Bảo quản tinh trùng lợn trong nitơ lỏng (196 0c)
TRƯỜNG ĐH NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC BỘ MÔN CNSH ĐỘNG VẬT Đề Tài: “ Bảo quản tinh trùng lợn nitơ lỏng (1960C)” Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Hữu Đức GV Nguyễn Tố Loan Nhóm Hà Nội 2010 I Đặt Vấn Đề • Chăn nuôi ngành nông nghiệp quan trọng kinh tế quốc dân Chăn nuôi cung cấp thịt, trứng, sữa, sức kéo… cho người • Trong nghành chăn nuôi lợn chiếm phần không nhỏ( theo niên giám thống kê 2004 số lượng lớn 26143,7 nghìn con.) I Đặt Vấn Đề • Việc bảo tồn phát huy hết giá trị nguồn gen lợn đực giống thông qua công nghệ sinh sản vấn đề có mức ảnh hưởng lớn đến sản xuất chăn nuôi lợn đực giống lợn thương phẩm I Đặt Vấn Đề • Tuy nhiên công nghệ bảo quản tinh trùng lợn đực giống nước ta tiến hành phương pháp bảo quản tinh trùng lợn đực giống dạng ngắn ngày mà chưa trọng đến phương pháp bảo quản tinh trùng lợn đực giống dài ngày • Vậy thực hiên đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học khuôn khổ chương trình Việt – Bỉ với tên gọi: Bảo quản lạnh tinh trùng lợn Nitơ lỏng (- 196oC) II Mục Đích Nghiên Cứu Bước đầu thăm dò môi trường đông lạnh giải đông tinh trùng lợn Bước đầu thiết lập quy trình đông lạnh bảo quản tinh trùng lợn nitơ lỏng (- 196oC) Nhằm thúc đẩy trình thương mại hóa, trao đổi giống cải tiến chất lượng đàn lợn thương phẩm Việt Nam Nhằm bảo tồn giống lợn đực tốt có chất lượng nâng cao hiệu sinh sản đàn lợn thương phẩm Việt Nam III Nội Dung &Phương Pháp Nghiên Cứu Phạm vi đối tượng nghiên cứu Tinh trùng lợn đực giống ? khai thác từ sở chăm nuôi lợn đực giống vùng Hà Nội, Bắc Ninh, Hưng Yên Tuổi lợn đực giống ? trọng lượng lợn đực giống ? Thời gian lấy tinh ? Khoảng cách lần lấy tinh ? Phương pháp lấy tinh ? Đánh giá chất lượng tinh trùng trước đông lạnh Lượng tinh dịch lợn (ml): Lượng tinh dịch lợn thường đo băng pipet chia vạch Lượng tinh dịch TB lợn nội >=100ml Lượng tinh dịch TB lợn ngoại = [250,400] ml Nồng độ tinh trùng (106/ml): Là số lượng tinh trùng có 1ml tinh dịch Phương pháp đánh giá nồng độ tinh trùng là: Phương pháp buồng đếm hồng cầu Đánh giá chất lượng tinh trùng trước đông lạnh Độ pH tinh dịch lợn có pH = [7.2,7.5] Ta đo pH giấy đo pH, máy đo pH Màu sắc tinh dịch lợn: tinh dịch lợn thường có màu trắng sữa Nếu tinh dịch có màu khác thường tinh dịch bị nhiễm bẩn dùng Đánh giá chất lượng tinh trùng trước đông lạnh Sức đề kháng tinh trùng (R): sức đề kháng tinh trùng dung dịch đẳng trương Người ta thường dùng nước muối 1% để kiểm tra đánh giá lượng tinh dịch cần pha loãng đơn vị tinh dịch đến toàn tinh dịch ngừng hoạt động Mùi vị tinh trùng thường có mùi Nếu tinh trùng có mùi thối khắm hay khai tinh trùng nhiễm bẩn Đánh giá chất lượng tinh trùng trước đông lạnh Tỷ lệ sống tinh trùng liên quan đến mức độ hoạt động tinh trùng Đo tỉ lệ sống tinh trùng dựa nguyên lý nhuộm Eosin Tinh trùng chết bắt màu thuốc nhuộm tinh trùng sống không bắt màu thuốc nhuộm 3.2 Các chất tham gia bảo quản đông lạnh tinh trùng Glucose: cung cấp lượng giải độc cho tinh trùng chất bảo vệ lạnh cho tinh trùng Sodium citrate: làm chất đệm ổn định pH Lòng đỏ trứng gà: nhằm chống lạnh cho tinh trùng Dung dịch chất bảo quản lạnh Phân lập tinh trùng lợn Trước tiến hành đông lạnh tinh trùng ta nên tiến hành phâp tách tinh trùng nhằm tách tinh trùng sống khỏi tinh trùng chết mảnh vỡ tế bào tinh dịch nhằm tăng hiệu bảo tồn tinh dịch Phân lập tinh trùng lợn băng phương pháp swim up: Nguyên tắc phương pháp tinh dịch bơi lên phĩa thoát khỏi tinh dịch bên Phân lập tinh trùng băng phương pháp gradient không liên tục: Phương pháp dựa trình ly tâm tinh trùng khỏe bơi nhanh so vơi tinh trùng chết mảnh tế bào 5.1 Phương pháp đông lạnh tinh trùng chậm Tinh trùng tốt A>0.7 Ly tâm Pha với môi trường Tăng dần nồng độ chất bảo quản lạnh Giảm nhiệt độ chậm với tốc độ ?oC/ phút Đến nhiệt độ [-5oC,-9oC] Giảm nhiệt độ nhanh Với tốc độ ?oC/ phút Đến nhiệt độ -80oC Tiến hành bảo quản Trong nito lỏng (-196oC) 5.1.Phương pháp đông lạnh tinh trùng chậm • Chất bảo quản lạnh sử dụng 1,2 propanediol (PROH) Với PROH, kết đạt tốt dùng kèm với sucrose để làm chất bảo quản • Môi trường dùng quy trình trữ lạnh gồm có môi trường môi trường đệm phosphate (PBS) bảo quản bên tế bào • Nồng độ PROH sucrose môi trường là: • Làm lạnh 1: 1,5M PROH (?0C phút) • Làm lạnh 2: 1,5M PROH + 0,1M sucrose (?0C phút) • Sau tinh dịch cho vào ống trữ thể tích khoảng ?ml trữ theo chương trình: • Từ nhiệt độ phòng xuống -700C: giảm 1-20C/phút 5.1.Phương pháp đông lạnh tinh trùng chậm • Từ nhiệt độ phòng xuống -70 0C: giảm 1-2 0C/phút • Tạo mầm tinh thể: Dùng vật kim loại nhúng vào nitơ lỏng trước chạm vào thành ống trữ tinh • Giai đoạn làm lạnh chậm đến -30 0C: giảm 0,3 C/phút • Giai đoạn làm lạnh nhanh: giảm 30-50 0C/phút, cho trực tiếp vào nitơ lỏng 5.2 Phương pháp đông lạnh tinh trùng băng thủy tinh hóa • Nguyên lý kĩ thuật thủy tinh hóa môi trường đẳng trương nhiệt độ làm lạnh nhanh -130oC trở nước hình thành dạng hạt kết tinh hay dạng hạt thủy tinh • Phương pháp thủy tinh hóa nhằm đặt tinh trùng vào áp suất môi trường cao nhằm diến khử nước nhanh, sau tiến hành đặt trực tiếp tinh trùng vào nito lỏng 5.2 Phương pháp đông lạnh tinh trùng thủy tinh hóa Tinh trùng tốt A> 0.7 Ly tâm Pha với môi trường Có nồng độ chất bảo quản lạnh cao Đặt tinh trùng Vào nito lỏng 5.2 Phương pháp đông lạnh tinh trùng thủy tinh hóa • Các chất bảo vệ đông lạnh sử dụng kỹ thuật thủy tinh hóa gần giống kỹ thuật đông lạnh chậm , nồng độ sử dụng cao • Gồm chất bảo vệ đông lạnh có khả thấm qua màng tế bào (ethylene glycol,propylene glycol, acetamid, glycerol, raffinose, dimethylsulphoxide (DMSO) 1,2propanediol (PrOH) ) để khử nước bên tế bào chất bảo vệ đông lạnh khả thấm qua màng tế bào (sucrose, trehalose, glucose galactose ) làm đối trọng, giúp trình khử nước bên tế bào xảy nhanh 5.2.1 Dụng cụ kỹ thuật thủy tinh hóa • OPS (open-pulled straw): loại straw có đường kính nhỏ nhiều so với đường kính nguyên thủy loại straw 0,25ml thường dùng.Lượng môi trường có chứa tinh trùng hút vào OPS khoảng ?µl, đầu OPS chứa môi trường tinh trùng bảo vệ straw 0,5ml; đầu lại gắn nút nhựa nhằm tránh trường hợp OPS bị lên bề mặt thả vào nitơ lỏng OPS loại dụng cụ sử dụng phổ biến kỹ thuật đông lạnh cực nhanh 5.2.1 Dụng cụ kỹ thuật thủy tinh hóa • ryoloop: dụng cụ bao gồm vòng tròn rỗng nhựa mềm, gắn với cán nhựa kim loại Dung dịch thủy tinh hóa tạo thành mộp lớp màng mỏng phần rỗng vòng tròn tinh trùng đặt lớp màng mỏng này, sau toàn dụng cụ có chứa tinh trùng làm lạnh nitơ lỏng 5.2.1 Dụng cụ kỹ thuật thủy tinh hóa • Cryotop: loại dụng cụ phát minh vài năm gần (2000) xem dễ sử dụng có hiệu sau rã đông cao Dụng cụ bao gồm phim mỏng bảo vệ nắp nhựa, gắn với cán cầm nhựa Tinh trùng đặt bề mặt phim với lượng môi trường nhỏ toàn mẫu nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng Ngoài ưu điểm dễ thao tác, cryotop nhanh nhiều so với OPS, điều giúp tăng tỉ lệ sống tinh trùng sau rã đông tốc độ làm lạnh rã đông sử cryotp nhanh 5.2.2 Ưu điểm kỹ thuật thủy tinh hóa • Phương pháp thủy tinh hóa có thời gian nhanh có hiệu kinh tế cao so với kỹ thuật động lạnh chậm • Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh cao giúp trinh khử nước kỹ thuật thủy tinh hóa diễn nhanh hơn, hiệu hợn, tỉ lệ tinh trùng sống nhiều • Kỹ thuật thủy tinh hóa giúp bảo vệ an toàn it gây biến đổi tinh trùng so với kỹ thuật đông lạnh chậm 5.3 Quá trình giải đông tinh trùng • Quá trình giải đông tinh trùng phụ thuộc vào trình đông lạnh trước • Rã đông:Với chất bảo quản lạnh PROH với nồng độ (?C), ống chứa tinh trùng làm rã đông cách giữ không khí 30 giây, sau nhúng vào nước ấm 37(?) 0C 60(?) giây IV Kết Quả Và Thảo Luận Đặc điểm sinh học tinh trùng lợn trước đông lạnh Đánh giá khả vận động tinh trùng lợn môi trường pha loãng môi trường bảo quản lạnh Đánh giá khả vận động tinh trùng lợn sau giải đông V Kết Luận [...]... Người ta thường kết hợp 2 chất bảo quản tinh trùng trên giúp cho quá trình khử nước trong tinh trùng và cân bằng áp suất trong tế bào chất của tinh trùng được diễn ra nhanh hơn, giúp bảo vệ tinh trùng trong quá trình đông lạnh 3.2 Các chất tham gia bảo quản đông lạnh tinh trùng Glucose: cung cấp năng lượng và giải độc cho tinh trùng và là chất bảo vệ lạnh cho tinh trùng Sodium citrate: làm chất... nhằm chống lạnh cho tinh trùng Dung dịch chất bảo quản lạnh 4 Phân lập tinh trùng lợn Trước khi tiến hành đông lạnh tinh trùng ta nên tiến hành phâp tách tinh trùng nhằm tách được tinh trùng sống ra khỏi tinh trùng chết và các mảnh vỡ tế bào trong tinh dịch nhằm tăng hiệu quả bảo tồn tinh dịch Phân lập tinh trùng lợn băng phương pháp swim up: Nguyên tắc của phương pháp này là tinh dịch sẽ bơi lên... lượng tinh trùng trước khi đông lạnh Tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng: là tinh trùng có hình dáng khác so với tinh trùng bình thường 2 Đánh giá chất lượng tinh trùng trước khi đông lạnh Độ tiến của tinh trùng: được đánh giá thông qua thước Macleod Mức của thước Macleod Vạch 0: Tinh trùng Bất Động Vạch 1: Tinh trùng di động nhưng không tiến tới Vạch 2: Tinh trùng di động nhưng tiến tới yếu Vạch 3: Tinh. .. Phương pháp đông lạnh tinh trùng bằng thủy tinh hóa Tinh trùng tốt A> 0.7 Ly tâm Pha với môi trường Có nồng độ chất bảo quản lạnh cao Đặt ngay tinh trùng Vào nito lỏng 5.2 Phương pháp đông lạnh tinh trùng bằng thủy tinh hóa • Các chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hóa gần giống như trong kỹ thuật đông lạnh chậm , nhưng nồng độ sử dụng cao hơn • Gồm 2 chất bảo vệ đông lạnh có... trùng di động nhưng tiến tới yếu Vạch 3: Tinh trùng di động tiến tới vừa phải Vạch 4: Tinh trùng di động tiến tới nhanh 3 Môi trường bảo quản đông lạnh 3.1 Chất bảo quản lạnh tinh trùng Chất có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào của tinh trùng như ethylen glycol, propanediol (PROH), propylen glycol, glycerol, dimethylsulphoxide (DMSO) Chất bảo quản tinh trùng không có khả năng đi qua màng tế bào:... vào nitơ lỏng 5.2 Phương pháp đông lạnh tinh trùng băng thủy tinh hóa • Nguyên lý của kĩ thuật thủy tinh hóa là ở môi trường đẳng trương và nhiệt độ làm lạnh nhanh ở -130oC trở đi thì nước sẽ hình thành dạng hạt kết tinh hay dạng hạt thủy tinh • Phương pháp thủy tinh hóa nhằm đặt tinh trùng vào áp suất môi trường cao nhằm diến ra sự khử nước nhanh, sau đó tiến hành đặt trực tiếp tinh trùng vào nito lỏng. .. Tiến hành bảo quản Trong nito lỏng (-196oC) 5.1.Phương pháp đông lạnh tinh trùng chậm • Chất bảo quản lạnh được sử dụng hiện nay là 1,2 propanediol (PROH) Với PROH, kết quả đạt được tốt nhất khi dùng kèm với sucrose để làm chất bảo quản • Môi trường dùng trong quy trình trữ lạnh gồm có môi trường cơ bản là môi trường đệm phosphate (PBS) bảo quản bên ngoài tế bào • Nồng độ PROH và sucrose trong từng... 5.3 Quá trình giải đông tinh trùng • Quá trình giải đông tinh trùng phụ thuộc vào quá trình đông lạnh trước đấy của nó • Rã đông:Với chất bảo quản lạnh là PROH với nồng độ là (?C), ống chứa tinh trùng có thể được làm rã đông bằng cách giữ trong không khí trong 30 giây, sau đó nhúng vào nước ấm 37(?) 0C trong 60(?) giây IV Kết Quả Và Thảo Luận 1 Đặc điểm sinh học tinh trùng lợn trước khi đông lạnh 2... dịch sẽ bơi lên phĩa trên và thoát khỏi tinh dịch bên dưới Phân lập tinh trùng băng phương pháp gradient không liên tục: Phương pháp này dựa trên quá trình ly tâm thì tinh trùng khỏe sẽ bơi nhanh hơn so vơi tinh trùng chết và các mảnh tế bào 5.1 Phương pháp đông lạnh tinh trùng chậm Tinh trùng tốt A>0.7 Ly tâm Pha với môi trường Tăng dần nồng độ chất bảo quản lạnh Giảm nhiệt độ chậm với tốc độ ?oC/... mềm, gắn với một cán nhựa hoặc kim loại Dung dịch thủy tinh hóa tạo thành mộp lớp màng mỏng trong phần rỗng của vòng tròn và tinh trùng được đặt ngay trên lớp màng mỏng này, sau đó toàn bộ dụng cụ có chứa tinh trùng được làm lạnh trong hơi nitơ lỏng 5.2.1 Dụng cụ trong kỹ thuật thủy tinh hóa • Cryotop: đây là loại dụng cụ chỉ mới được phát minh trong một vài năm gần đây (2000) nhưng được xem là dễ sử