Bảo quản tinh trùng lợn trong nitơ lỏng (196 0c)

Bảo quản tinh trùng lợn trong nitơ lỏng (196 0c)

TRƯỜNG ĐH NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

I Đặt Vấn Đề

• Chăn nuôi là một ngành nông nghiệp quan trọng trong nền kinh tế quốc dân Chăn nuôi cung cấp thịt, trứng, sữa, sức kéo… cho con người.

• Trong đó nghành chăn nuôi lợn chiếm 1 phần không nhỏ( theo niên giám thống

kê 2004 số lượng lớn là 26143,7 nghìn con.)

I Đặt Vấn Đề

• Việc bảo tồn và phát huy hết giá trị nguồn gen lợn đực giống thông qua công nghệ sinh sản là một vấn

đề có mức ảnh hưởng lớn đến nền sản xuất chăn nuôi lợn đực giống và lợn thương phẩm

I Đặt Vấn Đề

• Tuy nhiên công nghệ bảo quản tinh trùng lợn đực giống ở nước ta mới chỉ tiến hành phương pháp bảo quản tinh trùng lợn đực giống dạng ngắn ngày mà chưa chú trọng đến phương pháp bảo quản tinh trùng lợn đực giống dài ngày

• Vậy chúng tôi thực hiên đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học trong khuôn khổ chương trình

Việt – Bỉ với tên gọi: Bảo quản lạnh tinh trùng

lợn trong Nitơ lỏng (- 196 o C)

II Mục Đích Nghiên Cứu

 Bước đầu thăm dò môi trường đông lạnh và giải đông tinh trùng lợn

 Bước đầu thiết lập quy trình đông lạnh và bảo quản tinh trùng lợn trong nitơ lỏng (- 196oC)

 Nhằm thúc đẩy quá trình thương mại hóa, trao đổi giống và cải tiến chất lượng đàn lợn thương phẩm tại Việt Nam

 Nhằm bảo tồn giống lợn đực tốt có chất lượng

và nâng cao hiệu quả sinh sản của đàn lợn thương phẩm tại Việt Nam

III Nội Dung &Phương Pháp Nghiên Cứu

1 Phạm vi và đối tượng nghiên cứu

 Tinh trùng lợn đực giống ? được khai thác từ các cơ sở chăm nuôi lợn đực giống tại vùng Hà Nội, Bắc Ninh, Hưng Yên

 Tuổi của lợn đực giống ? và trọng lượng của lợn đực giống ?

 Thời gian lấy tinh ?

 Khoảng cách giữa 2 lần lấy tinh ?

 Phương pháp lấy tinh ?

2 Đánh giá chất lượng tinh trùng trước khi đông lạnh

 Lượng tinh dịch lợn (ml): Lượng

tinh dịch lợn thường được đo

băng pipet chia vạch

Lượng tinh dịch TB của lợn nội

>=100ml

Lượng tinh dịch TB của lợn ngoại

= [250,400] ml

 Nồng độ tinh trùng (10 6 /ml): Là

số lượng tinh trùng có trong 1ml

tinh dịch Phương pháp đánh giá

nồng độ tinh trùng là:

 Phương pháp buồng đếm hồng cầu

2 Đánh giá chất lượng tinh trùng

trước khi đông lạnh

2 Đánh giá chất lượng tinh trùng

trước khi đông lạnh

Sức đề kháng của tinh trùng (R): là sức đề kháng của tinh trùng trong dung dịch đẳng trương Người ta thường dùng nước muối 1%

để kiểm tra và đánh giá lượng tinh dịch cần pha loãng 1 đơn vị tinh dịch đến khi toàn bộ tinh dịch ngừng hoạt động

Mùi vị tinh trùng thường có mùi tanh Nếu tinh trùng có mùi thối khắm hay khai thì tinh trùng cũng đã nhiễm bẩn

2 Đánh giá chất lượng tinh trùng trước khi đông lạnh

 Tỷ lệ sống của tinh trùng

liên quan đến mức độ

hoạt động của tinh trùng

 Đo tỉ lệ sống của tinh

trùng dựa trên nguyên

lý nhuộm Eosin Tinh

2 Đánh giá chất lượng tinh trùng

trước khi đông lạnh

 Tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng: là tinh trùng có hình dáng khác so với tinh trùng bình thường

2 Đánh giá chất lượng tinh trùng

trước khi đông lạnh

Độ tiến của tinh trùng: được đánh giá thông qua thước Macleod.

 Mức của thước Macleod

Vạch 0: Tinh trùng Bất Động

Vạch 1: Tinh trùng di động nhưng không tiến tới

Vạch 2: Tinh trùng di động nhưng tiến tới yếu

Vạch 3: Tinh trùng di động tiến tới vừa phải

Vạch 4: Tinh trùng di động tiến tới nhanh

3 Môi trường bảo quản đông lạnh

3.1 Chất bảo quản lạnh tinh trùng

 Chất có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào của tinh trùng như ethylen glycol, propanediol (PROH), propylen glycol, glycerol, dimethylsulphoxide (DMSO)

Chất bảo quản tinh trùng không có khả năng đi qua màng tế bào: sucrose, glucose, glactose, pyrrolydine…

 Người ta thường kết hợp 2 chất bảo quản tinh trùng trên giúp cho quá trình khử nước trong tinh trùng và cân bằng áp suất trong tế bào chất của tinh trùng được diễn

ra nhanh hơn, giúp bảo vệ tinh trùng trong quá trình đông lạnh

3.2 Các chất tham gia bảo quản

đông lạnh tinh trùng

 Glucose: cung cấp năng lượng và giải độc cho tinh trùng và là chất bảo vệ lạnh cho tinh trùng

 Sodium citrate: làm chất đệm ổn định pH

 Lòng đỏ trứng gà: nhằm chống lạnh cho tinh trùng.

 Dung dịch chất bảo quản lạnh

4 Phân lập tinh trùng lợn

 Trước khi tiến hành đông lạnh tinh trùng ta nên tiến

hành phâp tách tinh trùng nhằm tách được tinh trùng

sống ra khỏi tinh trùng chết và các mảnh vỡ tế bào trong tinh dịch nhằm tăng hiệu quả bảo tồn tinh dịch.

 Phân lập tinh trùng lợn băng phương pháp swim up:

Nguyên tắc của phương pháp này là tinh dịch sẽ bơi lên phĩa trên và thoát khỏi tinh dịch bên dưới.

 Phân lập tinh trùng băng phương pháp gradient không liên tục: Phương pháp này dựa trên quá trình ly tâm thì tinh trùng khỏe sẽ bơi nhanh hơn so vơi tinh trùng chết

và các mảnh tế bào.

5.1 Phương pháp đông lạnh tinh trùng chậm

Tinh trùng tốt

A>0.7

Ly tâm Pha với môi trường Tăng dần nồng độ chất bảo quản lạnh

Giảm nhiệt độ chậm với tốc độ ? o C/ phút Đến nhiệt độ [-5 o C,-9 o C]

Giảm nhiệt độ nhanh Với tốc độ ? o C/ phút Đến nhiệt độ -80 o C

Tiến hành bảo quản Trong nito lỏng (-196 o C)

5.1.Phương pháp đông lạnh tinh trùng

chậm

• Chất bảo quản lạnh được sử dụng hiện nay là 1,2 propanediol (PROH) Với PROH, kết quả đạt được tốt nhất khi dùng kèm với sucrose để làm chất bảo quản.

• Môi trường dùng trong quy trình trữ lạnh gồm có môi trường cơ bản là môi trường đệm phosphate (PBS) bảo quản bên ngoài

5.1.Phương pháp đông lạnh tinh trùng chậm

• Từ nhiệt độ phòng xuống -70 0C: giảm 1-2 0C/phút

• Tạo mầm tinh thể: Dùng một vật kim loại nhúng vào nitơ lỏng trước khi chạm vào thành ống trữ tinh

• Giai đoạn làm lạnh chậm đến -30 0C: giảm 0,3

0C/phút

• Giai đoạn làm lạnh nhanh: giảm 30-50 0C/phút,

hoặc có thể cho trực tiếp vào nitơ lỏng

5.2 Phương pháp đông lạnh tinh trùng

băng thủy tinh hóa

• Nguyên lý của kĩ thuật thủy tinh hóa là ở môi

trường đẳng trương và nhiệt độ làm lạnh nhanh

ở -130oC trở đi thì nước sẽ hình thành dạng hạt kết tinh hay dạng hạt thủy tinh

• Phương pháp thủy tinh hóa nhằm đặt tinh trùng vào áp suất môi trường cao nhằm diến ra sự

khử nước nhanh, sau đó tiến hành đặt trực tiếp tinh trùng vào nito lỏng

5.2 Phương pháp đông lạnh tinh trùng

bằng thủy tinh hóa

Tinh trùng tốt A> 0.7

Ly tâm Pha với môi trường

Có nồng độ chất bảo quản lạnh cao

Đặt ngay tinh trùng Vào nito lỏng

5.2 Phương pháp đông lạnh tinh trùng

bằng thủy tinh hóa

• Các chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hóa gần giống như trong kỹ thuật đông lạnh chậm , nhưng nồng độ sử dụng cao hơn.

• Gồm 2 chất bảo vệ đông lạnh có khả năng thấm qua màng tế bào (ethylene glycol,propylene glycol, acetamid, glycerol, raffinose, dimethylsulphoxide (DMSO) và 1,2- propanediol (PrOH) ) để khử nước bên trong tế bào và

1 chất bảo vệ đông lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào (sucrose, trehalose, glucose và galactose ) làm đối trọng, giúp quá trình khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh hơn

5.2.1 Dụng cụ trong kỹ thuật thủy tinh hóa

• OPS (open-pulled straw): đây là một loại straw

có đường kính trong nhỏ hơn rất nhiều so với

đường kính nguyên thủy của các loại straw

0,25ml thường dùng.Lượng môi trường có chứa tinh trùng khi được hút vào trong OPS chỉ khoảng

?µl, đầu OPS chứa môi trường và tinh trùng được bảo vệ bằng 1 straw 0,5ml; đầu còn lại được gắn một nút nhựa nhằm tránh trường hợp OPS bị nổi lên bề mặt khi thả vào nitơ lỏng OPS là loại dụng

cụ được sử dụng phổ biến nhất trong kỹ thuật

đông lạnh cực nhanh hiện nay

5.2.1 Dụng cụ trong kỹ thuật thủy tinh hóa

• ryoloop: dụng cụ này bao

gồm một vòng tròn rỗng bằng

nhựa mềm, gắn với một cán

nhựa hoặc kim loại Dung dịch

thủy tinh hóa tạo thành mộp

lớp màng mỏng trong phần

rỗng của vòng tròn và tinh

trùng được đặt ngay trên lớp

màng mỏng này, sau đó toàn

bộ dụng cụ có chứa tinh trùng

được làm lạnh trong hơi nitơ

lỏng

5.2.1 Dụng cụ trong kỹ thuật thủy tinh hóa

• Cryotop: đây là loại dụng cụ chỉ mới

được phát minh trong một vài năm

gần đây (2000) nhưng được xem là

dễ sử dụng và có hiệu quả sau rã

đông cao nhất Dụng cụ bao gồm một

bản phim trong mỏng được bảo vệ

bởi một nắp nhựa, gắn với 1 cán cầm

bằng nhựa Tinh trùng được đặt trên

bề mặt bản phim với một lượng môi

trường rất nhỏ và toàn bộ mẫu được

nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng Ngoài

ưu điểm dễ thao tác, cryotop nhanh

hơn rất nhiều so với OPS, điều này

giúp tăng tỉ lệ sống của tinh trùng sau

khi rã đông tốc độ làm lạnh và rã

đông khi sử cryotp nhanh hơn

5.2.2 Ưu điểm của kỹ thuật thủy tinh hóa

• Phương pháp thủy tinh hóa có thời gian nhanh hơn và có hiệu quả kinh tế cao hơn so với kỹ thuật động lạnh chậm

• Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh cao giúp quá trinh khử nước trong kỹ thuật thủy tinh hóa diễn

ra nhanh hơn, hiệu quả hợn, tỉ lệ tinh trùng sống nhiều hơn

• Kỹ thuật thủy tinh hóa giúp bảo vệ an toàn hơn

và it gây biến đổi tinh trùng hơn so với kỹ thuật đông lạnh chậm

5.3 Quá trình giải đông tinh trùng

• Quá trình giải đông tinh trùng phụ thuộc vào quá trình đông lạnh trước đấy của nó.

• Rã đông:Với chất bảo quản lạnh là PROH với nồng độ là (?C), ống chứa tinh trùng có thể được làm rã đông bằng cách giữ trong không khí trong 30 giây, sau đó nhúng vào nước ấm 37(?) 0C trong 60(?) giây

IV Kết Quả Và Thảo Luận

1 Đặc điểm sinh học tinh trùng lợn

trước khi đông lạnh

2 Đánh giá khả năng vận động tinh trùng

lợn trong môi trường pha loãng và môi trường bảo quản lạnh

3 Đánh giá khả năng vận động tinh trùng

lợn sau khi giải đông

V Kết Luận