinin trong hồng cầu nhiễm KST sốt rét cao hơn 300 lần so với nồng

độ trong huyết tương [64]

1.1.6 Tác dụng dược lý

ART có hoạt tính diệt ký sinh trùng sốt rét gấp 5 lần artemisinin ART không

có tác dụng diệt giao bào và không có tác dụng lên giai đoạn ngoại hồng cầu, hơn nữa thời gian tác dụng ngắn nên không dùng làm thuốc dự phòng và không dùng chống tái phát [6]

1.2 Tổng quan về nano polyme

1.2.1 Đặc điểm

Các tiểu phân nano polyme (PNPs) được bào chế từ các polyme tương thích hoặc phân hủy sinh học có kích thước từ 1-1000 nm nơi thuốc được hòa tan, bẫy, đóng gói hoặc kèm với một cốt của tiểu phân nano Tùy theo phương pháp bào chế

mà thu được siêu vi cầu (nanospheres) hoặc siêu vi nang (nanocapsules) Siêu vi nang có cấu trúc nhân vỏ như vi nang, còn siêu vi cầu có cấu trúc cốt (matrix) đồng nhất như vi cầu [11], [51]

Hình 1.2 Sự khác nhau giữa siêu vi cầu và siêu vi nang

Tiểu phân polyme mang thuốc có đặc điểm chung là dùng polyme làm giá mang dược chất với mục đích che chở, bảo vệ dược chất, kéo dài tác dụng của dược chất và hướng dược chất tới đích tác dụng

Theo cơ chế mang dược chất có thể chia làm 3 nhóm [11]:

- Hệ cốt: tiểu phân nano được phân tán trong giá mang polyme: siêu vi cầu, tiểu phân lipid rắn

- Hệ màng bao: polyme bao ngoài tiểu phân nano dược chất: siêu vi nang, liposome, micell, dendrime, ống carbon,…

- Hệ liên kết: polyme gắn trực tiếp với phân tử dược chất qua các cầu liên kết

hóa học

1.2.2 Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme

Các phương pháp bào chế PNPs hay được sử dụng có thể chia ra 3 nhóm [11], [51], [67]:

- Phương pháp phân tán trong polyme được hình thành từ trước: là một kỹ thuật phổ biến được sử dụng để bào chế các hệ nano sử dụng polyme phân hủy sinh học như poly (acid lactic ) (PLA), poly (D, L-acid glycolic) (PLG), poly (D, L-acid lactic-co-glycolic) (PLGA) và poly (cyanoacrylat) (PCA) Nhóm này bao gồm các phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi, nhũ hóa và khuếch tán dung môi, hóa muối, thẩm tách, sử dụng dung môi siêu tới hạn

bề mặt

- Phương pháp gel ion hóa hay keo tụ

Sau đây là một số phương pháp thường được sử dụng:

1.2.2.1 Nhũ hóa và bốc hơi dung môi

Nguyên tắc: tạo ra vi nhũ tương (thường là dầu/nước), sau đó bốc hơi dung môi hữu cơ tạo vi tiểu phân Polyme hay dùng loại tan trong dung môi hữu cơ như PLA, PLGA, Eudragit,…Hòa tan chất mang và dược chất vào dung môi hữu cơ (hay dùng methylen clorid, cyclohexan…) rồi nhũ hóa vào pha nước đã có chất nhũ hóa (PVA (polyvinyl alcol), Tween, Poloxamer…) Tiến hành đồng nhất hóa rồi bốc hơi dung môi hữu cơ, lọc và rửa vi tiểu phân [11], [51] Một số yếu tố ảnh hưởng tới đặc tính tiểu phân nano tạo thành là cường độ và thời gian đồng nhất hóa, loại và lượng chất nhũ hóa, tỷ lệ polyme, dược chất và cách bốc hơi dung môi [11]

Hình 1.3 Kỹ thuật nhũ hóa và bốc hơi dung môi

1.2.2.2 Nhũ hóa và khuếch tán dung môi

Nguyên tắc: nhũ hóa pha hữu cơ (gồm polyme, dược chất, dung môi hữu cơ) vào một dung dịch chất ổn định được bão hòa trước đó Dung môi sẽ khuếch tán từ pha dầu vào pha ngoại hình thành các tiểu phân nano polyme Để kết tụ polyme và tạo thành các tiểu phân nano cần thiết phải sử dụng pha pha loãng để thúc đẩy sự khuếch tán của dung môi pha phân tán Các dung môi được bốc hơi hoặc lọc

Kỹ thuật này có ưu điểm như hiệu suất bao gói cao (thường lớn hơn 70%), không cần phải đồng nhất, độ tái lặp giữa các lô cao, dễ mở rộng quy mô, đơn giản, phân bố kích thước tiểu phân hẹp Nhược điểm là thể tích lớn nước được loại bỏ khỏi hỗn dịch và sự thẩm thấu nước hòa tan dược chất vào pha ngoại bão hòa nước trong suốt quá trình nhũ tương hóa làm giảm hiệu suất bao gói dược chất [51]

Hình 1.4 Kỹ thuật nhũ hóa và khuếch tán dung môi

1.2.2.3 Sử dụng dung môi siêu tới hạn

Nguyên tắc: hòa tan dược chất trong dung môi siêu tới hạn (hay dùng CO2) ở

áp suất cao trong bình khí nén, sau đó xả CO2 để giảm áp suất đột ngột, dược chất

sẽ bị kết tủa lại dưới dạng siêu mịn hoặc hòa tan dược chất vào dung môi rồi bơm vào thùng chứa cùng với CO2 siêu tới hạn, dung môi chuyển sang CO2 làm kết tủa

dược chất, sau đó giảm áp suất để thu sản phẩm [11], [54]

Phương pháp này có nhiều ưu điểm như không độc, giá thành rẻ, các thông

số tới hạn của CO2 không quá cao (nhiệt độ tới hạn là 31,3°C, áp suất tới hạn là 73,7 bar)

1.2.2.4 Phương pháp gel ion hóa hay keo tụ

Các tiểu phân nano polyme được bào chế bằng cách sử dụng các polyme phân hủy sinh học ưa nước như là chitosan, gelatin, natri alginat Phương pháp này liên quan đến một hỗn hợp của hai pha nước, trong đó có một pha là polyme chitosan, một đồng polyme di-block của polyethylen oxid hoặc polypropylen oxid (PEO-PPO) Pha còn lại là một poly anion natri tripolyphosphat Nhóm amin của chitosan tích điện dương tương tác với tripolyphosphat tích điện âm để tạo thành keo tụ với kích thước nano Keo tụ được hình thành do kết quả tương tác tĩnh điện giữa 2 pha nước, ở đó nguyên liệu chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái gel [51]

1.2.3 Đặc điểm phân bố tiểu phân nano dùng tiêm tĩnh mạch

Sau khi tiêm tĩnh mạch, sự phân bố của tiểu phân nano có thể xảy ra theo 2 hướng [11]:

1.2.3.1 Thanh thải bằng thực bào

Hệ thống thực bào trong cơ thể coi tiểu phân như một vật thể lạ và tiến hành thanh thải theo cơ chế bảo vệ của cơ thể Các tiểu phân có kích thước nhỏ hơn 500

nm dễ bị thanh thải hơn cả Sau khi thực bào, tiểu phân được đưa về gan, lách…

Như vậy có thể lợi dụng cơ chế thực bào để chủ động đưa thuốc tới gan, lách, phổi…và tăng cường ái lực với receptor trên thực bào đơn nhân bằng các ligand có

ái lực Mặt khác, tổ chức u, viêm là những nơi có quá trình thực bào xảy ra mạnh nhất, trở thành cơ quan đích của tiểu phân

Để tránh thực bào, tăng cường phân bố đến các tổ chức cần phải:

- Ngụy trang tiểu phân nhằm tránh sự nhận diện của tế bào lympho: bao tiểu phân với các polyme thân nước như PEG, khi đó PEG liên kết đồng hóa trị với các tiểu phân thân nước như nano albumin, nano PLGA… kéo dài thời gian bán thải

- Biến tính bề mặt tiểu phân để ngăn cản quá trình thực bào: tạo ra cấu trúc cồng kềnh hoặc bao chất diện hoạt

- Bao tiểu phân bằng các tác nhân phân giải màng lysosome

1.2.3.2 Phân bố đến cơ quan, tổ chức

Các tiểu phân không bị thực bào dễ dàng đi qua thành mạch mao quản để phân bố tiếp đến các cơ quan, tổ chức trong cơ thể đặc biệt là các tổ chức u, viêm do tính thấm tăng lên Các tiểu phân nhỏ hơn 250 nm (một số nghiên cứu cho là 200 nm) dễ qua thành mạch, tránh được thực bào [48], [70]

Sau khi qua thành mạch, tùy theo cấu trúc và kích thước, hệ nano được phân

bố ở 3 mức độ khác nhau:

- Tới cơ quan đích: gan, lách, phổi…

- Tới nhóm tế bào đặc biệt (viêm, ung thư, đại thực bào…)

- Tới nội bào: Do có kích thước ở mức độ phân tử, nhỏ hơn khe hở liên bào và nhiều liên kết lỏng lẻo trên màng tế bào nên hệ nano có khả năng xuyên qua màng

tế bào vào nội bào Nếu kích thước lớn hơn, hệ được vận chuyển bằng cơ chế thực bào hoặc tương hợp với màng tế bào (liposome)

1.2.4 Một số phương pháp thu hồi tiểu phân nano polyme

Việc bảo quản tiểu phân nano dưới dạng hỗn dịch gặp nhiều khó khăn như:

- Thể tích nước lớn, hàm lượng dược chất trong một đơn vị thể tích thấp

- Polyme có thể bị phân hủy trong quá trình bảo quản

- Các tiểu phân nano có thể bị kết tụ, sa lắng

- Dược chất bị mất dần hoạt tính

- Dễ nhiễm vi sinh vật

Để thu hồi tiểu phân nano polyme có 2 phương pháp được sử dụng là phương pháp đông khô và phun sấy [7], [67]

1.2.4.1 Đông khô

Đông khô là một quá trình làm khô dung dịch nước đã được đông lạnh ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ eutectic của dung dịch, dung môi được loại trực tiếp từ pha rắn, không qua pha lỏng dưới áp suất giảm (thường dưới 100 μm Hg), cho ra sản phẩm khô

Kỹ thuật đông khô có nhiều ưu điểm:

- Hạn chế tốc độ phản ứng hóa học phân hủy dược chất vì quá trình đông khô được tiến hành ở nhiệt độ thấp

- Sản phẩm khô thu được có diện tích bề mặt riêng lớn nên sẽ hòa tan rất nhanh khi cần hòa tan trở lại

- Dễ đạt yêu cầu đồng nhất về hàm lượng, giảm thiểu sự nhiễm chéo

- Giảm thiểu sự oxy hóa dược chất

Tuy vậy, kỹ thuật đông khô cũng có những hạn chế như có thể gây ra mất ổn định và thay đổi các đặc tính hệ nano

Nguyên tắc chung của quá trình đông khô được thực hiện qua các bước:

- Khi sản phẩm đã đông rắn hoàn toàn, tiến hành hút chân không để giảm áp suất hơi ở buồng đông khô xuống dưới áp suất hơi của nước đá và cung cấp nhiệt cho giá để tạo năng lượng cần thiết cho quá trình thăng hoa (giai đoạn làm khô sơ cấp) Dưới những điều kiện đó nước sẽ bay hơi trực tiếp từ trạng thái rắn tạo ra bánh thuốc khô, xốp Khi đó phần lớn dung môi được loại đi

- Tiếp tục cung cấp nhiệt để làm khô bánh thuốc đến độ ẩm xác định (giai đoạn làm khô thứ cấp)

1.2.4.2 Phun sấy

Nguyên tắc chung là dưới áp lực cao của vòi phun sẽ chuyển dung dịch thành dạng khí dung, dòng khí dung này được tiếp xúc trực tiếp với luồng không khí nóng thổi cùng chiều, dung môi từ các giọt khí dung sẽ bay hơi rất nhanh do có diện tích tiếp xúc lớn và để lại bột thuốc khô

So với đông khô, phun sấy có ưu điểm như thao tác nhanh, chi phí thấp hơn, phù hợp với quy mô công nghiệp, bột phun sấy có thể dùng dưới dạng hỗn dịch hoặc đưa vào viên nén, viên nang

Nhược điểm của phun sấy là cần gia nhiệt, có thể tác động lên tính toàn vẹn của tiểu phân nano polyme và dược chất, hiệu suất thu hồi sản phẩm thấp Ngoài ra,

để đảm bảo vô khuẩn cho bột đông khô sau phun sấy là khó khăn vì cần lọc loại khuẩn một lượng không khí lớn và đảm bảo yêu cầu vô khuẩn cho toàn bộ thiết bị phun sấy cũng như khối bột sau phun là không hề đơn giản

1.2.5 Vài nét về chất mang PLGA

1.2.5.1 Cấu trúc

Poly (acid lactic-co-glycolic ) (PLGA) là một copolyme được tổng hợp bằng phương pháp đồng polyme hóa mở vòng ngẫu nhiên của 2 monome khác nhau, dime vòng (1,4-dioxan-2,5-dion) của acid glycolic và acid lactic Các PLGA khác

75:25 chứa 75% acid lactic và 25% acid glycolic [44], [47]

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học và sự thủy phân của PLGA

1.2.5.2 Tính chất, ứng dụng

PLGA là một trong những polyme phân hủy sinh học hiệu quả nhất do có khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với nhiều mô và tế bào, ngoài ra nano PLGA đang được nghiên cứu ứng dụng trong liệu pháp chẩn đoán hình ảnh và trong điều trị ung thư PLGA phân hủy sinh học bằng thủy phân liên kết ester tạo thành acid lactic và acid glycolic Cả hai được chuyển hóa qua chu trình Krebs thành CO2 và nước rồi đào thải ra ngoài nên độc tính thấp [44], [47]

Trong PLGA thì phần PLA (poly acid lactic) có cấu trúc kỵ nước hơn PGA (poly acid glycolic) Do đó, nếu PLGA có tỷ lệ PLA cao hơn thì ít thân nước hơn và thủy phân chậm hơn Điều này ảnh hưởng đến sự giải phóng dược chất Ngoài ra, sự phân hủy sinh học của PLGA còn chịu ảnh hưởng của các yếu tố như trạng thái kết tinh, hình dạng bề mặt và kích thước, pH, khối lượng phân tử trung bình, hàm lượng dược chất, loại dược chất [44]

1.2.5.3 Một số hạn chế khi sử dụng PLGA

Khi sử dụng PLGA làm chất mang sự giải phóng dược chất trải qua hai giai đoạn, trong đó giai đoạn đầu có sự giải phóng “bùng nổ, ồ ạt” do xảy ra quá trình hòa tan và ăn mòn ở bề mặt [44], [53] Mặt khác các tiểu phân nano PLGA dễ bị bắt giữ bởi hệ thống thực bào và tương tác không đặc hiệu với protein và tế bào làm giảm hiệu quả điều trị và tăng tác dụng phụ [44], [47], [58] Do đó, nhiều nghiên cứu nhằm thay đổi các đặc tính lý hóa bề mặt của tiểu phân nano PLGA đã được

thực hiện như bao tiểu phân với polyme thân nước (PEG, chitosan) để kéo dài thời gian tuần hoàn do tiểu phân thân nước có khả năng tuần hoàn trong máu lâu hơn và

bị tích lũy ở gan ở mức độ tối thiểu [23], [27], [36], [43], [44], [55], [58], [70]

1.2.6 Vài nét về chất mang PEG

1.2.6.1 Cấu trúc, tính chất

Polyethylen glycol (PEG) còn có tên gọi khác là Macrogols có công thức như sau

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của PEG

Các PEG khác nhau về KLPT và có nhiều tính chất lý hóa như tỷ trọng, độ nhớt, pH, thể chất, điểm đông đặc, điểm nóng chảy khác nhau PEG 200-600 thường thể lỏng, PEG có KLPT lớn hơn 1000 thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường Tất cả các PEG đều tan trong nước và có thể trộn lẫn theo bất kỳ tỷ lệ nào với các PEG khác (nếu cần thiết sau tan chảy) Dung dịch nước của các PEG có KLPT lớn

có thể ở dạng gel Các PEG dạng lỏng tan trong aceton, alcol, benzen, glycerin Các PEG rắn tan trong aceton, dicloromethan, ethanol 95%, methanol [56]

ở phía bên kia; dẫn xuất PEG có nhánh hình Y; dẫn xuất PEG có nhiều cánh tay; dẫn xuất PEG ba nhánh Các dẫn xuất PEG được liên hợp với các ligand có nhóm amin, thiol hoặc carboxyl [58] PEG thân nước định hướng phía pha nước ngoại của micell tạo lớp áo bao xung quanh tiểu phân có tác dụng như một rào cản làm giảm tương tác với các phân tử khác nên làm tăng độ ổn định [44]

1.3 Một số nghiên cứu về artesunat và hệ nano

1.3.1 V ề tác dụng chống ung thư của artesunat

Bên cạnh tác dụng chống sốt rét, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy ART có tác dụng chống ung thư trên nhiều dòng tế bào ung thư khác như như bạch cầu, đại tràng, ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư tuyến tiền liệt, u não, ung

thư tế bào thận Cơ chế chống ung thư có thể do ART ức chế sự tăng sinh, sự di căn,

sự hình thành thành mạch ung thư dẫn đến giảm khối lượng và sự tiến triển của ung

thư [26], [33], [46]

Năm 2001, Efferth T và cộng sự đã chứng minh tác dụng chống ung thư của ART trên 55 dòng tế bào ung thư ở người Kết quả cho thấy ART có tác dụng mạnh nhất với dòng tế bào ung thư bạch cầu và đại tràng GI50 (growth inhibition cells – nồng độ ức chế sự phát triển của 50% các tế bào) là 1,11 ± 0,56 µM và 2,13 ± 0,74

µM tương ứng Giá trị GI50 cao nhất (25,62 ± 14,95 µM) ở dòng tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ cho thấy sự kém nhạy cảm nhất với ART Giá trị GI50 trung bình có được ở các dòng tế bào ung thư hắc tố da, ung thư vú, buồng trứng, tuyến tiền liệt, hệ thần kinh trung ương và thận So sánh với một số thuốc khác đang dùng

để điều trị ung thư cho thấy ART có hiệu quả cao và độc tính thấp hơn như carboplatin, cisplatin, cyclophosphamid… [33]

1.3.2 Về hệ nano

Về bào chế các dạng nano, Trương Công Trị, Khưu Mỹ Lệ, Nguyễn Minh Đức (năm 2011) đã tiến hành nghiên cứu bào chế tiểu phân nano của rutin bằng phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi Kết quả đánh giá KTTP trong khoảng 66,3-339,3 nm, lượng hoạt chất được nhũ hóa chiếm 1,3% so với tổng lượng lipid [13]

Năm 2011, Dương Thị Ánh Tuyết và cộng sự đã nghiên cứu chế tạo vật liệu nano chitosan làm chất hấp phụ protein ứng dụng trong dẫn truyền thuốc Các yếu

tố ảnh hưởng được đánh giá như các tác nhân tạo nối ngang, tỷ lệ chitosan/tripolyphosphat, pH Khả năng hấp phụ protein và hiệu suất của nano chitosan chế tạo được là 1,93 mg/mg và 96,41% tại 0,5 mg hạt nano chitosan [14]

Trong ngành Dược, các nghiên cứu về hệ nano đã đạt được một số thành tựu nhất định Nguyễn Thị Mai Anh và Nguyễn Văn Long (từ năm 2009 đến năm 2014)

đã có những nghiên cứu về hệ nano chứa piroxicam Trong công trình, nhóm tác giả

đã tiến hành bào chế piroxicam nano tinh thể và piroxicam nano polyme với kích

thước trung bình lần lượt là 277,6 ± 10,2 nm và 347,2 nm ± 17,7 nm Ngoài ra, công thức và quy trình bào chế hỗn dịch nano chứa piroxicam 0,5% dùng cho nhãn khoa cũng đã được nhóm tác giả nghiên cứu Hệ nano piroxicam được chế tạo bằng

phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi, sau đó đánh giá một số đặc tính lý hóa Hỗn dịch nano được đông khô Các tác giả đã khảo sát ảnh hưởng của các thành phần trong môi trường phân tán đến độ ổn định cấu trúc hóa lý của hỗn dịch dựa vào tốc độ sa lắng và hiện tượng kết tụ tiểu phân Hỗn dịch sau khi pha chế từ bột đông khô ổn định trong 1 tháng ở điều kiện thực Hỗn dịch này đã được đánh giá sinh khả dụng trên mắt thỏ chứng tỏ có khả năng kéo dài thời gian lưu thuốc trước giác mạc và tăng tính thấm của piroxicam nên cải thiện đáng kể sinh khả dụng của chế phẩm [1], [2], [3], [4]

Phạm Văn Giang và cộng sự (2013) đã nghiên cứu bào chế tiểu phân nano curcumin bằng phương pháp nghiền bi kết hợp với đồng nhất hóa tốc độ cao Các yếu tố thuộc về công thức và quy trình bào chế được xem xét như loại và nồng độ chất diện hoạt, nồng độ chất ổn định, tốc độ đồng nhất hóa, thao tác nghiền,…Kết quả nghiên cứu lựa chọn được công thức với tỷ lệ Tween 80 chiếm 10% so với dược chất, thời gian nghiền 10 phút, tần số 15 Hz, đồng nhất hóa tốc độ 18000 vòng/phút trong 15 phút [9]

Nhằm làm tăng sinh khả dụng và tác dụng chống sốt rét cũng như hướng mục tiêu điều trị ung thư, hệ nano của artemisinin và dẫn chất trong đó có artesunat được nhiều nhà khoa học nghiên cứu

Trần Đại Lâm và cộng sự (2006) đã nghiên cứu sử dụng chất mang chitosan trong bào chế hệ nano ART Đánh giá các đặc tính vật lý như bề mặt, kích thước,

cấu trúc cũng như khả năng giải phóng in vitro cho thấy kích thước trung bình của

hệ nano vào khoảng 200-300 nm và có cấu trúc tương đối cầu nhẵn Đồng thời hệ

nano với vỏ bao chitosan có khả năng kiểm soát giải phóng dược chất do vậy giúp kéo dài tác dụng của thuốc trong cơ thể [12]

Năm 2010, Nguyễn Thị Hằng đã tiến hành bào chế và đánh giá các đặc tính

lý hóa của tiểu phân nanocapsules artemisinin Phương pháp bào chế được sử dụng

là phương pháp bao đa điện tích, thực hiện theo 3 cách khác nhau, sau đó tiến hành đánh giá hình thái và KTTP, định lượng ART, từ đó lựa chọn phương pháp bào chế phù hợp Tối ưu hóa công thức bằng cách thay đổi tỷ lệ dược chất, tỷ lệ natri alginat, tỷ lệ gelatin Kết quả cho KTTP phân bố hẹp 10-100 nm, hàm lượng dược chất 82%, phần lớn các hạt nano hình cầu, bề mặt nhẵn, tuy nhiên chưa đồng đều,

có ít đám polyme kết dính, cấu trúc 1 lớp hoặc 2 lớp [10]

Chadha và cộng sự (năm 2012) đã tiến hành bào chế, đánh giá các đặc tính lý

hóa và nghiên cứu dược động học in vivo của tiểu phân nano lecithin/chitosan chứa

artesunat Các tiểu phân nano được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi Ngoài ra, tiểu phân nano chứa hệ phân tán rắn của ART với β-cyclodextrin (β-CD) cũng được bào chế Kích thước tiểu phân (KTTP) dưới 300

nm, phức hợp ART và β-CD không làm ảnh hưởng tới phân bố KTTP Phân bố KTTP (PDI) là 0,5-0,75 đối với tiểu phân nano lecithin/chitosan chứa ART và tiểu phân nano lecithin/chitosan chứa phức hợp ART và β-CD Hiệu suất mang thuốc tăng lên cùng với sự tăng lượng dược chất Công thức chứa 100 mg ART có KTTP

nhỏ nhất và hiệu suất mang thuốc lớn nhất Phần trăm giải phóng dược chất in vitro của hệ nano có chứa β-CD cao hơn hệ không chứa Trong thử nghiệm in vivo, tỷ lệ sống sót của chuột bị nhiễm Plasmodium berghi tăng lên đáng kể giữa nhóm thử (hệ

nano ART) và nhóm chuẩn (ART thông thường) lần lượt là 100% (hệ nano chứa CD), 83,3% (hệ nano không có β-CD), 16,7% (ART thường) [22]

β-Meng H và cộng sự (năm 2014) đã tiến hành bào chế và đánh giá độc tính tiểu phân nano dạng tiền thuốc ART với chất mang PEG được methyl hóa (mPEG) Phức hợp ART-mPEG được hình thành thông qua liên kết ester giữa ART và

của nó Nồng độ micell tới hạn được xác định bằng huỳnh quang Kết quả cho thấy KTTP phân bố hẹp với KTTP trung bình 88,7 nm, với kích thước này tiểu phân có

thể qua các khe hở mạch dẫn vào tế bào ung thư Thế zeta -12,4 mV giúp kéo dài thời gian tuần hoàn ART được giải phóng từ tiền thuốc nhờ thủy phân liên kết

ester Đánh giá in vitro cho thấy độc tính tiểu phân nano mPEG-ART trên dòng tế

bào L1210 và MCF giảm so với ART tự do [45]

Với mục đích sử dụng chất mang PLGA bào chế hệ nano chứa ART có tác

dụng chống ung thư in vitro trên một số dòng tế bào ung thư người, Nguyễn Hạnh

Thủy, Nguyễn Ngọc Chiến và cộng sự (năm 2014) đã sử dụng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương dầu/nước Polyme và ART được hòa tan trong 5 mL dicloromethan (DCM), sau đó nhỏ vào pha nước có chứa chất nhũ hóa Nhũ tương dầu/nước được đồng nhất sử dụng đầu siêu âm ở 100W trong 5 phút rồi khuấy từ trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng để loại dung môi, ly tâm, rửa với nước để loại chất nhũ hóa, sau đó đông khô thu sản phẩm Kết quả cho KTTP nano khoảng 170 nm, hiệu suất mang thuốc 83,40%, thời gian giải phóng có thể kéo dài đến 48 giờ Tiểu phân nano ART-PLGA có khả năng ức chế tốt hơn dạng ART tự do ở tất cả các dòng tế bào ung thư [53]

Tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu trên, Hồ Hoàng Nhân và cộng sự (năm 2015) đã tiến hành tối ưu hóa công thức và đánh giá các đặc điểm của tiểu phân

được thêm vào dung dịch CS trong acid acetic 1% (tt/tt), trong điều kiện có khuấy

từ Tiến hành tối ưu hóa với các biến đầu vào là tỷ lệ CS/PLGA, nhiệt độ phối hợp,

pH của dung dịch CS; các biến đầu ra là KTTP, PDI, thế zeta Kết quả cho công thức tối ưu với tỷ lệ CS/PLGA là 0,4, nhiệt độ là 21,5°C, pH dung dịch CS là 3,2 Các tiểu phân nano ART-PLGA-CS bào chế theo công thức tối ưu có KTTP khoảng

190 nm, thế zeta chuyển từ âm sang dương (36,2 ± 1,04 mV), hiệu suất mang thuốc

77,30%, khả năng nạp thuốc 19,97% Về khả năng giải phóng dược chất in vitro,

giờ đầu Kết quả đánh giá độc tính trên tế bào MCF-7 và A549 cho thấy tiểu phân nano ART-PLGA-CS có độc tính trên tế bào ung thư lớn hơn so với tiểu phân nano ART-PLGA [39]

Với mục đích cải thiện tác dụng trên tế bào ung thư vú của ART, Trần Tuấn Hiệp và cộng sự (năm 2015, năm 2016) đã tiến hành bào chế nano ART sử dụng chất mang lipid bằng kỹ thuật đồng nhất nóng và siêu âm Công thức bào chế tối ưu cho KTTP 117,5 ± 6,1 nm, thế zeta 19,47 ± 0,9 mV, hiệu suất mang thuốc là 92,93

± 1,47% Nano lipid ART cho thấy sự tăng hấp thu trên các tế bào ung thư vú

MCF-7, MDAMB-231 Độc tính in vitro trên các tế bào ung thư vú của nano lipid ART cao hơn so với dạng ART tự do đã được ghi nhận [61], [63]

Để cải thiện khả năng kiểm soát giải phóng dược chất và hướng đích tác dụng trong việc chống lại các tế bào ung thư biểu hiện qua thụ thể CD44, Trần Tuấn Hiệp, Nguyễn Ngọc Chiến và cộng sự (năm 2016) đã tiến hành bào chế và đánh giá một số đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-HA Trong nghiên cứu này, các

sau khi đổi ngược điện tích bằng cách sử dụng một chất hoạt động bề mặt cation

ART-PLGA-HA khắc phục được độ hòa tan kém và độ ổn định kém, hơn nữa còn giúp cải thiện tác dụng so với dạng tự do Độc tính trên các dòng tế bào SCC-7, MCF-7 cho thấy

tiểu phân nano ART-PLGA-HA có độc tính trên tế bào ung thư lớn hơn so với

triển của tế bào ung thư cũng như cảm ứng gây chết tế bào theo chương trình tăng lên so với ART tự do và nano ART-PLGA, có thể giải thích do HA có ái lực lớn với

thụ thể CD44 Điều đó cho thấy tiềm năng lớn trong việc sử dụng nano

còn giảm sự giải phóng dược chất “ồ ạt” ở giai đoạn đầu từ 60,1% xuống 52,5% trong 8 giờ đầu khi so với nano ART-PLGA Sau đó sự giải phóng thuốc gần như duy trì đến 48 giờ với 60% dược chất được giải phóng [62]

1.3.3 Về bào chế nano polyme sử dụng PLGA và PEG

Nhiều nghiên cứu bào chế hệ nano polyme sử dụng kết hợp PLGA và PEG

để khắc phục những hạn chế khi sử dụng PLGA

Zhiqing W và cộng sự (năm 2007) đã tiến hành nghiên cứu bào chế tiểu phân nano arsenic trioxid (ATO) sử dụng chất mang PLGA-PEG bằng phương pháp

nhũ hóa và khuếch tán dung môi Các yếu tố ảnh hưởng đặc tính tiểu phân nano gồm nồng độ và loại chất nhũ hóa, nồng độ polyme, nồng độ dược chất Nghiên cứu

đã lựa chọn chất nhũ hóa Tween 80 nồng độ 0,5%, nồng độ polyme trong pha hữu

cơ là 4,0 mg/mL, tỷ lệ pha hữu cơ/pha nước là 10/60, nồng độ ATO là 0,1 mg/mL Kết quả cho thấy KTTP trung bình 120,8 nm; thế zeta -10,73 mV; hiệu suất bao gói

73,60%; tỷ lệ nạp thuốc 1,36% Nghiên cứu giải phóng in vitro cho thấy hệ nano

ATO-PLGA-PEG có khả năng giải phóng nhiều hơn 26 ngày, theo phương trình Higuchi (% dược chất giải phóng = 6,3979t1/2 + 3,1529, r2 = 0,9518) Việc duy trì giải phóng chủ yếu phụ thuộc vào sự khuếch tán dược chất và sự ăn mòn cốt copolyme, điều này làm cho quá trình giải phóng chậm hơn có thể do PEG đóng vai

trò quan trọng trong việc điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất Nghiên cứu in vitro

về tỷ lệ bắt giữ tiểu phân nano bởi đại thực bào ở màng bụng chuột bằng sử dụng chất đánh dấu rhodamin B cho thấy tỷ lệ bị bắt giữ của nano ATO-PLGA là 62%,

Tween 80 là 17% thấp hơn 3,7 lần Kết quả này có thể do chuỗi PEG đóng vai trò như một đám mây thân nước và làm giảm giá trị tuyệt đối thế zeta của tiểu phân nano nên làm giảm tương tác với các thành phần sinh học, giảm hoạt hóa bổ thể, giảm sự tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào Tween 80 cũng làm giảm giá trị tuyệt đối thế zeta, do đó làm giảm sự bắt giữ bởi các đại thực bào [70]

Với mục đích cải thiện chỉ số điều trị và giảm các tác dụng không mong muốn của paclitaxel sử dụng chất mang Cremophor®EL, Danhier F và cộng sự (năm 2009) đã tiến hành bào chế nano Paclitaxel-PLGA-PEG bằng phương pháp nhũ hóa đơn giản và keo tụ nano Kết quả, KTTP sử dụng phương pháp keo tụ nano nhỏ hơn so với phương pháp nhũ hóa đơn giản (112 nm với 190 nm), chỉ số phân bố kích thước tiểu phân của 2 phương pháp đều nhỏ (PDI < 0,2), hiệu suất bao gói của phương pháp keo tụ cao hơn phương pháp nhũ hóa đơn giản (70% và 37%) Nghiên

cứu tác dụng chống ung thư in vivo trên tế bào ung thư cổ tử cung cho thấy hệ nano

Paclitaxel-PLGA-PEG ức chế sự phát triển của khối u tốt hơn khi so sánh với Taxol [27]

Với mục đích kéo dài thời gian tuần hoàn của paclitaxel điều trị ung thư, Parveen S và cộng sự (2011) tiến hành bào chế nano Paclitaxel-PLGA-CS-PEG Quá trình thực hiện như sau: hòa tan 100 mg PLGA, 10 mg paclitaxel trong 3 mL dung môi cloroform Nhũ tương dầu/nước được hình thành bằng cách phối hợp từ

từ pha dầu vào 12 mL pha nước chứa PVA 2% (kl/tt), sử dụng siêu âm đầu dò 55W trong 2 phút trong điều kiện nước đá lạnh Nhũ tương được khuấy qua đêm để bốc hơi dung môi hữu cơ Sau đó được siêu ly tâm 50602g ở 4°C trong 20 phút để loại

bỏ chất nhũ hóa Phần cắn được rửa với nước cất Sau đó đông khô thu sản phẩm

Để thay đổi đặc tính bề mặt tiểu phân nano, tiến hành tương tự Dung dịch chitosan (CS) với các nồng độ 12%, 20%, 25% trong acid acetic băng 1% được thêm vào pha nước trước giai đoạn nhũ hóa với polyme để hình thành nano bao CS Để đánh giá ảnh hưởng của PEG, dung dịch PEG nồng độ khác nhau 5%, 10%, 20% được thêm vào dung dịch chitosan trước giai đoạn nhũ hóa để được nano Paclitaxel-

của tiểu phân nano PLGA [55]

Arunkumar R và cộng sự (2015) đã tiến hành nghiên cứu bào chế nano sử dụng PLGA-PEG nhằm làm tăng độ tan, sinh khả dụng và tác dụng chống ung thư của Lutein Tiểu phân nano Lutein-PLGA-PEG được bào chế bằng kỹ thuật siêu âm nhũ tương đơn – bốc hơi dung môi PLGA (10 mg/mL), lutein (2 mg/mL), PEG (4 mg/mL) được hòa tan trong 2,5 mL DCM Nhũ tương nano lutein được hình thành bằng cách thêm từ từ pha hữu cơ vào 15 mL pha nước có chứa chất diện hoạt PVA (0,5-2,0%), siêu âm trong 10 phút Bốc hơi dung môi bằng khuấy từ 600 vòng/phút

để tạo thành nano Lutein-PLGA-PEG dưới dạng hỗn dịch trong nước Hỗn dịch được ly tâm ở 12000 g trong 1 giờ Phần cắn được rửa 3 lần với nước cất để loại bỏ chất hoạt động bề mặt, đông khô thu sản phẩm KTTP từ 80-500 nm, trung bình 200 nm; độ tan trong nước tăng 735 lần so với lutein; khả năng kiểm soát giải phóng bền vững 66% trong 72 giờ Phân tích phổ FT-IR cho thấy không có sự tương tác hóa học giữa lutein, PLGA và PEG, có thể là lực tương tác yếu giữa các phân tử như liên kết hydro [19]

Duran-Lobato M và cộng sự (năm 2015) đã tiến hành bào chế nano PLGA-PEG như sau: hòa tan cannabinoid (CB13), PLGA, Span 60 trong acetonitril

CB13-để đạt PLGA nồng độ 1,5 % (kl/tt), tỷ lệ dược chất/polyme là 13% Thêm nhỏ giọt 5

mL dung dịch trên với tốc độ 5 mL/phút vào 15 mL pha nước có chứa Pluronic® F68 (0,5% kl/tt) trong điều kiện khuấy từ Bốc hơi dung môi ở nhiệt độ phòng trong

4 giờ Sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C để thu lấy các tiểu phân nano Phần cắn sau khi rửa 2 lần với nước cất được phân tán lại trong dung dịch chứa trehalose 0,5% (kl/tt) và tiến hành đông khô thu tiểu phân nano Sau đó tiểu phân nano CB13-PLGA được ủ với dung dịch PEG 4,5 % (kl/tt) trong 4 giờ dưới điều kiện khuấy Hoặc kết hợp PEG trong pha nước với tỷ lệ 0,045 mg/mL KTTP sau khi bao với PEG không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Nếu dùng phương pháp kết hợp PEG trong pha nước thì KTTP và PDI lớn nên phương pháp này không được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo Thế zeta sau khi bao PEG giảm

về giá trị tuyệt đối Phân tích phổ FT-IR cho thấy sự hiện diện của PEG trong tiểu phân bao CB13-PLGA-PEG được xác nhận bởi các dải hấp thụ ở 2883 cm-1 do sự lăp lại của liên kết C-H và tại 1146 cm-1

và 1102 cm-1 do lăp lại của liên kết C-C và đặc tính C-O-C do mạch lặp đi lặp lại -OCH2CH2- của PEG [31]

Qua các nội dung ở trên có thể thấy ở Việt Nam, việc áp dụng các dạng thuốc

có có kích thước nano nói chung cũng như dạng nano của artemisinin và dẫn chất nói riêng vẫn còn hạn chế Đặc biệt là các hệ nano có những đặc tính cải biến bề mặt Thiết kế hệ thống phân phối thuốc nano có thay đổi đặc tính bề mặt giúp kéo dài thời gian tuần hoàn trong máu, tạo cơ hội phân phối thuốc đến các khối u đích, thông qua tương tác tĩnh điện với màng tế bào ung thư, hoặc thông qua đáp ứng pH, hoặc các thụ thể folat [35], [62]… Do đó, mục đích chính của nghiên cứu này là tạo

ra các tiểu phân nano polyme ART-PLGA-PEG có đặc tính bề mặt thay đổi nhờ sử dụng polyme thân nước PEG, đồng thời qua đó đánh giá một số đặc tính hóa lý cơ bản và khả năng kiểm soát giải phóng dược chất của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG

CH ƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 N guyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1 Danh mục nguyên vật liệu, hóa chất sử dụng

2 Artesunat chuẩn (số lô 0313012.04,

hàm lượng 99,38%)

Viện KN thuốc

3 Poly (acid lactic-co-glycolic ) 50:50,

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

- Máy đo thế Zeta và xác định phân bố kích thước tiểu phân Zetasizer NanoZS90 Malvern (Anh)

- Máy khuấy từ WiseStir (Hàn Quốc)

- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 (Hoa Kỳ)

- Máy siêu âm Sonics & Materials, Inc.(Mỹ)

- Máy đo pH Eutech instrument pH 510

- Màng thẩm tích 10000 Dalton

Mỹ)

- Tủ lạnh sâu Unicryo (Mỹ)

- Máy lắc điều nhiệt Shaker Incubator, LSI-100B (Nhật Bản)

- Máy lắc Vortex Mixter (Đức)

- Kính hiển vi điện tử quét JEOL JSM-7600F (JEOL Ltd., Nhật Bản)

- Cân kỹ thuật, cân phân tích, các dụng cụ thuỷ tinh khác

- Một số thiết bị, dụng cụ khác

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng công thức bào chế hệ nano ART-PLGA-PEG

- Khảo sát phương pháp bào chế

- Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần trong công thức

2.2.2 Đánh giá đặc tính các tiểu phân nano ART-PLGA-PEG

- Kích thước tiểu phân

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế tiểu phân nano artesunat

2.3.1.1 Phương pháp bao hệ ART-PLGA bằng PEG

Sử dụng phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi 50 mg PLGA và 20 mg dược chất ART được hòa tan trong 5 mL dung môi hữu cơ (DCM) Hỗn hợp sau đó được nhỏ giọt từ từ vào 50 mL pha nước chứa chất nhũ hóa Tween 80 nồng độ 1,5% (kl/tt), đồng nhất bằng siêu âm (Sonics & Materials, INC, Mỹ) ở công suất 100W trong 5 phút Trong quá trình đồng nhất duy trì nhiệt độ 5-10°C bằng nước đá kết hợp khuấy từ Nhũ tương thu được tiếp tục được khuấy từ trong 4 giờ ở nhiệt

độ phòng để loại dung môi hữu cơ

Việc bao PEG có thể tiến hành theo một trong ba cách sau với quy trình được

mô tả như hình 2.1:

tiến hành phối hợp với dung dịch chứa PEG dưới điều kiện thay đổi về tỷ lệ PEG/PLGA và thời gian phối hợp PEG [18], [31]

với chất nhũ hóa dưới điều kiện thay đổi về tỷ lệ PEG/PLGA, sau đó mới tiến hành giai đoạn nhũ hóa [31], [55]

điều kiện thay đổi về tỷ lệ PEG/PLGA, sau đó mới tiến hành giai đoạn nhũ hóa [19], [41]

Hỗn dịch nano ART-PLGA-PEG được ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút ở 10°C trong 30 phút sử dụng ống ly tâm có màng siêu lọc Phần cắn được rửa sạch 3 lần với nước cất, mỗi lần 2 mL để loại bỏ các chất nhũ hóa, sau đó được phân tán lại vào 10 mL nước cất [23], [36], [53]

2.3.1.2 Phương pháp sử dụng PLGA-PEG

Dựa vào các nghiên cứu của Boix-garriga và cộng sự [21], Ferenz và cộng sự [35], Garinot và cộng sự [36], tiến hành kết hợp 2 dạng PLGA và copolyme diblock PLGA-PEG (sau đây gọi tắt là PLGA-PEG) để có tỷ lệ PEG phù hợp

Tiểu phân ART-PLGA-PEG được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi Cách tiến hành như sau: PLGA, PLGA-PEG và dược chất ART được hòa tan trong 5 mL dung môi hữu cơ dicloromethan (DCM) Hỗn hợp sau đó được nhỏ giọt từ từ vào dung dịch chất nhũ hóa chứa Tween 80, đồng nhất bằng siêu âm (Sonics & Materials, Inc., Mỹ) ở công suất 100W trong 5 phút Trong quá trình đồng nhất duy trì nhiệt độ 5-10°C bằng nước đá kết hợp khuấy từ Nhũ tương thu được tiếp tục được khuấy từ trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng để loại dung môi hữu

cơ Hỗn dịch nano thu được được ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút ở 10°C trong 30 phút sử dụng ống ly tâm có màng siêu lọc Phần cắn được rửa sạch 3 lần với nước

cất, mỗi lần 2 mL để loại bỏ các chất nhũ hóa, sau đó được phân tán lại vào 10 mL nước cất [23], [36], [53] Quy trình bào chế được mô tả như hình 2.2

CÁCH 1

CÁCH 2 Pha nước

Chất nhũ hóa, nước

Nhũ tương

PEG

Hỗn dịch nano ART-PLGA

Siêu âm, đồng nhất hóa

PEG

CÁCH 3

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART-PLGA-PEG

sử dụng phương pháp bao hệ ART-PLGA bằng PEG

Pha dầu

ART, PLGA,

PLGA-PEG/DCM

Bốc hơi dung môi

2.3.2 Phương pháp đánh giá đặc tính tiểu phân nano artesunat

2.3.2.1 Đánh giá KTTP và phân bố KTTP

Nguyên tắc: KTTP đựợc xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động Chiếu 1 chùm tia laser vào các hạt có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán

xạ ánh sáng khác nhau Bằng cách đo cường độ ánh sáng tán xạ có thể xác định được KTTP

Tiến hành: tiểu phân nano sau ly tâm và rửa 2 lần bằng nước cất được phân tán vào một lượng nước cất vừa đủ (10 mL) sao cho chỉ số đếm (count rates) nằm trong khoảng 200-400 kcps Tiến hành đo mẫu trên máy Zetasizer NanoZS90, sử dụng cuvet nhựa

2.3.2.2 Đánh giá thế zeta

Nguyên tắc: Khi đặt 1 điện trường lên hệ, tiểu phân sẽ di chuyển về phía điện cực trái dấu với vận tốc tỷ lệ với thế zeta Tốc độ này được xác định dựa vào việc phân tích chuyển động của tiểu phân thông qua ánh sáng tán xạ Thế zeta được xác định dựa vào độ nhớt môi trường và định luật Smoluchowski - Huckel

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART-PLGA-PEG

sử dụng PLGA-PEG

Tiến hành: tương tự như phương pháp xác định kích thước tiểu phân với cuvet nhựa có 2 lá điện cực bằng đồng

Trường hợp đo thế zeta trong các môi trường có pH khác nhau: tiểu phân nano sau ly tâm và rửa 2 lần bằng nước cất được phân tán vào một lượng môi trường đệm phosphat ở các pH khác nhau (khoảng 10 mL) sao cho chỉ số đếm nằm trong khoảng 200-400 kcps

2.3.2.3 Đánh giá hình thái cấu trúc tiểu phân

Sử dụng kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope - SEM) Nguyên tắc: Dùng chùm điện tử quét trên bề mặt mẫu nghiên cứu Việc tạo ảnh được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ sự tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật

Tiến hành: Pha loãng hỗn dịch đặc chứa tiểu phân nano polyme 50 lần, nhỏ trên giấy nhôm Để khô bề mặt giấy nhôm ở nhiệt độ phòng Sau đó quan sát mẫu bằng kính hiển vi điện tử quét JEOL JSM-7600F (JEOL Ltd., Nhật Bản)

- Cột Poroshell 120 SB-C18 (150 × 3,0 mm, 2,7 µm, Agilent, Mỹ)

- Thể tích tiêm mẫu 20 µL

- Tốc độ dòng 0,3 mL/phút

- Detector DAD, bước sóng 210 nm

 Thẩm định một số chỉ tiêu phương pháp định lượng ART bằng HPLC

- Độ đặc hiệu

• Mẫu chuẩn

Cân chính xác khoảng 57,6 mg artesunat cho vào bình định mức 20,0 mL,

2880 μg/mL (dung dịch A) Từ dung dịch A pha loãng bằng ACN tinh khiết đến nồng độ 90 μg/mL, lọc qua màng lọc 0,45 μm

• Mẫu thử

Bào chế hệ tiểu phân nano theo mô tả ở mục 2.3.1 với các thành phần trong bảng 2.2 (công thức 1 bào chế theo phương pháp ở mục 2.3.1.1, công thức 2 bào chế theo phương pháp ở mục 2.3.1.2) Lấy chính xác một thể tích nhất định (1 mL) hỗn dịch cho vào bình định mức 5 mL Thêm 3 mL ACN, lắc kỹ, đậy kín và siêu âm trong 15 phút Bổ sung ACN vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm

Tiến hành tương tự với mẫu thử nhưng pha dầu không có dược chất

Bảng 2.3 Thành phần của các mẫu trắng tá dược Mẫu trắng

Khối lượng (g)

1

2

Tiến hành chạy sắc ký các mẫu: mẫu trắng tá dược, mẫu chuẩn, mẫu thử Ghi lại các sắc ký đồ và đáp ứng pic tại các vị trí tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn ART

• Yêu cầu: Hệ số tương quan tuyến tính (r) phải ≥ 0,99

- Độ ổn định hệ thống

• Tiêm lặp lại 06 lần một dung dịch phân giải chứa artesunat chuẩn 90 μg/mL, trong điều kiện sắc ký đã chọn để khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký Dựa vào các giá trị độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu (tR), diện tích pic (S) để đánh giá

• Yêu cầu: giá trị RSD của diện tích pic và thời gian lưu không vượt quá 2,0

%

2.3.2.5 Phương pháp xác định sự có mặt của PEG

 Quy trình:

FeCl3.6H2O (16,2g FeCl3 khan) và 30,4g amonium thiocyanat (NH4SCN) trong nước khử khoáng, rồi thêm nước vừa đủ 1 lít

- Định lượng: Lấy 0,5 mL mỗi dung dịch ammonium ferrothiocyanat và

vào ống ly tâm Tiến hành khuấy trộn trong 30 phút, sau đó ly tâm ở 4500 vòng trong 2 phút Lớp cloroform bên dưới được lấy và đo độ hấp thụ ở bước sóng 510

nm

- Tiểu phân nano ART-PLGA-PEG được bào chế theo các phương pháp ở mục 2.3.1.1 và phương pháp ở mục 2.3.1.2 Sau đó tiến hành xử lý mẫu như mô tả ở trên Tiến hành rửa 3 lần với nước cất (10mL/lần) để loại Tween 80 Để loại trừ ảnh hưởng của dược chất và polyme PLGA, tiến hành bào chế mẫu thử theo phương pháp tương tự nhưng không có PEG hoặc hệ PLGA-PEG trong pha dầu và không có Tween 80 trong pha nước [17], [50]

 Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ PEG và độ hấp thụ

- Cân chính xác khoảng 20 mg PEG 2000 cho vào bình định mức 100 mL Thêm nước cất hòa tàn hoàn toàn PEG, sau đó bổ sung nước vừa đủ thể tích được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 200 μg/mL Từ dung dịch chuẩn gốc này tiến hành pha loãng với tỷ lệ nước cất thích hợp để được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 2,5; 5; 10; 25; 50; 75; 100 μg/mL

2.3.2.6 Đánh giá hiệu suất mang thuốc và khả năng nạp thuốc

- Xác định hàm lượng dược chất tự do:

Lấy một thể tích nhất định (2 mL) hỗn dịch chứa tiểu phân nano ART cho vào ống ly tâm có màng siêu lọc 10000Da Ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 30 phút, nhiệt độ 10°C Lấy phần dịch lọc, tiến hành định lượng bằng phương pháp HPLC như mục 2.3.2.4

- Xác định hàm lượng dược chất toàn phần:

Lấy chính xác một thể tích nhất định (1 mL) hỗn dịch chứa tiểu phân nano

trong 15 phút Bổ sung ACN vừa đủ đến vạch, lắc đều Tiến hành định lượng bằng HPLC như mục 2.3.2.4

- Công thức tính hiệu suất mang thuốc (Encapsulation Efficiency - EE):

EE (%) = (ART toàn phần - ART tự do)x100%

ART toàn phần