Nghiên cứu tổng hợp một số aurone và hoạt tính sinh học của chúng (tóm tắt)

Vì vậy, trong những nămgần đây việc tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học cao và ứngdụng chúng vào thực tế đang là một trong những hướng phát triển mạnh mẽ của hóa học hữu cơ hiện

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS NGUYỄN QUỐC VƯỢNG

2 PGS.TS NGUYỄN VĂN ĐẬU

Phản biện 1: TS Lê Nguyễn Thành

Phản biện 2: PGS TS Trần Thị Như Mai

A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Đặt vấn đề

Cùng với sự phát triển của xã hội loài người là sự phát sinh các bệnhnan y như ung thư, HIV, tiểu đường Nền y học hiện đại của nhân loạiđang đứng trước những thách thức vô cùng to lớn, và nó chỉ có thể đượcgiải quyết triệt để khi các nhà khoa học tìm ra các loại thuốc mới có khảnăng chữa trị những căn bệnh nguy hiểm trên Vì vậy, trong những nămgần đây việc tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học cao và ứngdụng chúng vào thực tế đang là một trong những hướng phát triển mạnh

mẽ của hóa học hữu cơ hiện đại

Các aurone, với khung (2-benzylidenebenzofuran-3(2h)-one) tạothành một lớp chất của các hợp chất flavonoid, chúng đóng vai trò quantrọng trong việc hình thành sắc tố màu sáng của hoa, rau quả trong tựnhiên Mặc dù những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lớp chất nàycòn hạn chế nhưng những sản phẩm tự nhiên và những hợp chất tổnghợp tương tự của chúng đã được chứng minh là các hợp chất có triểnvọng về hoạt tính sinh học cao với phổ rộng bao gồm: hoạt tính chốngung thư, hoạt tính kháng khuẩn, chống oxi hóa, và chống bệnh tiểuđường Các hợp chất aurone đã trở thành đối tượng cho các nhà khoahọc nghiên cứu tổng hợp hay phân lập nhằm tìm kiếm các hợp chất cógiá trị điều trị bệnh các bệnh hiểm nghèo hiệu quả

Để góp phần vào việc tìm kiếm các hợp chất aurones có hoạt tính sinh

học cao, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp một số aurone và hoạt tính sinh học của chúng”

2 Nhiệm vụ của luận văn

- Tổng hợp một số aurone với các nhóm thế khác nhau

- Xác định cấu trúc phân tử các chất tổng hợp được bằng phương phápphổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H NMR và 13C NMR)kết hợp kĩ thuật phổ hai chiều (COSY, HSQC và HMBC) và phổ MS

- Khảo sát hoạt tính sinh học của các aurone đã tổng hợp được với 4dòng tế bào ung thư là ung thư gan HePG2, ung thư phổi SK- LU-1,ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF7 và với tế bào thường NIH- T3.

3 Các kết quả đã thu được của luận văn

Các kết quả đã thu được:

- Đã nghiên cứu cải tiến bước tổng hợp chất trung gian chìa khóa

benzofurone (chất 5b) bằng phương pháp ngắn gọn là chỉ sử

dụng H2O trong bước thủy phân muối iminium cho sản phẩm

đóng vòng benzofuranone 5b với hiệu suất cao ( hiệu suất 41%

tương đương với phương pháp sử dụng MeONa hiệu suất 46 %)

giữa các hợp chat hydroxybenzofuranone ( chất 5b) với các hợp

chất hydroxybenzaldehyde sử dụng xúc tác HCl/ MeOH thu

được các hydroxyaurone ( chất 56, chất 76) với hiệu suất cao 52

%

- Đã sử dụng hệ xúc tác HCl/MeOH tiến hành ngưng tụ hợp chất

methoxybenzofuranone (chất18) với các hydroxybenzaldehyde

thu được các aurone với nhóm thế methoxy ở vòng A và nhóm

thế hydroxyl ở vòng B (chất 80, chất 81, hiệu suất 64 % và 77%

tương ứng); đồng thời đã ngưng tụ hydroxybenzofuranone

(Chất5b) với các methoxybenzaldehyde thu được các aurone

với nhóm thế hydroxy ở vòng A và nhóm thế methoxy ở vòng

B (chất 78, chất 79 hiệu suất 74% và 72% tương ứng) Các

phản ứng ngưng tụ trực tiếp cho hiệu suất cao

- Đã sử dụng cả 2 hệ xúc tác HCl/MeOH và NaOH/MeOH cho

phản ứng ngưng tụ giữa methoxybenzofuranone (chất18) với

các methoxybenzaldehyde thu được các methoxyaurone (chất

55 và chất 77) với các hiệu suất gần tương đương nhau Chất55

(89 % xúc tác acid; 91% xúc tác base); chất 77 (86 % xúc tácacid; 93% xúc tác base)

- Cấu trúc các hợp chất tổng hợp được đã được chứng minh bằngcác phương pháp phổ hổng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân

1 chiều, 2 chiều HSQC, HMBC và phổ khối lượng

- Đã thử hoạt tính độc tế bào của một số sản phẩm mới tổng hợpđược trên các dòng tế bào thường NIH/3T3 và 4 dòng tế bào

ung thư MCF7, LU-1, KB và HepG2 Kết quả cho thấy chất 80

và chất 77 có mức hoạt tính tốt nhất với giá trị IC50 = 34.17

-47.68 µg/ml trên các dòng tế bào nghiên cứu Các mẫu còn lại

có hoạt tính yếu, hoặc không thể hiện hoạt tính ở các nồng độnghiên cứu

B NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Trên cơ sở nghiên cứu tài liệu, phần tổng quan của luận văn trìnhbày các nội dung sau:

- Các hợp chất flavonoid

- Hoạt tính sinh học của aurone

CHƯƠNG 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

Các aurone tổng hợp: Chất 55, chất 56, chất 76, chất 77, chất 78, chất

80, chất 81

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Chương này trình bày các phương pháp sử dụng trong quá trìnhnghiên cứu bao gồm: phương pháp phân lập các hợp chất, phương pháptổng hợp hữu cơ cơ bản, phương pháp tổng hợp hữu cơ đặc thù, phươngpháp theo dõi quá trình phản ứng, phương pháp tinh chế, phương pháp

phổ xác định cấu trúc, phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro, xác định hoạt tính gây độc tế bào tế bào in vitro

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM

Sơ đồ phản ứng:

O MeO

OMe O

O HO

OMe

1

10 4

OMe O

OH

1

10 4

6

2' 3' 4'

R g

a ClCH2CN, Et2O, ZnCl2, HCl 0°C, 24 h; b 1) HCl, hồi lưu; 2) MeONa/MeOH, hồi lưu (Hiệu suất a, b: 46%); c H2O, hồi lưu (Hiệu suất a, c: 41%); d MeI/K2CO3 (69,5% - 77%); e 3,4- dihydrobenzaldehyde hoặc 4-hydroxybenzaldehyde, HCl/MeOH (52-65%);g 3,4-dimethoxybenzaldehyde hoặc 4- methoxybenzaldehyde, HCl/MeOH hoặc NaOH/MeOH, (74 %- 72%) ;h 3,4-dimethoxybenzaldehyde hoặc 4- methoxybenzaldehyde, HCl/MeOH hoặc NaOH/MeOH, (89% - 93%); m 3,4-dihydrobenzaldehyde hoặc 4- hydroxybenzaldehyde, HCl/MeOH (64%-77%).

Chất 5b

T0n/c: 252-254oC;

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6): δ (ppm) 10,54 (2H, br s, OH),5,91(2H, s, H-5, H-7), 4,55 (2H, s, C-2)

13C-NMR(125 MHz, DMSO-d 6): δ (ppm) 194,0 (C=O), 175,6 , 167,6, 157,5 (C-4, C-6, C-8), 102,7 , 96,2 , 90,1(C-5, C-7, C-9), 74,8 (C-2)

Tổng hợp 4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (18)

1H-NMR (DMSO-d 6 ): δ (ppm) 6,35 và 6,16 (2H, 2 × d, J = 1,8 Hz,

H-5 và H-7), 4,64 (2H, s, H-2), 3,85 (3H, s, OCH3), 3,82 (3H, s, OCH3)

13C-NMR (DMSO-d 6): δ (ppm) 193,9 (C=O), 176,2 , 169,1 , 158,2(C-8, C-6, C-4), 104,0 (C-9), 92,8 , 89,3 (C-5, C-7), 75,2 (C-2), 55,8 và56,2 (2 × OCH3).

3.1.2 Tổng hợp các hydroxyaurone

(Z)-2-[(3,4-

dihydroxyphenyl)methylene]-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (56) và dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (76)

= 1,5 Hz, H-7), 6,06 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-5)

13C NMR (125 MHz, DMSO-d 6): δ (ppm) 179,0 (C=O), 167,5 8), 166,9 (C-6), 158,1 (C-4), 147,4 (C-4’), 145,9 (C-2), 145,4 (C-3’), 123,9 (C-6’), 123,6 (C-1’), 117,6 (C-2’), 115,9 (C-5’), 109,6(C-10), 102,9 (C-9), 97,6 (C-5), 90,3(C-7)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ): δ (ppm) 7,74 (2H, d, J = 8,7 Hz, H-2′), 7,17 (1H, dd, , H-6′), 7,17 (1H, dd, ), 6,85 (2H, d, J = 8,7 Hz, H-3′), 7,17 (1H, dd, , H-5′), 7,17 (1H, dd, ), 6,54 (1H, s, H-10), 6,20 (1H,

d, J = 1,2 Hz, H-5), 6,06 (1H, d, J = 1,2 Hz, H-7).

13C -NMR (125 MHz, DMSO-d 6): δ (ppm) 179,2 (C=O), 167,6 , 167,2 ,158,8 , 158,3 (C-8, C-6, C-4, C-4’), 146,1 (C-2), 132,8 ( C-2’, C-6’),123,4 (C-1’), 116,0 (C-3’, C-5’), 109,2 (C-10), 102,9 , 97,7 , 90,5 (C-

5, 7, 9)

3.1.3 Tổng hợp các methoxyaurone

(Z)-2-[(3,4- 3(2H)-one (55) và (Z)-2-[(4-methoxyphenyl)methylene]-4,6- dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (77)

dimethoxyphenyl)methylene]-4,6-dimethoxy-benzofuran-Chất 55, tinh thể hình kim màu vàng , T0n/c= 169-170oC

FT-IR: νKBr (cm-1): 3010, 2946, 2840, 1690, 1603, 1514, 1421, 1250,

1099, 813, 469

ESI-MS: m/z = 343 [M + H]+

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ): δ (ppm) 7,54 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2'), 7,51 (1H, dd, J = 8,5, 1,5 Hz, H-6 '), 7,05 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5'), 6,68 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-5), 6,67 (1H, s, H-10), 6,31 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-

7), 3,90, 3,88, 3,83 và 3,82 (12H, s, 4 × OCH3),

13C-NMR (125 MH, DMSO-d 6): δ (ppm) 178,8 (C=O), 168,7,168,0 , 158,8,(C-8, C-6, C-4), 150,2 , 148,7, 146,1(C-2, C-3 ', C-4' ),124,9 (C-1'), 124,8 (C-6 '), 114,0 , 111,9, 110,2 (C-10, C-2 ', C-5'),104,2 (C-9), 94,3 , 89,8 (C-5, C-7), 56,5 , 56,1 và 55,6 (4 × OCH3)

× OCH3)

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 180,5 (C=O), 168,7, 168,6 (C-8,6), 160,5 , 159,3 (C-4, 4’), 146,7 (C-2), 132,8 (C-2’, 6’), 125,3 (C-1'),114,3 (C-3’, 5’), 110,9 (C-10), 105,4 (C-9), 93,9 , 89,1 (C -5, C-7), 56,1, 56,0 và 55,2 (3 × OCH3)

3.1.4 Tổng hợp các aurone có nhóm thế OMe ở vòng A và nhóm

thế hydroxyl ở vòng B.

Tổng hợp benzofuranone (80)

Tổng hợp benzofuranone (81).

Z-2-[(hydroxyphenyl)methyl]-4,6-dimethoxy-3(2H)-Tiến hành tương tự phản ứng ngưng tụ chất 18 với hydroxylbenzaldehyde thu được aurone 81 với hiệu suất 77%.

4-Hợp chất 81 dạng tinh thể màu vàng chanh.

FT-IR (KBr) νmax cm-1: 3305, 3015, 1682, 1616, 1583, 1517, 1443,

1264, 1215, 1152, 1099, 811, 676, 558, 481

1H-NMR(500 MHz, DMSO-d 6): δ ( ppm) 3,87, 3,90 (6H, 2 × s, 2

× CH3), 6,31(1H, d, J = 1,7 Hz, H-5), 6,63 (1H, s, CH), 6,66 (1H, d, J

= 1,7 Hz, H-7), 6,86 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5’), 7,2 (1H, dd, J = 8,4, 1,8

Hz, H-6’), 7,7 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-2’), 10,1 ( br s, 1H, 1× OH)

13C-NMR ( DMSO-d 6): δ (ppm) 56,07, 56,43 (2× CH3), 89,7, 94,2(C -5, C-7), 104,2 (C-3a), 110,4, 115,9, 123,08 (CH, C-2’, C-5’),133,02 (C-6’), 124,8 (C-1’), 145,64, 158,76( C-2, C-3’, C-4’), 159,09,167,91, 168,56 (C-4, C-6, C-7a), 178,87(CO)

13C-NMR ( DMSO-d 6): δ (ppm) 55,5 (2 × CH3), 90,5, 97,6 (C -5, 7), 102,7 (C-3a), 108,8, 111,9, 113,9 (CH, C-2’, C-5’), 124,4 (C-6’),125,0 (C-1’), 146,5, 148.6, 149,9 ( C-2, C-3’, C-4’), 158,2, 167,1, 167,5(C-4, C-6, C-7a), 178,9 (CO)

13C-NMR ( DMSO-d 6): δ (ppm) 55,2 (CH3), 90,4 , 97,6(C -5, C-7),102,7 (C-3a), 108,4, 114,5, 124,8 (CH, C-2’, C-5’), 132,4 (C-6’), 124,8(C-1’), 132,4, 146,4, 158,2( C-2, C-3’, C-4’), 160,0, 167,1, 167,6 (C-4,C-6, C-7a), 178,9(CO)

3.2 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO CỦA NHỮNG

AURONE ĐÃ TỔNG HỢP ĐƯỢC.

Khảo sát hoạt tính độc tế bào trên dòng tế bào thường NIH/3T3 và 4dòng tế bào ung thư: ung thư vú MCF7, ung thư phổi LU-1, ung thưbiểu mô KB và ung thư gan HepG2 được thực hiện tại phòng thửnghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học - Viện hàn lâm Khoa học

và công nghệ Việt Nam

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1.1 Điều chế chất trung gian chìa khóa benzofuranone

Chất trung gian chìa khóa được tổng hợp qua 2 giai đoạn

O HO

Sơ đồ tổng hợp chất trung gian 5b

a ClCH2CN, Et2O, ZnCl2, HCl 0°C, 24 h; b 1) HCl, hồi lưu; 2)MeONa/MeOH, hồi lưu (Hiệu suất a, b: 46%); c H2O, hồi lưu (Hiệusuất a, c: 41%)

Hợp chất benzofuranone 5b, là chất chìa khóa trung gian quan trọng

trong tổng hợp aurone, được tổng hợp qua 2 giai đoạn Giai đoạn đầutiên là phản ứng ngưng tụ giữa phloroglucinol và chloroacetonitriletrong sự có mặt của ZnCl2, sau đó hỗn hợp phản ứng được sục khí HCl

tạo nên muối iminium (3) (42%) Muối 3 sau đó được thủy phân đóng vòng để tạo 5b

Chất 5b là chất : 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one

Cấu trúc phân tử của hợp chất 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one

(5b) đã được xác định bởi phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C-NMR.Trên phổ 1H-NMR (thấy xuất hiện các tín hiệu singlet của 2 protonnhóm methylen (CH2) ở δH 4,55 và singlet của 2 proton thơm ở δH5,91(H-5, H-7) Ở trường thấp hơn là singlet tù của 2 proton OH ở δH

10,67

Phổ 13C-NMR của hợp chất này cũng cho 8 tín hiệu của 8 carbonphù hợp với số carbon và cấu trúc phân tử, gồm tín hiệu carbon củanhóm methylene ở δC 74,8, 2 tín hiệu của 2 carbon methine thơm ở δC

90,1 (C-7), 96,2 (C-5) và một tín hiệu của carbon thơm bậc 4 ở δC 102,7(C-9) Ở vùng trường thấp hơn là 3 tín hiệu của carbon thơm liên kếtvới oxy ở δC 157,5 (C-4), 167,7 (C-6), 175,6 (C-8) trong đó tín hiệu củaC-8 và C-6 dịch chuyển xuống trường thấp hơn do ảnh hưởng sức căngcủa vòng 5 furanone Tín hiệu của nhóm keton 3-C=O ở δC 194,0 Qua

phân tích các dữ liệu phổ cho thấy chất 5b là

4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one.

(18)

Hợp chất dihydroxybenzofuranone 5b đã được methyl hóa bằng

methyl iodide trong DMF với xúc tác K2CO3 thu được

methoxybenzofuranone (18) ở hiệu suất 77%

* 4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (18).

Sự xuất hiện thêm các tín hiệu của 2 nhóm methoxy trên phổ NMR

cho thấy dihydroxybenzofuranone 5b đã được methyl hóa Trên phổ 1NMR xuất hiện 2 singlet ở δH 3,82 và 3,85 (6H, 2 × s) của 2 nhóm

H-OCH3 gắn vào C-6 và C-4 Ở trường thấp hơn là singlet của protonmethylene vòng furanone ở δH 4,64 Ở vùng trường thơm có 2 tín hiệu

doublet của hai proton thơm meta H-5 và H-6 ở δ H 6,16 và δH 6,35 với

Jmeta = 1,5 Hz Phổ 13C-NMR (phụ lục 3) cho 10 tín hiệu carbon phù hợpvới số carbon của phân tử Tín hiệu của 2 carbon methyl liên kết vớioxy (OCH3) ở δC 55,9 và δC 56,2, tiếp theo là tín hiệu của carbonmethylene ở δC 75,3 (C-2) Ở vùng trường thơm là tín hiệu của 6 carbonthơm gồm 3 carbon thơm liên kết với oxy ở δC 176,3 (C-8), 169,2 (C-6),158,2 (C-4), 2 carbon methine ở δC 91,9 (C-5), 89,4 (C-7) và 1 carbonthơm bậc 4 ở δC 104,1 (C-9) Tín hiệu của nhóm keton 3-C=O ở δC

194,0 Qua phân tích các dữ liệu phổ cho thấy chất 18 là

Trong môi trường base cơ chế của phản ứng ngưng tụ xảy ra qua cácbước sau :

1, Đề proton hóa nguyên tử hydrogene hoạt động bên cạnh nhómketon để hình thành một enolate cộng hưởng bền

2, Enolate hình thành đóng vai trò tác nhân nucleophile tấn công vàocarbon dương điện trong nhóm aldehyde tạo thành hợp chất ngưng tụtrung gian

3, Dưới tác dụng của base hợp chất trung gian này loại đi một phân

tử nước cung cấp aurone tương ứng

Trong môi trường acid các nhóm carbonyl C=O của cả benzofuranone

và hợp chất benzaldehyde đều được hoạt hóa Hợp chất benzofuranoneđược hoạt hóa hình thành cấu trúc enol Giống như enolate trong môi

trường kiềm, enol đóng vai trò của 1 tác nhân nucleophile tấn công vàocarbon dương điện trong nhóm CHO đã được hoạt hóa hình thành nênhợp chất ngưng tụ trung gian Trong môi trường acid hợp chất ngưng tụtrung gian cũng loại đi một phân tử nước hình thành nên sản phẩmngưng tụ aurone tương ứng.

(Z)-2-[(3,4-hydroxyphenyl)methylene]-4,6dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (56)

Các số liệu phổ của hợp chất 56 phù hợp với cấu trúc phân tử và số

liệu phổ của nó đã được công bố trong tài liệu [12] Phổ NMR cho cấutrúc phân tử khung aurone với 3 vòng A, B và C Trên phổ 1H-NMR

của chất 56 ở vùng trường thơm cho 5 tín hiệu của 5 proton methine

thơm thuộc 2 vòng thơm A và B gồm 3 tín hiệu proton thơm hệ ABXcủa vòng B ở δH 7,38 (d, J = 2,0 Hz, H-2’), 7,17 (dd, J = 2,0 và 8,5 Hz, H-6’), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, H-5’) và 2 cặp doublet của 2 proton thơm

meta ở δH 6,17 (H-7), 6,06 (H-5) với hằng số tương tác J meta = 1,5 Hz,ngoài ra còn một singlet của proton methine olefine H-10 ở δH 6,44 cho

123,7,(C-6’), 117,6 (C-2’), 115,6 (C-5’), 97,6 (C-5) và δC 90,3 (C-7).Trong vùng trường thơm còn 1 tín hiệu của carbon olefine liên kết vớioxy ở δC 145,9 (C-2) của vòng C và 1 tín hiệu của carbon olefine ở δC

109,6 (C-10); hai carbon thơm bậc 4 ở δC 123,9 (C-1’) và δC 102,9 9) Ngoài ra vòng C còn cho 1 tín hiệu ở vùng trường thấp của carboncarbonyl ở 179,0 (3-C= O) và 1 carbon olefin bậc 4 liên kết với oxy ở

(C-δC 145,9 (C-2) Kết hợp phổ HSQC (phụ lục 5) cho các tương tác C-Htrực tiếp và phổ HMBC cho các tương tác xa của proton methine olefine