NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH VÀ ỨNG DỤNG CỦA AMYLASE TỪ VI SINH VẬT DẠNG HÒA TAN, DẠNG CỐ ĐỊNH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Lê Thị Hoàng Hạnh NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH VÀ ỨNG DỤNG CỦA AMYLASE TỪ VI SINH VẬT DẠNG HÒA TAN, DẠNG CỐ ĐỊNH Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS ĐỒNG THỊ THANH THU Thành phố Hồ Chí Minh – 2006 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình LÊ THỊ HOÀNG HẠNH LỜI CẢM ƠN  Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS Đồng Thị Thanh Thu - Cán giảng dạy môn Sinh hóa Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM, Cô tận tình hướng dẫn, động viên tạo điều kiện tốt cho hoàn thành luận văn  Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: - Quý Thầy, Cô trực tiếp giảng dạy - Phòng Khoa học Công nghệ Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm TP.HCM - Ban Giám hiệu - Trường phổ thông trung học chuyên Bến Tre - TS Dương Thị Bạch Tuyết - Trưởng khoa Sinh trường Đại học Sư phạm TP.HCM - TS Trần Thanh Thủy Cán phòng thí nghiệm Vi sinh - Sinh - hóa - Trường Đại học Sư phạm TP HCM - Các Cán phòng thí nghiệm Sinh hóa - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM - TS Võ Thị Hạnh - Viện Sinh học Nhiệt đới TP.HCM - Các bạn bè, đồng nghiệp Đã truyền đạt kiến thức, chia sẻ, động viên tinh thần giúp đỡ nhiều thời gian học tập thực đề tài  Xin ghi nhận tình cảm yêu thương người thân gia đình, nguồn động lực thiếu giúp vững bước suốt quãng đường đến lĩnh hội tri thức năm tháng học tập LÊ THỊ HOÀNG HẠNH MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN T T LỜI CẢM ƠN T T MỤC LỤC T T CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN 12 T T LỜI NÓI ĐẦU 13 T T Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 16 T T 1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYM [5], [23] 16 T T 1.1.1 Cấu tạo hóa học chế tác dụng enzym 16 T T 1.1.2 Nguồn thu nhận enzym [21], [23] 21 T T 1.1.3 Tách chiết enzym từ nguồn nguyên liệu [4], [18], [20] 22 T T 1.1.4 Tinh enzym [24] 23 T T 1.2 ENZYM AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG 27 T T 1.2.1 Lược sử nghiên cứu enzym amylase [2], [12], [26] 27 T T 1.2.2 Cấu tạo, tính chất chế tác dụng enzym amylase [16], T [26] 28 T 1.2.3 Ứng dụng amylase [13], [23] 33 T T 1.3 TINH BỘT VÀ SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT 36 T T 1.3.1 Khái quát tinh bột [2], [27], [28], [29], [34], [36] 36 T T 1.3.2 Sự thủy phân tinh bột 37 T T 1.4 SỰ CỐ ĐỊNH ENZYM 40 T T 1.4.1 Khái niệm enzym cố định (enzym không tan) [9], [33] 40 T T 4 1.4.2 Tình hình nghiên cứu enzym cố định nước [9], T [30] 41 T 1.4.3 Tính ưu việt hạn chế enzym cố định [9] 42 T T 1.4.4 Vật liệu cố định enzym 43 T T 1.4.5 Phương pháp cố định enzym [9], [31] 47 T T 1.4.6 Ứng dụng enzym cố định [4], [8], [25] 52 T T Chương VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP 55 T T 2.1 VẬT LIỆU 55 T T 2.1.1 Nguyên liệu thu nhận enzym amylase 55 T T 2.1.2 Nguyên liệu dùng làm chất 55 T T 2.1.3 Nguyên liệu sử dụng để cố định enzym 55 T T 2.1.4 Enzym để đối chứng 55 T T 2.2 THIẾT BỊ 55 T T 2.3 PHƯƠNG PHÁP 56 T T 2.3.1 Phương pháp thu nhận dịch chiết enzym amylase từ canh T trường Bacillus subtilis Aspergillus oryzae [20], [23] 56 T 2.3.2 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzym amylase từ dịch chiết T enzym tác nhân tủa khác [6], [20] 56 T 2.3.3 Phương pháp thẩm tích dialise [22] 57 T T 2.3.4 Cách tính hiệu suất thu nhận enzym từ canh trường 58 2.3.5 Phương pháp xác định hoạt độ 𝜶-amylase theo Smith Roe T T T [3] [6] 58 T 2.3.6 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry [6], [11] T T 60 2.3.7 Xác định hoạt độ riêng chế phẩm enzym [11] 62 T T 5 2.3.8 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, pH lên hoạt độ CPE T amylase 62 T 2.3.9 Định lượng đường khử theo Shaffer-Hartmann [6], [11], [20] 63 T T 2.3.10 Phương pháp khảo sát thủy phân tinh bột khác T enzym amylase theo thời gian [16], [20] 65 T 2.3.11 Phương pháp cố định enzym amylase lên số chất mang 66 T T 2.3.12 Phương pháp cải biến tạo màng chitosan xốp khảo sát khả T cố định enzym lên màng chitosan xốp 67 T 2.3.13 Khảo sát hàm lượng màng chitosan xốp đến khả cố định T enzym 68 T 2.3.14 Khảo sát kích thước màng chitosan xốp đến khả cố T định enzym 68 T 2.3.15 Khảo sát khả tái sử dụng enzym cố định 68 T T 2.3.16 Phương pháp khảo sát khả thủy phân tinh bột enzym T amylase cố định [20] 69 T 2.3.17 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm [11] 70 T T Chương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 73 T T 3.1 Khảo sát hoạt độ amylase canh trường B.subtilis A.oryzae 73 T T 3.2 Hiệu suất thu nhận CPE amylase từ canh trường B.subtilis A.oryzae T tác nhân tủa khác 74 T 3.3 Hoạt độ chung CPE amylase thu từ canh trường B.subtilis T A.oryzae tác nhân tủa khác 75 T 3.4 Hàm lượng protein CPE amylase thu từ canh trường T B.subtilis A.oryzae tác nhân tủa khác 76 T 3.4.1 Dựng đường chuẩn albumin 76 T T 3.4.2 Hàm lượng protein CPE amylase thu từ canh trường T B.subtilis A.oryzae tác nhân tủa khác 77 T 3.5 Hoạt độ riêng CPE amylase thu từ canh trường B.subtilis T A.oryzae tác nhân tủa khác 78 T 3.6 So sánh CPE amylase thu từ canh trường B.subtilis A.oryzae T với sản phẩm Termamyl 120L hãng Novo 80 T 3.6.1 Hoạt độ chung enzym amylase từ sản phẩm Termamyl T 120L 80 T 3.6.2 Hàm lượng protein enzym amylase từ sản phẩm Termamyl T 120L 80 T 3.6.3 Hoạt độ riêng enzym amylase từ sản phẩm Termamyl 120L T T 81 3.6.4 So sánh hoạt độ riêng CPE amylase thu từ canh T trường B.subtilis A.oryzae với sản phẩm Termamyl 120L hãng Novo 81 T 3.7 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ amylase CPE từ T B.subtilis A.oryzae 82 T 3.8 Khảo sát ảnh hưởng pH lên hoạt độ amylase CPE từ B.subtilis T A.oryzae 83 T 3.9 Khảo sát trình thủy phân loại tinh bột CPE amylase hòa T tan thu từ canh trường B.subtilis A.oryzae theo thời gian 85 T 3.9.1 Dựng đường chuẩn glucose 85 T T 3.9.2 Khảo sát trình thủy phân loại tinh bột CPE amylase T hòa tan thu từ canh trường B.subtilis A.oryzae theo thời gian T 86 3.10 Cố định enzym amylase CPE B.subtilis A.oryzae phương T pháp hấp phụ lên oxyt nhôm, diatomite màng chitosan 89 T 3.10.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian gắn đến lượng protein cố T định CPE B.subtilis A.oryzae lên oxyt nhôm, diatomite màng chitosan 89 T 3.10.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian gắn đến hoạt độ amylase T cố định CPE B.subtilis A.oryzae lên oxyt nhôm, diatomite màng chitosan 90 T 3.10.3 Khảo sát khả tái sử dụng enzym amylase B.subtilis T cố định oxyt nhôm, diatomite màng chitosan 91 T 3.10.4 Khảo sát khả tái sử dụng amylase A.oryzae cố định T oxyt nhôm, diatomite màng chỉtosan 92 T 3.11 Cố định enzym amylase B.subtilis A.oryzae phương pháp T cộng hóa trị 94 T 3.11.1 Ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến lượng protein cố T định lên màng chitosan 95 T 3.11.2 Ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến hoạt độ amylase T cố định lên màng chitosan 96 T 3.11.3 Ảnh hưởng thời gian gắn đến lượng protein cố định lên T màng chitosan hoạt hóa 97 T 3.11.4 Ảnh hưởng thời gian gắn đến hoạt độ amylase cố định lên T màng chitosan hoạt hóa 98 T 3.11.5 Khảo sát khả tái sử dụng enzym amylase B.subtilis T amylase A.oryzae cố định màng chitosan hoạt hóa 99 T 3.11.6 So sánh hiệu sử dụng amylase cố định màng chitosan T hoạt hóa với amylase cố định màng chitosan chưa hoạt hóa 100 T 3.12 Khảo sát khả cố định enzym lên màng chitosan xếp 102 T T 3.12.1 Phương pháp tạo màng chitosan xốp 102 T T 3.12.2 Khảo sát khả cố định protein CPE amylase B.subtilis T A.oryzae lên màng chitosan xốp theo thời gian gắn 103 T 3.12.3 So sánh hiệu suất cố định protein lên màng chitosan T chitosan xốp CPE B.subtilis A.oryzae theo thời gian 104 T 3.12.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian gắn đến hoạt độ amylase T cố định CPE amylase B.subtilis A.oryzae lên màng chitosan xốp 105 T 3.12.5 So sánh hiệu suất cố định amylase lên màng chitosan màng T chitosan xốp CPE B.subtilis A.oryzae theo thời gian 106 T 3.13 Khảo sát ảnh hưởng khối lượng màng chitosan xốp đến khả T cố định enzym 107 T 3.13.1 Khảo sát ảnh hưởng khối lượng màng chitosan xốp đến T lượng protein cố định CPE amylase B.subtilis A.oryzae 107 T 3.13.2 Khảo sát ảnh hưởng khối lượng màng chitosan xốp đến T hoạt độ amylase cố định CPE amylase B.subtilis A.oryzae 109 T 3.14 Khảo sát ảnh hưởng kích thước màng chitosan xốp đến khả T cố định enzym 110 T 3.14.1 Khảo sát ảnh hưởng kích thước màng chitosan xốp đến T lượng protein cố định CPE amylase B.subtilis A.oryzae 110 T 3.14.2 Khảo sát ảnh hưởng kích thước màng chitosan xốp đến T hoạt độ amylase cố định CPE amylase B.subtilis A.oryzae 111 T 3.15 So sánh khả phân giải tinh bột enzym hòa tan enzym cố T định 113 T 3.15.1 So sánh khả phân giải tinh bột enzym hòa tan T enzym cố định CPE amylase B.subtilis 113 T 3.15.2 So sảnh khả phân giải tinh bột enzym hòa tan T enzym cố định CPE A.oryzae 114 T Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 117 T T 4.1 Kết luận 117 T T 4.1.1 Xác định tác nhân tủa tối ưu để thu nhận CPE amylase từ T canh trường B.subtilis canh trường A.oryzae 117 T 4.1.2 So sánh CPE amylase thu nhận từ canh trường B.subtilis T canh trường A.oryzae với sản phẩm Termamyl 120 L hãng Novo T 118 4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, pH đến hoạt độ amylase T T 118 4.1.4 Khảo sát thủy phân loại tinh bột amylase hòa tan 118 T T 4.1.5 Khảo sát cố định enzym amylase lên oxyt nhôm, diaiomite T màng chitosan phương pháp hấp phụ 118 T 4.1.6 Khảo sát cố định enzym amylase lên màng chitosan T phương pháp cộng hóa trị 119 T 4.1.7 So sánh khả phân giải tinh bột khả tái sử dụng T amylase cố định lên màng chitosan chưa hoạt hóa màng chitosan hoạt hóa 119 T 4.1.8 Khảo sát khả cố định amylase lên màng chitosan xốp 119 T T 4.1.9 Khảo sát ảnh hưởng khối lượng kích thước màng T chitosan xốp lên hoạt độ amylase cố định 120 T 4.1.10 Ứng dụng CPE amylase dạng hòa tan dạng cố định vào T việc thủy phân loại tinh bột khác 120 T 10 2,825mg/ml (đối với bột bắp) Tương đương khoảng 78 - 82% so với hàm lượng đường khử tạo thành sử dụng CPE amylase hòa tan 4.2 Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt độ amylase hòa tan Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, pH lên amylase cố định Cố định amylase số phương pháp khác Nghiên cứu chế tạo mô hình bình phản ứng (reactor) hồi lưu có hệ thống điều chỉnh nhiệt 121 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Ái (2003), Công nghệ lên men ứng dụng công nghệ thực phẩm, NXB Đại học Quốc gia Tp.Hồ Chí Minh Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Xích Liên (2005), Tinh bột sắn sản phẩm từ tinh bột sắn, NXB Khoa học Kỹ thuật Hoàng Kim Anh (2002), Nghiên cứu quy trình công nghệ chuyển hóa tinh bột phương pháp enzym tạo sản phẩm phục vụ công nghiệp thực phẩm, Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật, Trường Đại học Bách khoa Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Trọng Cẩn (chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ Enzym, NXB Nông nghiệp Tp.Hồ Chí Minh Nguyễn Hữu Chấn (1996), Enzym xúc tác sinh học, NXB Y học Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín, Ngô Đại Nghiệp (2004), Thực tập lớn sinh hóa, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (2004), Hóa sinh học, NXB Giáo Dục Phạm Thị Trân Châu (1983), Những hiểu biết enzym, NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Anh Dũng (2001), Nghiên cứu chế tạo vật liệu cố định enzym từ polymer sinh học kỹ thuật xạ kết hợp với kỹ thuật sinh hóa học, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh 10 Quách Đĩnh, Nguyễn Văn Thoa, Nguyễn Văn Tiếp (1982), Sử dụng chế phẩm enzym công nghiệp thực phẩm, NXB Khoa học Kỹ thuật 122 11 Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kỹ thuật sinh hóa, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh 12 Dương Văn Hợp (1994), Nghiên cứu thu nhận ứng dụng chế phẩm glucoamylaza Aps.niger lên men etanol từ bột sắn sống, Luận án Phó Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội 13 Ngô Tuấn Kỳ (1988), Enzym đời sống, NXB Khoa học Kỹ thuật 14 Trần Thị Ngọc Mai (2005), Nghiên cứu số đặc tính cố định enzym protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae, Luận văn Thạc sĩ Khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh 15 Ngô Đại Nghiệp (2002), Thu nhận khảo sát số đặc tính ứng dụng enzym Ficin từ sung giống Ficus, Luận văn Thạc sĩ Khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh 16 Nguyễn Thị Hồng Loan (2003), Nghiên cứu tận dụng bã khoai mì sản xuất chế phẩm amylase protease từ Asp.oryzae, Luận văn Thạc sĩ Khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh 17 Nguyễn Đức Lượng (2001), Công nghệ sinh học, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh 18 Nguyễn Đức Lượng (2002), Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh 20 Nguyễn Quyết (2004), Nghiên cứu đặc tính ứng dụng 𝛼-amylase 19 Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp dạng hòa tan dạng cố định thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis, Luận văn Thạc sĩ Khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh 21 Trần Minh Tâm (2000), Công nghệ vi sinh ứng dụng, NXB Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh 123 22 Lê Phạm Thanh Thảo (2001), Tách chiết bước đầu cố định enzym pancreatin lên chitin chitosan, Khóa luận cử nhân Khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh 23 Đồng Thị Thanh Thu (2003), Sinh hóa ứng dụng, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh 24 Đồng Thị Thanh Thu (2004), Giáo trình sinh hóa bản, Tủ sách Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp Hồ Chí Minh 25 Lê Ngọc Tú (chủ biên), La văn Chứ, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lê Doãn Diên (2005), Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 26 Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), Enzym vi sinh vật, NXB Khoa học Kỹ thuật 27 Lê Ngọc Tú (2000), Biến hình sinh học sản phẩm từ hạt, NXB Khoa học Kỹ thuật 28 Lê Ngọc Tú (chủ biên), Bùi Đức Hợi, Ngô Hữu Hợp, Đặng Thị Thu, Nguyễn Trọng Cẩn (2001), Hóa học thực phẩm, NXB Khoa học Kỹ thuật 29 Thái Doãn Tĩnh (2003), Cơ sở hóa học hữu (tập 3), NXB Khoa học Kỹ thuật Tiếng nước 30 Harold E Swaisgood (1991), Immobilized Enzym: Applications to Bioprocessing of Food, Department of Food Scien, University Biotechnology Program, USA, pp 309-313 31 Saiyavit Varavinit, Narisa Chaokasem and Sujin Shobsngob (2001), Immobilization of a thermostable alpha-amylase, Department of Biotechnology, Faculty of Science, Mahidol University, Bangkok Thailand, pp 247 32 Trevan, D (1980), Immobilized Enzym, John Wiley & Son, pp 11 124 33 Klaus Mosbach (1987), part C : Immobilized Enzymes and Cells, Academic Press, INC, pp - 34 K.Mathews, K.E Van Holde (1995), Biochemistry, The Benjamin/Cummings, pp 229-231 35 David W Martin, Jr Peter A Mayes, Victor W Rodwell (1985), Precis de biochimie, de Harpel, pp 82-86 36 Horton Moran ochs Rawn Scrimgeour (1994), Principes de Biochimie, De Boeck Université, pp 165-170, 232-235 Địa truy cập Internet 37 http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/Immob/Immob.htm 38 http://www.agbi-tsukuba-ac-ip~abc-Mukataka -2-ipg.htm 39 http://www.azom.com 40 http://www.reade.com/products/minirals and Ores/diatomite.htm 41 http://www.mol.biol.ethz.ch/groups/glockshubergroup/Research/TMAimage 42 http://www rhodes.edu/ biology/Biology I/ beta amylase.jpg 43 http://www.Starch htm 44 http://www inchem Ogr/documents/jecmono/v28 je 05 htm 45 http://www.public.istate.edu/efford/GAstructure.jpg 125 PHỤ LỤC 126 Bảng P1: Giá trị t dùng cho phân tích thống kê 127 Bảng P2: Hiệu suất thu nhận CPE amylase từ canh trường B.subtilis tác nhân tủa khác 128 Bảng P3: Hiệu suất thu nhận CPE amylase từ canh trường A.oryzae tác nhân tủa khác 129 Bảng P4: Sự biến đổi hàm lượng protein cố định CPE amylase B.subtilis A.oryzae lên oxyt nhôm, diatomite màng chitosan 130 Bảng P5: Sự biến đổi hoạt độ amylase cố định CPE B.subtilis A.oryzae lên oxyt nhôm, diatomite màng chitosan theo thời gian gắn 131 Bảng P6: Hàm lượng đường khử tạo thành dùng enzym amylase B.subtilis dạng hòa tan để thủy phân loại tinh bột 11,93 mg CPE amylase (223,32 UI) + 30ml dung dịch chất 1% Thời gian thủy phân phút 150 phút, nhiệt độ 50°C, pH 6,5 132 Bảng P7: Hàm lượng đường khử tạo thành dùng enzym amylase B.subtilis dạng cố định để thủy phân loại tinh bột Enzym cố định (223,32UI/0,5g màng chitosan xốp) + 30ml dung dịch chất 1% Thời gian thủy phân phút 150 phút, nhiệt độ 50°C, pH 6,5 133 Bảng P8: Hàm lượng đường khử tạo thành dùng enzym amylase A.oryzae dạng hòa tan để thủy phân loại tinh bột 11,28 mg CPE amylase (116,68UI) + 30ml dung dịch chất 1% Thời gian thủy phân phút 180 phút, nhiệt độ 45°C, pH 5,5 134 Bảng P9: Hàm lượng đường khử tạo thành dùng enzym amylase A.oryzae dạng cố định để thủy phân loại tinh bột Enzym cố định (116,66UI/0,5g màng chitosan xốp) + 30ml dung dịch chất 1% Thời gian thủy phân phút 180 phút, nhiệt độ 45°C, pH 5,5 135