Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất n hydroxybenzamid mang khung 2 oxoindolin và cầu nối triazol

ĐẶT VẤN ĐỀ Histon deacetylase (HDAC) histon acetyltransferase (HAT) enzym quan trọng tham gia vào trình điều hoà biểu gen Nhiều nghiên cứu cho thấy huy động mức HDAC có khả gây nên sai lệch trình phiên mã, làm kích thích phát triển tế bào ung thư [23, 53] Do đó, HDAC mục tiêu phân tử hấp dẫn cho nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư [21, 29, 47] Trong số loại chất ức chế HDAC tổng hợp công bố nay, dẫn xuất acid hydroxamic có hoạt tính tốt, đặc biệt dẫn xuất acid hydroxamic - acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA, Zolinza ®), FDA phê duyệt năm 2006 cho điều trị u da tế bào lympho T (CTCL) Nhiều nghiên cứu tập trung vào N-hydroxybenzamid, số có nhiều hợp chất có tác dụng ức chế HDAC mạnh [9, 20, 21, 32, 53] Các nhà khoa học nhận nhiều hợp chất chứa vòng indolin tự nhiên tổng hợp hóa học, mà đặc biệt isatin thể tác dụng bật điều trị ung thư lâm sàng [29, 32] Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu dị vòng 1,2,3-triazol có tác dụng nhiều tế bào ung thư mức độ in vitro [6] Do đó, với mục đích thiết kế N-hydroxybenzamid có vòng indolin nhóm khóa hoạt động cầu nối triazol, tiến hành thực đề tài: “Tổng hợp thử hoạt tính sinh học số dẫn chất N-hydroxybenzamid mang khung 2-oxoindolin cầu nối triazol” với mục tiêu chính: Tổng hợp số dẫn chất N-hydroxybenzamid mang khung 2oxoindolin cầu nối triazol Thử tác dụng ức chế enzym histon deacetylase tác dụng gây độc tế bào dẫn chất tổng hợp số dòng tế bào ung thư người Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC) 1.1.1 Khái niệm, phân loại Histon protein cấu tạo nên nhiễm sắc thể, bốn cặp histon (H2A, H2B, H3 H4) tạo nên lõi protein nucleosom Các cặp histon lõi có phần quan trọng: đuôi C nằm bên lõi đầu N nằm bên nucleosom Đầu amin mang nhiều điện tích dương nên tương tác mạnh với phần phosphat mang điện âm phân tử ADN tạo nên cấu trúc nucleosom cấu trúc bậc cao nhiễm sắc thể Việc tích điện dương histon mạnh hay yếu thông qua trình acetyl hóa đầu amin phần đuôi histon Ở dạng deacetyl hóa, histon tích điện dương lớn, tương tác điện tích với ADN mạnh làm đóng xoắn nhiễm sắc thể gây ức chế trình dịch mã tổng hợp protein, ức chế biểu gen Ngược lại, bị acetyl hóa, điện tích dương bị trung hòa, nhiễm sắc thể tháo xoắn, trình tổng hợp protein diễn đặc tính gen biểu Trong tế bào, trình acetyl hóa điều hòa enzym: histon acetyltranferase (HAT) histon deacetylase (HDAC) [2, 17, 26, 43] Hiện người ta biết đến 18 HDAC, chia làm nhóm (bảng 1.1.) Nhóm I, II IV gồm 11 thành viên, coi HDAC “kinh điển” enzym phụ thuộc Zn 2+ Vị trí xúc tác chúng có dạng túi với ion Zn2+ đáy nên enzym bị ức chế hợp chất tạo chelate với Zn2+ acid hydroxamic Ngược lại nhóm III sirtuin không bị ức chế hợp chất chúng có chế hoạt động khác phụ thuộc vào NAD+ [34] Bảng 1.1: Enzym HDAC: phân loại, số lượng acid amin, vị trí, chức sinh lý cấu trúc tinh thể Phụ thuộc Zn2+ I IIA HDAC1 HDAC2 HDAC3 HDAC8 HDAC4 Số lượng acid amin 483 488 428 377 1084 HDAC5 Nhóm 1122 Thành viên HDAC7 912 HDAC9 1069 HDAC6 1215 HDAC10 HDAC11 669 347 SIRT1 747 SIRT2 SIRT3 SIRT4 SIRT5 389 399 314 310 SIRT6 355 SIRT7 400 IIB IV III Vị trí Chức sinh lý Nhân TB Nhân TB Sự sống phát triển tế bào Nhân TB Nhân TB Nhân TB/ Quy định hình thành xương Bào tương glucose thể Nhân TB/ Sự phát triển chức tim Bào tương mạch, tổng hợp glucose, chức tế bào nội mô Nhân TB/ Biệt hóa tế bào miễn dịch, tổng Bào tương hợp glucose Nhân TB Biệt hóa tế bào miễn dịch, Bào tương phát triển chức tim mạch Bào tương Kiểm soát động học trình phân bào Bào tương Tái tổ hợp tương đồng Nhân TB Sao chép AND + Phụ thuộc NAD Nhân TB/ Điều hòa ô xy hóa hệ Bào tương thống tự miễn Nhân TB Thực bào Ty thể Chu trình Ure, trình chuyển Ty thể hóa lượng, điều chỉnh ATP, Ty thể trao đổi chất, chết truyền tín hiệu tế bào Nhân TB Quá trình chuyển hóa lượng Nhân TB Sự chết tế bào X-ray Crystal Có Có Không Có Không Có Không Không Có Có Có Không Có Có Không 1.1.2 Cấu trúc HDAC Bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể chụp tia X người ta xác định cấu trúc 3D số HDAC trung tâm xúc tác phản ứng deacetyl chúng Về HDAC có cấu trúc trung tâm hoạt động giống nhau, chúng gồm phần sau: - Ion Zn2+ coenzym HDAC nằm trung tâm xúc tác chúng Đây thành phần tham gia liên kết mạnh với phần đuôi histon liên kết phối trí Thông thường chất ức chế HDAC liên kết mạnh với Zn 2+ tác dụng ức chế HDAC độc tính tế bào mạnh [35, 46, 50] - Kênh enzym nơi chứa đựng chất tham gia liên kết Van der Walls với chất Kênh có cấu trúc dạng túi hình ống hẹp, cấu tạo acid amin thân dầu đặc biệt acid amin có nhân thơm như: Phe, Tyr, Pro, His Nó có cấu trúc linh động thay đổi kích thước để phù hợp với chất tham gia phản ứng deacetyl Trên miệng túi có vành nhỏ tạo nên từ vài vòng xoắn protein (phần vành tương tác với nhóm nhận diện bề mặt HDAC) Đối với hợp chất acid hydroxamic chiều dài kênh tối ưu với khoảng 5-6 liên kết carbon [17, 46, 50] 1.2.3 Mối liên quan ung thư bất thường hoạt động HDAC Như trình bày phần khái niệm, hoạt động HDAC ảnh hưởng tới tích điện phần đầu amin histon, từ gây tác động lên trình phiên mã Các sai lệch trình phiên mã nguyên nhân dẫn tới hình thành khối u Chẳng hạn, mối tương quan hoạt động HDAC tạo thành khối u thể rõ bệnh ung thư bạch cầu tiền tủy bào cấp tính (APL) Những nghiên cứu phạm vi rộng ức chế phiên mã không thích hợp HDAC chế phổ biến tạo protein gây ung thư (oncoprotein) Ngoài tế bào ung thư người ta thấy hoạt động mức HDAC ung thư buồng trứng (HDAC1-3), ung thư dày (HDAC2); ung thư phổi (HDAC1) [18, 24] Các nghiên cứu có ý nghĩa thống kê HDAC liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa trình sinh học tế bào ung thư chu trình tế bào, biệt hóa, chết tế bào theo chương trình, kể di chuyển, xâm lấn tạo mạch Vai trò chức HDAC trình sinh học tế bào ung thư tóm tắt hình 1.1 [10, 18, 24, 45] Hình 1.1: Vai trò sinh học HDAC hoạt động tế bào ung thư 1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 1.2.1 Phân loại chất ức chế HDAC Các chất ức chế HDAC (HDIs) phục hồi lại biểu gen, ức chế phát triển sống sót tế bào ung thư Khả chống ung thư chất ức chế HDAC bắt nguồn từ khả tác động lên nhiều chu trình tế bào bị biến đổi tế bào ung thư Trong hầu hết trường hợp, hoạt hóa chương trình biệt hóa, ức chế chu trình tế bào thúc đẩy chết tế bào theo chương trình chìa khóa cho tác dụng chống ung thư HDIs Thêm vào đó, hoạt hóa chuỗi phản ứng miễn dịch ức chế tạo mạch đóng vai trò quan trọng tác dụng ức chế khối u in vivo HDIs [26] Một số chất ức chế HDAC miêu tả ức chế phát triển khối u in vitro in vivo mà có độc tính, vài chất thử nghiệm lâm sàng Tất HDIs giai đoạn thử nghiệm lâm sàng ức chế tăng sinh tế bào bị biến đổi nuôi cấy cách làm giảm ngắt quãng chu trình tế bào, phân hóa và/hoặc gây chết tế bào theo chương trình, ức chế phát triển khối u động vật mẫu Trichostatin A (TSA) hợp chất hydroxamate tự nhiên phân lập từ xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus tìm thấy có khả ức chế HDACs IC50 10 nM, có mức chọn lọc 300 lần so với lớp IIa [34, 39] Bên cạnh chất ức chế tổng hợp acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) nghiên cứu báo cáo cho thấy chúng ức chế phát triển tế bào, dẫn đến kết thúc biệt hóa ngăn ngừa hình thành khối u chuột Năm 2006, SAHA (Vorinostat, Zolinza) FDA cấp phép dùng điều trị u lympho tế bào T da Bảng 1.2 đề cập đến chất ức chế enzym HDAC khác thử nghiệm lâm sàng để sử dụng điều trị ung thư, bao gồm nhóm chính: acid béo chuỗi ngắn, acid hydroxamic, tetrapeptid vòng, benzamid [33] Mỗi nhóm có hạn chế riêng: acid hydroxamic bị chuyển hóa nhanh ức chế không chọn lọc HDAC; benzamid acid béo có hiệu lực hạn chế; dẫn chất ceton bị khử hóa huyết tương; peptid vòng có cấu trúc phức tạp [1] Bảng 1.2: Một số chất ức chế HDAC thử lâm sàng Nhóm Chất Đích HDAC Pha thử nghiệm Vorinostat (SAHA,Zolinza) Panobinostat (LBH589) Belinostat (PXD101) Abexinostat Acid hydroxamic Nhóm I, II, IV lâm sàng FDA phê Nhóm I, II, IV Nhóm I, II,IV Nhóm I, II duyệt III II II (PCI24781) Resminostat Nhóm I, II II (RAS2410) Givinostat (ITF2357) Dacinostat Nhóm I, II Nhóm I, II II I Nhóm I, II HDAC 1, II FDA phê HDAC 2, HDAC 1, 4, 11 HDAC 1, 2, 11 duyệt II No Data II HDAC1,9,11 II 275,SNDX-275) Rocilinostat (ACY- HDAC6 II 1215) Valproic acid (VPA) Pivanex (AN-9) Butyrat Nhóm I No data Nhóm I, IIa III II II (LAQ824,NVPLAQ824) Pracinostat (SB939) Romidepsin Các peptid vòng (Depsipeptide,FK228) Apicidin TrapoxinA Mocetinostat Benzamid Aciid carbonxylic (MGCD0103) Entinostat (MS- 1.2.2 Cơ chế tác dụng Các chất ức chế HDAC có tác dụng chống ung thư tác động lên nhiều giai đoạn quan trọng chu trình tế bào làm điều hòa tế bào ác tính Trong đó, yếu tố then chốt định hoạt tính chống ung thư HDIs thúc đẩy biệt hóa, ức chế chu trình tế bào thúc đẩy chết tế bào Ngoài ra, hoạt hóa đáp ứng miễn dịch ức chế tạo mạch vai trò quan trọng HDIs, gián tiếp ức chế phát triển in vivo khối u (hình 1.2) [3, 26] Hình 1.2: Điều hòa phát triển sống sót tế bào chất ức chế HDAC 1.2.3 Liên quan cấu trúc - tác dụng chất ức chế HDAC Phần mang dược tính chất ức chế HDAC thông thường bao gồm: - Nhóm gắn với kẽm (ZBG): tương tác với Zn 2+ vị trí hoạt động enzym HDAC: acid hydroxamic, thiol, benzamid, mercaptoceton Với chất ức chế HDAC có nhóm hydroxamic, ion Zn2+ tạo liên kết phối trí với nguyên tử oxy nhóm hydroxamic - Vùng cầu nối sơ nước: hydrocacbon thân dầu mạch thẳng hay vòng, no không no - Nhóm khóa hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt: thường vòng thơm peptid vòng, tạo tương tác với vành nhỏ miệng túi cấu tạo kênh enzyme HDAC tạo nên từ vài vòng xoắn protein [1, 26, 36, 44] Khi phân tích cấu trúc tia X đồng đẳng HDAC, protein giống HDAC (HDLP), kết hợp với SAHA hay TSA, gần nghiên cứu HDAC8 người, người ta xác định ZBG tương tác với ion Zn 2+ vị trí hoạt động có dạng túi (Zn2+ đáy túi) [36] Dây nối sơ nước đưa ZBG đến vị trí hoạt động cách có hiệu cách lấp kín túi Trong đó, nhóm khóa hoạt động phía bên dây nối liên kết với đuôi amino acid mép túi ZBG thông thường chất ức chế HDAC nửa hydroxamat Sự thay đổi cấu trúc ZBG hydroxamat đạt số thành công: sinh đẳng vị benzamid, α-ketoester, keton điện tử, mercaptoamid phosphonat Trong chất ức chế HDAC nguyên mẫu, nhóm khóa hoạt động nối với dây nối sơ nước thông qua nhóm cho hay nhóm nhận liên kết hydro khác nhóm keto amid Sự thiếu hụt nhóm cho hay nhóm nhận liên kết hydro nửa dây nối đưa đến hội liên kết với nhóm khác mà dễ tổng hợp có dược động học thuận lợi từ giúp đơn giản hóa việc thiết kế tổng hợp chất ức chế HDAC Các chất ức chế HDAC dựa cấu trúc amid-alkyl-acid hydroxamic biết đến nhiều (ví dụ SAHA) Cấu trúc chúng bao gồm phần A-B-C [51] - Phần A liên quan đến hiệu lực tính đặc hiệu (thường aryl) - Phần B cầu nối amid-alkyl - Phần C nhóm gắn kết với Zn2+: acid hydroxamic Cho đến phần lớn nghiên cứu liên quan cấu trúc – tác dụng tập trung tìm hiểu vai trò nhóm gắn kết Zn 2+, cố gắng ngiên cứu thay acid hydroxamic vài cầu nối Sau tổng kết liên quan cấu trúc – tác dụng dãy dẫn chất acid hydroxamic nghiên cứu [51] Hình 1.3: Liên quan cấu trúc – tác dụng chất ức chế HDAC dẫn chất acid hydroxamic Khi phân tích cấu tạo trung hoat động dạng túi HDAC, nhóm nghiên cứu thuộc trung tâm Sigma-Tau (Ý) đặc biệt trọng phần miệng túi với vòng aminoacid tham gia tương tác quan trọng với nhóm nhận diện bề mặt nhóm lân cận Phần nhận diện bề mặt trung tâm hoạt động HDAC chấp nhận hệ vòng đa dạng, từ indol, bemzofuran, quinolin, benzodioxol… Nhóm nitơ cấu trúc phần nhân thơm R tạo liên kết hydro với nhóm aminoacid cấu trúc túi, tăng tương tác với mép túi trung tâm hoạt động enzyme HDAC, tăng hoạt tính chất ức chế HDAC Vì vậy, nghiên cứu khảo sát dẫn chất ức chế HDAC cách thay đổi nhóm khoá hoạt tính (thay vị trí phenyl nhân thơm benzothiazol, phenylthiazol, isoxazol ) SAHA có tính khả quan cao 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC Acid hydroxamic nhóm chất ức chế HDAC nghiên cứu rộng rãi nhất, với nồng độ ức chế nằm khoảng micromol đến nanomol Trichostatin A ((R)-TSA) chất phân lập từ Streptomyceshygroscopicus chứng minh có tác dụng ức chế mạnh, đặc hiệu 10 Phụ lục 2-6: Phổ khối lượng chất IVf Phụ lục 3-1: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân1H-NMR chất IVa Phụ lục 3-2: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân1H-NMR chất IVb Phụ lục 3-3: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân1H-NMR chất IVc Phụ lục 3-4: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân1H-NMR chất IVd Phụ lục 3-5: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân1H-NMR chất IVe Phụ lục 3-6: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân1H-NMR chất IVf Phụ lục 4-1: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân13C-NMR chất IVa Phụ lục 4-2: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân13C-NMR chất IVb Phụ lục 4-3: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân13C-NMR chất IVc Phụ lục 4-4: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân13C-NMR chất IVd Phụ lục 4-5: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân13C-NMR chất IVe Phụ lục 4-6: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân13C-NMR chất IVf BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG BỘ Y TẾ TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYBENZAMID MANG KHUNG 2-OXOINDOLIN VÀ CẦU NỐI TRIAZOL LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYBENZAMID MANG KHUNG 2-OXOINDOLIN VÀ CẦU NỐI TRIAZOL LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 Người hướng dẫn khoa học: TS Đào Thị Kim Oanh ThS Trần Thị Lan Hương HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực luận văn, nhận hướng dẫn tận tình nhiều giúp đỡ quý báu thày cô, đồng nghiệp, gia đình bạn bè Từ tận đáy lòng mình, xin gửi lời cảm ơn chân thành biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Kim Oanh ThS Trần Thị Lan Hương, người thầy dẫn tận tình tạo điều kiện tốt cho hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị em làm việc thực đề tài môn Hóa dược, đặc biệt Ds Đỗ Thị Mai Dung em Lê Văn Cường ủng hộ giúp đỡ nhiệt tình suốt trình nghiên cứu Tôi nhận phối hợp giúp đỡ từ cán làm việc Khoa Hóa – trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học hợp chất tự nhiên, Viện hóa học Việt Nam, Viện Khoa học Công Nghệ Việt Nam, toàn thể thày cô phòng, ban, thư viện Tôi xin chân thành cảm ơn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bè bạn – người sát cánh, động viên khích lệ sống học tập Hà Nội, ngày 31 tháng 03 năm 2016 Học viên Nguyễn Thị Thùy Dương MỤC LỤC PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 13 C – NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C H – NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H AsPC-1 : Tế bào ung thư tụy người Dd : Dung dịch HAT : histon acetyltranferase HDAC : Histon deacetylase HDI, HDIs : Histon deacetylase Inhibitor(s) IR : Phổ hồng ngoại MCF-7 : Tế bào ung thư vú người MS : Phổ khối lượng NCI-H460 : Tế bào ung thư phổi người NST : Nhiễm sắc thể PC-3 : Tế bào ung thư tiền liệt tuyến người Rt : Khuấy SAHA : Acid suberoylanilid SKLM : Sắc ký lớp mỏng SW620 : Tế bào ung thư đại tràng người TSA : Trichostatin A DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC SƠ ĐỒ