Thực hành vi sinh môi trường

Báo cáo thực hành vi sinh đại cương BÀI 1: GÓI VÀ SẤY DỤNG CỤ NGÀY THỰC HÀNH: xem bao nhiu roi ghi vao – cai yeu cau sua lai luu ycái muc dich sua lai la ket I/ YÊU CẦU: - Sinh viên phải cẩn thận, bao kín dụng cụ trước, nắm vững thao tác bao gói dụng cụ sấy dụng cụ trước tiến hành thí nghiệm II/MỤC ĐÍCH: - Rèn luyện cho sinh viên cách bao gói dụng cụ thí nghiệm, đồng thời đảm bảo điều kiện vô trùng trước làm thí nghiệm III/ DỤNG CỤ: - Giấy giói Bông gòn không thấm nước Lò sấy, nồi hấp Các dụng cụ cần bao gói IV/ CÁCH TIẾN HÀNH: - Đối với ống nghiệm bình tam giác, pibet : + lấy lượng gòn vừa đủ miệng ống nghiệm miệng bình tam giác, pibet + Dùng ngón ấn mạnh gòn phía ( nhằm tạo độ mịn cho nút gòn) hạn chế việc vsv khỏi ống nghiệm - Sau tạo nút gòn ta tiến hành dùng báo bao gói miệng ống nghiệm, pipet bình tam giác + Lấy miếng báo nhỏ hình chữ nhật bao vừa đủ miệng ống ống + Dùng báo tròn xung quanh miệng ống, gần hết, ta gấp cạch miếng báo lại + Cuối ta gấp phần báo dư từ miệng ống lại - Đối với hộp petri: - Gói hai hộp petri lần, lấy miếng báo vừa đủ, gấp hai bên mép báo lại, sau gấp giống hình bánh ú - Mỗi dụng cụ có cách gói riêng cho mở dễ dàng - Dụng cụ sau gói đem hấp, hấp lò sấy (không sử dụng dụng cụ có chứa nước, dụng cụ nhựa ), hay lò hấp nước - Đối với lò sấy khô ta có cách sấy: hấp 180 0C thời gian 30 phút hấp 170 0C thời gian 60 phút hấp 160 0C thời gian 1h 30 phút - Đối với lò nước ta hấp áp suất 1at vòng 30 phút - Sau hấp song mang dụng cụ để nguội để làm thí nghiệm CDMT10 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương BÀI 2: NẤU MÔI TRƯỜNG NGÀY THỰC HÀNH: 22/9/2009 I Mục đích yêu cầu - Biết cách nấu môi trường nuôi cấy vi sinh - Cách đổ môi trường vào petri ống nghiệm II Dụng cụ - Betcher 250ml - đĩa petri - 30 ống nghiệm - erlen 250ml - Bếp điện - Đũa khuấy thủy tinh - cân III Hóa chất - Nước cất - Agar - Đường - Giá - Muối NaCl IV.Tiến hành thí nghiệm Môi trường lỏng: dung dịch nước muối sinh lý 9/1000 Pha 500 ml nước muối sinh lý cần 4,5g muối NaCl Cho 4,5 g NaCl vào 500 ml nước cất, hòa tan cho muối tan hoàn toàn Ta nước muối sinh lý 9/1000 1.1 Môi trường bán lỏng Công thức: - 200 ml dung dịch nước giá - 0,93 g agar - 10g đường Cách chế tạo: Cho 100 g giá vào 200 ml nước cất, nấu cho sôi, sau vớt bỏ giá lấy phần nước Sau đó, cho 10 g đường 0,93 g agar vào 200 ml dung dịch nước giá Khuấy cho đường agar tan hết dung dịch CDMT10 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương 1.2 Môi trường rắn Công thức: - 500 ml dung dịch nước giá - 7,5 g agar - 15 g đường Cách chế tạo: Cho 100 g giá vào 500 ml nước cất, nấu cho sôi, sau vớt bỏ giá lấy phần nước Sau đó, cho 7,5 g agar 15 g đường vào 150 ml dung dịch nước giá Khuấy cho đường agar tan hết dung dịch 1.3 Khử trùng dụng cụ Lấy 30 ống nghiệm hộp petri đem gói hấp trùng 15 phút, nhiệt độ 1210C Sau 15 phút lấy để chuẩn bị đổ môi trường 1.4 Đổ môi trường Sau nấu môi trường xong, ta cho tương ứng môi trường lỏng, bán lỏng, rắn vào erlen tương ứng - Erlen chứa 500 ml môi trường lỏng - Erlen chứa 200 ml môi trường bán lỏng - Erlen chứa 500 ml môi trường rắn Sau đó, gói lại đem hấp 15 phút, nhiệt độ 121 0C Sau 15 phút lấy môi trường ra, làm nguội nước lạnh đến 50-60 0C tiến hành đổ môi trường vào đĩa petri ống nghiệm - Đĩa petri nhỏ cho vào khoảng 6-8 ml môi trường - Đĩa petri lớn cho vào khoảng 12-15 ml môi trường - Ống nghiệm cho vào khoảng 5-10 ml môi trường Đổ môi trường xong, ta đem gói hộp petri ống nghiệm cho vào tủ ấm để bảo quản CDMT10 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương BÀI 3: SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI NGÀY THỰC HÀNH:29/09/2009 I MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU - Biết cấu tạo chức phận kính hiển vi - Củng cố hình thành kỹ sử dụng kính hiển vi, đặc biệt kỹ sử dụng vật kính dầu Kỹ bảo quản thường xuyên định kỳ kính hiển vi II DỤNG CỤ - Kính hiển vi quang học - Phiến kính, kính - Mẫu để quan sát III TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM Sử dụng kính hiển vi 1.1 Nguyên tắc: Ảnh thật vật mẫu mà ta quan sát thông qua vật kính thị kính có độ phóng đại vật kính với độ phóng đại thị kính Ví dụ: Độ phóng đại thị kính (x10); độ phóng đại vật kính (x100): Độ phóng đại ảnh là: 10x100 = 1000 lần 1.2 Cấu tạo: Phần học: - Thân kính - Đế kính - Bàn kính - ống kính Thân kính: chuyển động theo hướng lên xuống phạm vi 50 mm nhờ cấu lắp thân kính Cơ cấu chuyển động nhờ tay vặn điều chỉnh thô tay vặn điều chỉnh tinh để đưa ảnh vật nghiên cứu vào tiêu điểm Khi quay tay vặn theo chiều kim đồng hồ thân kính hạ xuống, quay ngược chiều kim đồng hồ thân kính lên Phía thân kính có bàn xoay, vật kính lấp vào lỗ bàn xoay CDMT10 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương Ống kính: xoay quanh trục thẳng đứng đến vị trí thích hợp cho người quan sát, giữ chặt lại nhờ ốc giữ kính Phía ống có gắn thị kính Ống kính có khả di chuyển lên xuống nhồ ốc điều chỉnh theo hai chiều ngược nhau: ốc di chuyển nhanh (ốc chỉnh thô): có nhiệm vụ tìm ảnh vật ốc di chuyển chậm (ốc chỉnh tinh): sau có ảnh vật điều chỉnh ốc để có ảnh rõ nét Bàn kính: Có thể di chuyển theo mặt phẳng ngang nhờ ốc vặn di chuyển bàn kính bên Nhờ chuyển tiêu vị trí vào Trên bàn kính có kim loại giữ tiêu Dưới bàn kính có giá giữ tụ quang Phần quang học - Bộ phận chiếu sáng - Vật kính - Thị kính Bộ phận chiếu sáng: có tụ quang đèn để hội tụ ánh sáng để chiếu sáng tiêu Bộ tụ quang: Được gắn phía gương cấu tạo từ thấu kính dùng để hội tụ tia sáng xuất phát từ nguồn sáng phản xạ lại qua gương Trong tụ quang có lắp màng chắn sáng Màng chắn sáng cho phépđiều chỉnh lượng ánh sáng rọi vào cách phù hợp Dưới tụ quang có giá dùng để gắn kính lọc sáng đèn để hội tụ ánh sáng: ta cần bật đèn điều chỉnh cường độ ánh sáng phù hợp Vật kính: tạo ảnh thật phóng đại lên nhiều lần nằm vị trí ngược với vật quan sát Vật kính cấu tạo từ hệ thống thấu kính đặt vỏ bọc kim loại Phần quan trọng thấu kính mặt ngoài, nơi mà khoảng cách tiêu cự định độ phóng đại vật nghiên cứu Độ cong thấu kính lớn tiêu cự ngắn độ phóng đại vật kính lớn Độ phóng đại vật kính ghi phía bên thấu kính Có loại vật kính với độ phóng đại khác là: (x4); (x10); (x40); (x100) Khi quan sát tiêu sử dụng vật kính độ phóng đại (x4); (x10); (x40) không sử dụng dầu Còn dùng vật kính (x100) phải sử dụng dầu soi kính Thị kính: gồm thấu kính: thấu kính mắt (phía trên) thấu kính tụ (phía dưới) Giữa thấu kính có chắn cho tia sáng gần với trục qua, đồng thời làm cho hình rõ nét Thị kính có nhiệm vụ phóng đại thêm ảnh vật kính, Mỗi loại thị kính có độ phóng đại khác ghi mặt thị kính CDMT10 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương 1.3 Cách sử dụng Các thao tác điều chỉnh nguồn sáng: - Đưa vật kính vào vị trí nhận nguồn sáng - Cắm điện bật công tắc đèn (nếu dùng ánh sáng đèn) Mắt nhìn vào thị kính đồng thời dùng tay phải điều chỉnh gương phản chiếu để tập trung nguồn sáng vào tâm điểm vùng quan sát Điều chỉnh cho đạt mức ánh sáng nhiều Dùng tay trái điều chỉnh kính tụ quang cho: + Được nâng lên mức hợp lý + Mở hệ thống chắn sáng cho nhìn vật cách hoàn hảo Các thao tác điều chỉnh vật kính quan sát tiêu bản: - Đặt tiêu lên bàn kính kẹp chặt lại - Điều chỉnh tiêu để chọn vùng định quan sát - Nhìn vào thị kính, điều chỉnh nhẹ nhàng, thận trọng ốc chỉnh thô, ốc chỉnh tinh thấy rõ ảnh mẫu vật Có thể phải điều chỉnh vị trí tiêu bàn kính thấy cần thiết Nếu dùng vật kính dầu nên ý: + Nhỏ giọt dầu soi kính vào vị trí vùng định quan sát tiêu + Hạ từ từ vật kính chạm nhẹ vào giọt dầu + Nhẹ nhàng điều chỉnh ốc thô thoáng xuất ảnh vi trường + Điều chỉnh thêm ốc chỉnh tinh cho ảnh rõ nét Bảo quản kính hiển vi Bảo quản sau sử dụng kính: - Nâng vật kính lên, lấy tiêu - Nếu vật kính dầu, lấy khăn vải mềm tẩm xylen, lau nhẹ vào dầu vật kính cho thật - Hạ kính tụ quang, xoay gương phản chiếu - Đưa vật kính nhỏ vào vị trí tiêu - Tắt đèn, rút phích cắm khỏi ổ điện - Cho kính vào tủ bảo quản Bảo quản thông thường: - Hàng năm, định kỳ mời thợ chuyên môn tới tu chỉnh, lau chùi kính hiển vi CDMT10 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương - Di chuyển kính phải thật nhẹ nhàng di chuyển thật cần thiết - Khi không sử dụng nên đặt kính vào tủ bảo quản BÀI 4: NẤU MÔI TRƯỜNG THẠCH PEPTON - GLUCOZA, CẤY VI SINH NGÀY THỰC HÀNH: 06/10/2009 I MỤC ĐÍCH YÊU CẦU - Biết nguyên tắc trình gieo, cấy, nuôi vi sinh vật - Các kiểu cấy khác loại môi trường thạch nghiêng, thạch đứng, thạch đĩa II DỤNG CỤ - Ống nghiệm - Giá để ống nghiệm - Hộp petri - Pipet 1ml - Que cấy đầu tròn, đầu nhọn - Que trang - Bình tia - đũa thủy tinh III HÓA CHẤT - Pepton - Glucoza - K2HPO4 - MgSO4.7H2O - Thạch - Nước cất - Mẫu vi sinh vật IV TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM Tiến hành hấp khử trùng dụng cụ gồm: đĩa petri ống nghiệm 15 phút nhiệt độ 1210C Nấu môi trường thạch pepton-glucoza: Công thức: - Glucoza: 5g - K2HPO4: 0.5g - Nước cất: 500 ml - MgSO4.7H2O: 0.25g - Thạch (agar): 10g - pH=7 - Bếp điện -pepton 2,5g Cách chế tạo: CDMT10 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương Cân hóa chất với khối lượng trên, đem glucoza, K 2HPO4, MgSO4.7H2O hòa vào nước cất cho tan hoàn toàn Sau đem dung dịch đo pH, điều chỉnh pH=7 Cho agar vào dung dịch trên, nấu cho agar tan hết Sau đủ thời gian, lấy dụng cụ hấp khử trùng ra, tiến hành đổ môi trường Sau đổ môi trường vào xoay hộp petri cho thạch dàn đáy hộp Sau dể cho môi trường đông lại Cấy vi sinh: - Dùng que cấy đầu tròn lấy mẫu vi sinh vật ống nghiệm đựng mẫu, cấy lên môi trường Phương pháp lấy mẫu sau: - Đốt đèn cồn lên - Tay trái cầm ống nghiệm có đựng môi trường chứa vi sinh vật, ngửa lỏng bàn tay lên trên, đặt ống nghiệm ngón tay trái ngón trỏ giữ nghiêng không môi trường vi sinh vật chạm vào nút - Dùng tay phải xoay nhẹ nút vòng để sau dễ rút - Tay phải dùng que cấy vô trùng đèn cồn Trước hết để que cấy thẳng đứng lửa lúc đầu que cấy đỏ lên từ từ chuyển sang toàn que cấy phần que cầm lửa, kh dùng pipet pasto bẻ gãy đầu mao dẫn đoạn vô khuẩn tương tự - Đốt miệng ống nghiệm đèn cồn - Cho que cấy vào ống nghiệm để lấy vi sinh vật Với môi trường lỏng cần nhúng que cấy vào môi trường chứa vi sinh vật, không nên để môi trường vi sinh vật chạm vào tay cầm, với môi trường đặc quệt lấy phần nhỏ khuẩn lạc, không cấy mặt thạch lên - Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghệm, đậy nút lại đặt ống nghiệm vào giá - Đem mẫu vi sinh vật có đầu que cấy cấy vào môi trường - Vô trùng lại que cấy đèn cồn để vào giá - Việc cấy vi sinh vật lên môi trường thực môi trường vô trùng, đốt đèn cồn lên, ta thực khoảng không gian cách đèn cồn khoảng 25 cm Phương pháp cấy: 3.1 Phương pháp việc cấy truyền: Cấy truyền phương pháp lấy vi sinh vật từ ống nghiệm sang ống nghiệm khác Gồm thao tác: CDMT10 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương + Dán nhãn ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy vào thành ống nghiệm nút chút + Tay trái cầm hai ống nghiệm: ống giống, ống môi trường + Tay phải cầm que cấy khử trùng lửa đèn cồn nóng đỏ dây cấy + Dùng ngón út ngón áp út kẹp nút lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút + Hơ nóng để khử trùng không khí miệng ống nghiệm + Đợi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với vi sinh vật ống giống + Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm đưa vào ống môi trường để thực thao tác cấy truyền + Khử trùng lại phần không khí nơi miệng ống nghiệm đậy nút + Khử trùng lại que cấy sau sử dụng xong… Nếu ống giống môi trường lỏng có vi sinh vật dùng pipet hút môi trường thay que cấy 3.2 Phương pháp cấy thạch nghiêng: - Dán nhã ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy vào thành ống nghiệm nút chút - Sử dụng que cấy đầu tròn thực thao tác cấy - Tay trái cầm hai ống nghiệm: ống giống, ống môi trường - Tay phải cầm que cấy khử trùng lửa đèn cồn nóng đỏ dây cấy - Dùng ngón út ngón áp út kẹp nút vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút - Hơ nóng để khử trùng không khí miệng ống nghiệm - Đợi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với vi sinh vật ống giống - Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm đưa vào ống môi trường để thực thao tác cấy: + Hòa giống đầu que cấy giọt nước đáy ống nghiệm + Nhẹ nhàng lướt que cấy mặt thạch theo kiểu:  Hình chữ chi CDMT10 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương  Hình vòng xoắn  Hình vạch ngang song song - Khử trùng lại phần không khí nơi miệng ống nghiệm đậy nút - Khử trùng lại que cấy sau sử dụng xong… 3.3 Phương pháp cấy thạch đứng: - Sử dụng que cấy đầu tròn - Sau lấy giống vi sinh vật,dùng que cấy đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ - Đâm sát đáy ống nghiệm đâm thành đường: đường giữa, đường sát thành ống tùy yêu cầu - Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường Một số dạng môi trường ống nghiệm hộp pêtri 3.4 Phương pháp cấy hộp petri: - Sử dụng que cấy đầu tròn CDMT10 10 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương BÀI 6: NHUỘM PHỨC VI KHUẨN I Mục đích yêu cầu - Củng cố kiến thức cấu trúc – chức yếu tố tạo nên tế bào vi khuẩn - Củng cố kỹ làm tiêu nhuộm phức vi khuẩn - Củng cố kỹ sử dụng vật kính dầu II Dụng cụ - Kính hiển vi quang học - Phiến kính, kính - Que cấy đầu tròn - Đèn cồn - Bình tia III Hóa chất - Cồn đốt - Dung dịch fuchsin loãng - Dung dịch lugol, Gential violet - Nước cất vô trùng, nước muối sinh lý - Vi khuẩn Gram âm, Gram dương IV Tiến hành thí nghiệm Làm tiêu vi sinh vật nhuộm màu 1.1 Làm vết bôi (đồ phiến) - Chọn phiến kính khô Nếu chưa phải rửa lại - Lấy bút chì màu khoanh vòng (1-2cm 2) lên phía phiến kính, quay ngược phiến kính lại để lên giá - Dùng que cấy vòng lấy môi trường để vào vòng khoanh Với môi trường đặc dùng que cấy cho giọt nước muối sinh lý lên vùng khoanh, sau lấy môi trường hòa vào - Nghiêng que cấy 10-15 độ, nhẹ nhàng dàn giọt môi trường khắp diện tích khoanh, không xát mạnh - Làm xong, vô khuẩn que cấy đèn cồn để vào giá Một vết bôi làm tốt phải: CDMT10 15 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương - Hết sức mỏng, vi sinh vật không tập trung vào chỗ chồng chất thành nhiều lớp, mà phân phối vết bôi - Có hình dạng kích thước thích hợp: tròn bầu dục, rộng 1-2cm 2, bé khó quan sát, lớn giờ, tốn thuốc nhuộm 1.2 Làm khô vết bôi: Để vết bôi khô nhiệt độ phòng Muốn nhanh hơ nhẹ đèn cồn, cách xa lửa (25cm) hơ nóng gián tiếp tuyệt đối không hơ nóng trực tiếp hơ nóng tế bào bị quắt lại, cấu tạo bị thay đổi Phải để vết bôi thật khô tiếp tục Vết bôi làm vàng mỏng chóng khô 1.3 Cố định vết bôi: Nhằm mục đích: - Giết chết vi sinh vật để sử dụng tiếp tục không nguy hiểm - Gắn chặt vi sinh vật vào kính để lúc nhuộm, rửa không bị trôi - Làm cho vi sinh vật dễ bắt màu Có nhiều phương pháp cố định, phương pháp đơn giản hơ nóng đèn cồn: kẹp phiến kính hai ngón tay ngón trỏ, đưa qua lại 4-5 lần phần không nóng đèn cồn, ý xoay phía kính có vết bôi lên Khi nghiên cứu cấu tạo tế bào cố định cách hơ nóng không lợi, mà phải cố định hóa chất, thường dùng chất sau: - Rượu etylic: nhỏ rượu lên vết bôi nhúng vết bôi vào rượu Rượu tuyệt đối tác dụng tức thời, rượu 95% 5-15 phút rượu loãng thời gian lâu - Rượu metylic 2-5 phút - Axeton phút - Dùng rượu etylic đốt cháy: cho vài giọt rượu 90-95% lẹn vết bôi đốt cháy dập tắt ngay, làm vài lần để khô, phương pháp nhanh gọn nên hay dùng Nhuộm màu Nguyên tắc: Vi sinh vật bắt màu thuốc nhuộm trình hấp phụ Trong đa số trường hợp thuốc nhuộm kết hợp với vi sinh vật bền vững khó bị phá hủy bị nước làm phai Thuốc nhuộm thường dùng chất màu anilin, chủ yếu kiềm trung tính CDMT10 16 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương Vì thành phần hóa học tế bào loài vi sinh vật phận tế bào khác nên khả mức độ bắt màu không giống nhau, ta có nhiều phương pháp nhuộm - Nhuộm đơn giản: tiêu dùng thứ thuốc nhuộm - Nhuộm phức tạp: tiêu dùng nhiều loại thuốc nhuộm: nhuộm Gram, nha bào, tiên mao Tùy yêu cầu nghiên cứu mà ta áp dụng phương pháp thích hợp Cách nhuộm: - Vết bôi cố định phải để khô đem nhuộm - Đặt phiến kính có vết bôi lên khung que thủy tinh tay trái cầm kẹp coocne giữ lấy phiến kính - Dùng ống nhỏ giọt nhỏ thuốc nhuộm phủ vết bôi Chú ý không cho thuốc nhuộm nhiều thời gian nhuộm vết bôi luôn có lớp thuốc nhuộm phủ đều, không để cạn khô - Thời gian nhuộm tùy tính chất tiêu thuốc nhuộm đem dùng Thường nhuộm nhiệt độ phòng - Để tăng cường tác dụng thuốc nhuộm rút ngắn thời gian ta hơ nóng nhẹ đèn cồn dùng que tẩm cồn đốt - Khi nhuộm xong, đổ hết thuốc nhuộm đi, rửa cách nghiêng phiến kính cho dòng nước chảy nhẹ lên mặt, nước kéo thuốc nhuộm đến nước chảy không màu Sau dùng giấy thắm khô hơ khô nhẹ đèn cồn Phải để tiêu thật khô đem quan sát Nhuộm Gram: Phương pháp Christim Gram đưa vào năm 1884, ngày thông dụng vi sinh vật học Đây phương pháp nhuộm quan trọng dùng để định loại vi sinh vật dựa thành phần cấu tạo chúng Người ta cho nguyên sinh chất tế bào số loài vi sinh vật có chứa phức chất protein đặc biệt mà thành phần có muối ribonucleat Mg, nhuộm phức chất kết hợp với thuốc nhuộm triphenylmetan (như gentian violet, cristal violet, metyl violet ) iod cho màu tím bền vững, khó tác dụng cồn Những vi sinh vật có tính chất gọi vi sinh vật Gram dương, không gọi vi sinh vật Gram âm CDMT10 17 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương Cách nhuộm gồm bước: Vết đồ Phủ tím tinh thể phút Rửa nước Phủ glucol phút Rửa nước Tẩy cồn 30 giây Rửa nước Phủ fushing 30 giây Rửa nước Đã nhuộm Sau nhuộm xong, cho giọt dầu soi kính lên mẫu vi sinh vật nhuộm để tiến hành quan sát kính hiển với vật kính x100 Kết quả: sau nhuộm mẫu vi sinh vật mẫu có vi khuẩn Gram âm: bắt màu hồng, có hình que; vi khuẩn Gram dương: bắt màu tím, hình cầu Điếm trực tiếp: Như trình bày trước CDMT10 18 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương BÀI 7: CẤY NẤM MỐC I Mục đích yêu cầu: Củng cố cách cấy môi trường II Dụng cụ: - Que cấy đầu tròn - Đèn cồn - Bình tia - Bếp điện - Cân - đĩa petri - ống nghiệm - đũa thủy tinh III Hóa chất: - Cồn đốt - Nước cất vô trùng, nước muối sinh lý - Mẫu nấm mốc cần nghiêng cứu - Pepton - Maltoza hay glucoza - Thạch - Nước cất - saccaroza - NaNO3 - K2HPO4 - FeSO4 - MgSO4 IV Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị dụng cụ: - Đem hấp đĩa petri 15 phút, nhiệt độ 1210C - Lấy ống nghiệm chứa nước muối sinh lý, lấy mẫu nấm mốc cần nghiên cứu hòa vào Nấu môi trường nuôi cấy nấm mốc: Công thức: Môi trường Sabouraud:  Peton: 1g  Glucoza: 4g  Nước: 100 ml  Thạch: 2g pH = 5.6 Môi trường Czapek:  Saccaroza: 3g CDMT10  NaNO3: 3g 19 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương  K2HPO4: 0.1g  MgSO4: 0.05g  FeSO4: 0.001g  Thạch: 2g  Nước cất: 100 ml  pH = Cách làm: Môi trường Sabouraud: lấy 1g Peton, 4g Glucoza hòa vào 100 ml nước cất, khuấy cho tan hoàn toàn, sau đem đo pH, điều chỉnh đến pH = 5.6 Cho 2g thạch (agar) vào nấu agar tan hết Môi trường Czapek: lấy 0.1g K2HPO4, 0.001g FeSO4, 3g NaNO3, 3g Saccaroza, 0.05g MgSO4 hòa vào 100 ml nước cất, ta khuấy cho tan đem đo pH, điều chỉnh pH = Cho 2g thạch (agar) vào nấu cho tan hoàn toàn Sau 15 phút, lấy đĩa petri tiến hành đổ môi trường Môi trường Sabouraud cho vào đĩa petri, môi trường Czapek cho vào đĩa lại Ghi rõ tên lớp, ngày thực hành, môi trường, tổ, nhóm Chờ khoảng thời gian cho môi trường đặc lại Sau tiến hành cấy nấm mốc lên môi trường Có thể cấy thành đường thành 1-3 chấm hộp Cách cấy trình bày trước Nuôi nhiệt độ 300C sau 3-5 ngày đem quan sát CDMT10 20 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương BÀI 8: XEM NẤM MỐC – KHẢO SÁT pH I Mục đích yêu cầu: - Quan sát nấm mốc - Khảo sát phát triển vi khuẩn môi trường có pH khác II Dụng cụ: - Kính hiển vi - bếp điện - 10 erlen - phiến kính - máy đo pH - 20 ống nghiệm - 10 betcher - cân - đũa thủy tinh III Hóa chất: - Dung dịch lugol, Gential violet - Dung dịch fuchsin loãng - pepton - NaCl - nước cất IV Tiến hành thí nghiệm: Quan sát nấm mốc: Lấy mẫu nấm mốc tiến hành nuôi cấy trước quan sát Nấm mốc loài vi sinh vật lớn, có cấu tạo hình sợi phân nhánh nhiều lần Sợi nấm gọi khuẩn ty Khi phát triển chúng chằng chịt với làm thành hệ sợi nấm (khuẩn ty thể) mắt thường nhìn thấy chúng Nấm mốc sinh sản nhiều cách cách sinh sản chủ yếu tạo thành bào tử Khảo sát số giống nấm mốc đặc trưng: - Mucor Rhizopus sợi nấm đơn bào: bào tử hình thành túi gọi bào tử nang, chúng gọi nấm mốc có bào tử kín (bào tử nội sinh)  Mucor: cuống bào tử nang thường có phân nhánh mọc lên chỗ sợi nấm  Rhizopus: cuống bào tử nang không phân nhánh mọc lên chỗ sợi nấm tiếp xúc với môi trường mọc thành cụm từ 3-4 cụm, trông giống rễ bụi lúa CDMT10 21 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương - Với Aspergillus Penicilium: sợi nấm đa bào Đầu sợi nấm sinh sản phình to ra, tạo thành thể hình chai chuỗi đỉnh bào tử gọi bào tử hở hay bào tử ngoại sinh  Aspergillus: cuống đỉnh bào tử đơn bào, tế bào hình chai chuỗi đỉnh bào tử tỏa điều đầu sợi nấm  Penicilium: Cuống đỉnh bào tử đa bào,đầu cuống phân nhánh nhiều lần thành chuỗi đỉnh bào tử Các tế bào hình chai chuỗi đỉnh bào tử hướng lên phía trông giống chổi Kết quả: quan sát ta thấy giống nấm mốc bào tử đính, màu xám vàng Bào tử nấm mốc phóng đại kính hiển vi Bào tử túi Bào tử đính Khảo sát pH: Khảo sát vi khuẩn ecoli, pH từ 3-11, cho lượng vi khuẩn vào, môi trường lỏng Nấu môi trường: - pepton: 7g - NaCl: 5.95g - nước cất: 700 ml Đun để hòa tan thành phần nước cất Cho vào 10 betcher betcher chứa 70 ml môi trường, đem betcher điều chỉnh pH từ pH=3 đến pH=11 Sau cho vào 10 erlen, ghi rõ tên lớp, ngày thực hành, nhóm, pH Đem hấp trùng Đồng thời đem 10 ống nghiệm trùng CDMT10 22 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương Sau hấp xong, lấy môi trường cho môi trường có pH từ 311 vào 20 ống nghiệm có ghi rõ tên lớp, ngày thực hành, nhóm, pH, ống nghiệm chứa 10 ml môi trường Lấy ống nghiệm chứa 12 ml nước muối sinh lý để chứa vi khuẩn Hút ml dung dịch vi khuẩn cho vào 10 ống nghiệm 10 ống lại dùng làm ống đối chứng không chứa vi khuẩn Sau 48 tiếng phải xem kết cấy Kết quả: - pH=11, vi khuẩn phát triển nhiều nhất, ống đục ống lại - pH: 10-3, độ đục giảm dần, chứng tỏ vi khuẩn phát triển → Môi trường cao, môi trường có tính bazo vi khuẩn phát triển tốt Lấy mẫu ống có pH=11 đem nhuộm Gram CDMT10 23 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương BÀI 9: KHẢO SÁT ÁP SUẤT THẨM THẤU I Mục đích yêu cầu: Khảo sát phát triển vi sinh vật môi trường có áp suất khác II Dụng cụ: - 18 đĩa petri - betcher - erlen - bếp điện - cân - đũa thủy tinh - máy đo pH - que cấy III Hóa chất: - mẫu vi sinh vật khảo sát - muối NaCl - pepton - thạch (agar) - nước cất IV Tiến hành thí nghiệm: Trong thân tế bào vi sinh vật có dịch tế bào trì áp suất để cân áp suất bên ngoài, chất trì áp suất thẩn thấu NaCl (nồng độ 0.85 – 0.9%) tạo áp suất tương áp suất bên Áp suất thẩm thấu tác dụng đến phát triển vi sinh vật Khảo sát nồng độ muối 0%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20% Nấu môi trường: - 700 ml nước cất - 7g pepton - 10,5 g agar - NaCl: 0.5g, 1g, 5g, 10g, 20g Cho 7g pepton vào 700 ml nước cất, hoà tan, điều chỉnh pH=7 Cho agar vào, nấu cho agar tan Cho khối lượng muối 0g, 0.5g, 1g, 5g, 10g, 20g vào betcher ghi rõ tên lớp, ngày thực hành, nhóm, nồng độ muối.Sau agar tan hoàn toàn cho vào betcher, betcher 100 ml môi trường, khuấy cho muối tan ra, betcher chứa 20g muối không tan Cho vào erlen ghi rõ tên lớp, ngày thực hành, nhóm, nồng độ muối Đem hấp trùng 15 phút-1210C Lấy môi trường ra, đổ môi trường vào đĩa petri, nồng độ muối cho vào đĩa petri ghi rõ tên lớp, ngày thực hành, nhóm, nồng độ muối Chờ cho môi trường đông lại, hút 0.1 CDMT10 24 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương ml huyền dịch vi sinh vật ống nghiệm đựng mẫu cho vào đĩa petri, dùng que cấy trải Ủ sau từ 2-4 ngày quan sát khuẩn lạc mọc môi trường Kết quả: - nồng độ muối 0%, 0.5%, 1%: vi sinh vật phát triển nhiều thành mảng lớn - nồng độ muối 5%: Vi sinh vật phát triển dần tạo thành khuẩn lạc riêng rẽ - nồng độ muối 10%: khuẩn lạc mọc dần - nồng độ muối 20%: vi sinh vật không phát triển Nồng độ cao áp suất thẩm thấu cao ảnh hưởng đến vi sinh vật vi sinh vật phát triển CDMT10 25 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương BÀI 10, 11: THỰC HÀNH KHẢO SÁT PHẢN ỨNG SINH HÓA I Mục đích yêu cầu: Khảo sát khả sử dụng đường vi sinh vật môi trường KIA, TSI II Dụng cụ: - hộp petri - que cấy đầu tròn -que cấy đầu nhọn - betcher 250 ml - đèn cồn - ống nghiệm - giá để ống nghiệm - bếp điện III Hóa chất: - cồn đốt - cao thịt - pepton - proteose pepton - NaCl - lactoza - glucoza - sắt sunfat - Natrithiosunfat - Metyl red -agar - nước cất -dextroza - saccharoza - Natrisunfit - cao nấm men IV Tiến hành thí nghiệm Nấu môi trường KIA: Thành phần: - cao thịt: 3g - cao nấm men: 3g - pepton: 15g - proteose pepton: 5g - NaCl: 5g - lactoza: 10 g - glucoza: 1g - sắt sunfat: 0.2 g - Natrithiosunfat: 0.3 g - Metyl red: 6ml - agar: 12g - nước cất: 1000 ml Cách pha: Đun sôi để hòa tan hoàn toàn thành phần nước cất, để nguội đến 450C nồi cách thủy, chỉnh pH=7.4 25 0C Rót vào 24 ống nghiệm để làm thạch CDMT10 26 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương nghiêng lượng cho môi trường đông lại thể tích phần đáy gấp đôi phần nghiêng Sau chờ cho môi trường đông lại, tiến hành cấy vi sinh vật: dùng que cấy tròn nhúng vào huyền dịch vi sinh vật cấy lên môi trường thạch nghiêng ống nghiệm, cấy dày, lấy que cấy thẳng cấm vào 2/3 thạch, ủ 18-24h đọc kết Ghi rõ ống mẫu cấy, họ tên, lớp, ngày thực hành Nấu môi trường TSI: Thành phần: - Cao thịt: 4g - pepton: 4g - Dextroza: 1g - lactoza: 10g - saccharoza: 10g - NaCl: 5g - Natrithiosunfat: 0.08g - Natrisunfit: 0.4g - sắt sunfat: 0.2g - Metyl red:2.5 ml - agar: 15g - nước cất: 1000 ml Cách pha: Đun sôi để hòa tan hoàn toàn thành phần nước cất, để nguội đến 450C nồi cách thủy, chỉnh pH=7.4 250C Rót môi trường vào 24 đĩa petri, chờ cho môi trường đông lại tiến hành cấy phân lập Kết quả: môi trường KIA: - Ống nghiệm có đỏ-dưới đỏ: vi sinh vật không dùng đường - Ống nghiệm có đỏ-dưới vàng: vi sinh vật dùng đường lượng axit sinh không chuyển hóa màu môi trường, vi sinh vật dùng đường đơn - Ống nghiệm có vàng-dưới đỏ: vi sinh vật dùng đường đơn đường oxi hóa - Ống nghiệm có vàng-dưới vàng: vi sinh vật sử dụng đường đơn, đường đôi - Ống nghiệm phần nhỏ đỏ trên-dưới vàng: Vi sinh vật sử dụng đường đường lên men - Ống nghiệm có vàng- phần nhỏ đỏ dưới: Vi sinh vật sử dụng đường đường oxi hóa - Ống có sắc tố đen: vi sinh vật có khả sinh H2S - Ống nghiệm có thạch bị nứt vi sinh vật có khả sinh CDMT10 27 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương → Khảo sát vi sinh vật ta thấy ống nghiệm có phần đỏ, có màu cam, chứng tỏ vi sinh vật sử dụng đường lượng axit sinh không đủ để chuyển hóa màu môi trường HÌNH ẢNH MỘT SỐ VI SINH VẬT Clotridium botulinum Vibrio cholerae CDMT10 Aeromonas sp Vibrio parachaemolytycus 28 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương Plesiomonas sp CDMT10 E coli 29 [...]... vào nấu cho tan hoàn toàn Sau 15 phút, lấy 8 đĩa petri ra và tiến hành đổ môi trường Môi trường Sabouraud cho vào 4 đĩa petri, môi trường Czapek cho vào 4 đĩa còn lại Ghi rõ tên lớp, ngày thực hành, môi trường, tổ, nhóm Chờ một khoảng thời gian cho môi trường đặc lại Sau đó tiến hành cấy nấm mốc lên môi trường Có thể cấy thành đường hoặc thành 1-3 chấm trong mỗi hộp Cách cấy như đã trình bày ở bài trước... môi trường Kết quả: - nồng độ muối 0%, 0.5%, 1%: vi sinh vật phát triển nhiều thành từng mảng lớn - nồng độ muối 5%: Vi sinh vật phát triển ít dần và tạo thành những khuẩn lạc riêng rẽ - nồng độ muối 10%: khuẩn lạc mọc ít dần - nồng độ muối 20%: vi sinh vật không phát triển Nồng độ càng cao áp suất thẩm thấu càng cao ảnh hưởng đến vi sinh vật vi sinh vật kém phát triển CDMT10 25 Báo cáo thực hành vi. .. không tan được Cho vào 6 erlen ghi rõ tên lớp, ngày thực hành, nhóm, nồng độ muối Đem hấp thanh trùng trong 15 phút-1210C Lấy môi trường ra, đổ môi trường vào đĩa petri, mỗi nồng độ muối cho vào 3 đĩa petri ghi rõ tên lớp, ngày thực hành, nhóm, nồng độ muối Chờ cho môi trường đông lại, hút 0.1 CDMT10 24 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương ml huyền dịch vi sinh vật trong ống nghiệm đựng mẫu cho lần lượt... cáo thực hành vi sinh đại cương nghiêng một lượng sao cho khi môi trường đông lại thì thể tích phần đáy gấp đôi phần nghiêng Sau đó chờ cho môi trường đông lại, tiến hành cấy vi sinh vật: dùng que cấy tròn nhúng vào huyền dịch vi sinh vật cấy lên môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm, cấy dày, lấy que cấy thẳng cấm vào 2/3 thạch, đi ủ 18-24h thì đọc kết quả Ghi rõ ống mẫu cấy, họ tên, lớp, ngày thực. .. Rót môi trường vào 24 đĩa petri, chờ cho môi trường đông lại tiến hành cấy phân lập Kết quả: môi trường KIA: - Ống nghiệm có trên đỏ-dưới đỏ: vi sinh vật không dùng được đường - Ống nghiệm có trên đỏ-dưới vàng: vi sinh vật dùng được đường nhưng lượng axit sinh ra không chuyển hóa màu môi trường, vi sinh vật chỉ dùng đường đơn - Ống nghiệm có trên vàng-dưới đỏ: vi sinh vật dùng được đường đơn bằng con... vàng: vi sinh vật sử dụng được đường đơn, đường đôi - Ống nghiệm 1 phần nhỏ đỏ ở trên-dưới vàng: Vi sinh vật sử dụng đường bằng con đường lên men - Ống nghiệm có trên vàng- 1 phần nhỏ đỏ ở dưới: Vi sinh vật sử dụng đường bằng con đường oxi hóa - Ống có sắc tố đen: vi sinh vật có khả năng sinh H2S - Ống nghiệm có thạch bị nứt thì vi sinh vật có khả năng sinh hơi CDMT10 27 Báo cáo thực hành vi sinh đại... Báo cáo thực hành vi sinh đại cương → Khảo sát vi sinh vật ta thấy trong ống nghiệm có phần trên đỏ, dưới có màu cam, chứng tỏ vi sinh vật sử dụng được đường nhưng lượng axit sinh ra không đủ để chuyển hóa màu của môi trường HÌNH ẢNH MỘT SỐ VI SINH VẬT Clotridium botulinum Vibrio cholerae CDMT10 Aeromonas sp Vibrio parachaemolytycus 28 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương Plesiomonas sp CDMT10 E coli 29... ống còn lại - pH: 10-3, độ đục giảm dần, chứng tỏ vi khuẩn kém phát triển hơn → Môi trường càng cao, môi trường càng có tính bazo thì vi khuẩn phát triển càng tốt Lấy mẫu ống có pH=11 đem nhuộm Gram CDMT10 23 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương BÀI 9: KHẢO SÁT ÁP SUẤT THẨM THẤU I Mục đích và yêu cầu: Khảo sát sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường có áp suất khác nhau II Dụng cụ: - 18 đĩa petri... của cồn Những vi sinh vật có tính chất này gọi là vi sinh vật Gram dương, nếu không gọi là vi sinh vật Gram âm CDMT10 17 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương Cách nhuộm gồm các bước: Vết đồ Phủ tím tinh thể 1 phút Rửa nước Phủ glucol 2 phút Rửa nước Tẩy cồn 30 giây Rửa nước Phủ fushing 30 giây Rửa nước Đã nhuộm Sau khi nhuộm xong, cho 1 giọt dầu soi kính lên mẫu vi sinh vật đã nhuộm để tiến hành quan sát... dịch huyền phù có vi sinh vật vào giữa khung đếm và đậy bằng lá kính Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang sao cho dịch huyền phù không rơi xuống các rãnh và không tạo thành bọt khí Khí đó dịch nằm trong khoang có độ dầy khoảng 0.1 mm CDMT10 12 Báo cáo thực hành vi sinh đại cương Sau đó đặt phiến kính đã có vi sinh vật lên kính hiển vi, quang sát và đếm vi sinh vật có trong