Tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết rễ cỏ xước (achyranthes aspera l ) và lá sầu đâu (azadirachta indica a ) lên vi khuẩn edwardsiella ictaluri và aeromonas hydrophila

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ NGÀNH: 52620301 TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT RỄ CỎ XƯỚC Achyranthes aspera

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ

KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

MÃ NGÀNH: 52620301

TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT RỄ CỎ

XƯỚC (Achyranthes aspera L.)

VÀ LÁ SẦU ĐÂU (Azadirachta indica A.) LÊN VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri và Aeromonas

hydrophilla

Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Hoàng Dung

MSSV: 1153040014

Cần Thơ, 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ

KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

MÃ NGÀNH: 52620301

TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT RỄ CỎ XƯỚC

(Achyranthes aspera L.) VÀ LÁ SẦU ĐÂU (Azadirachta indica A.) LÊN VI KHUẨN Edwardsiella

ictaluri và Aeromonas hydrophilla

Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện

PGS.TS Nguyễn Văn Bá Nguyễn Thị Hoàng Dung

XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Luận văn: Tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết rễ cỏ Xước (Achyranthes aspera L.)

và lá Sầu đâu (Azadirachta indica A.) lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và

Ths Trần Ngọc Huyền

LỜI CẢM TẠ

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô Trần Ngọc Huyền và Thầy Nguyễn Văn Bá

đã chỉ bảo và hướng dẫn tận tình cho em những kiến thức cũng như các kỹ năng trong thời gian thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn tất cả quý Thầy Cô Khoa Sinh học ứng dụng – Trường Đại học Tây

Đô đã tận tình dạy bảo, truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này, những kiến thức của Thầy Cô truyền đạt là hành trang giúp em cố gắng thêm và tiếp tục phấn đấu để giúp em trong cuộc sống sau này

Cuối cùng, xin bày tỏ lòng tri ân đến gia đình, bạn bè cùng tập thể lớp Nuôi trồng Thuỷ sản 6 đã giúp đỡ, động viên trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài Xin chân thành cảm ơn

TÓM TẮT

Đề tài “Tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết rễ cỏ Xước (Achyranthes aspera L)

và lá Sầu đâu (Azadirachta indica A.) lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và

Aeromonas hydrophila” được thực hiện nhằm tìm ra loại thảo dược có tính chất

đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila Kiểm tra

tính kháng của 2 loại thảo dược rễ cỏ Xước và lá Sầu đâu bằng phương pháp đục lỗ

thạch với vi khuẩn chỉ thị là Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila Kết quả cho thấy 2 loại dịch chiết thảo dược đều có tính kháng khuẩn đối với Edwardsiella

ictaluri và Aeromonas hydrophila, thể hiện qua giá trị trung bình đường kính vòng

kháng khuẩn Dịch chiết rễ cỏ Xước được chiết xuất bằng cách ngâm với cồn 70% ở

tỷ lệ 1:1 có tác dụng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri với đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất là 3,3 mm, đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila dịch chiết

rễ cỏ Xước không có tác dụng kháng khuẩn Dịch chiết lá Sầu đâu ngâm với cồn 70% và đun với cồn 70% ở tỷ lệ 1:1 đều có tác dụng kháng cả 2 loại vi khuẩn,

dịch chiết ngâm với cồn 70% cho khả năng kháng cao hơn (Edwardsiella ictaluri là 6

mm, Aeromonas hydrophila là 13,6 mm)

Từ khoá: cỏ Xước, lá Sầu đâu, đường kính vòng kháng khuẩn, Edwardsiella ictaluri,

Aeromonas hydrophila

MỤC LỤC

DANH SÁCH HÌNH ix

DANH SÁCH BẢNG x

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Cây cỏ Xước (Achyranthes aspera L.) 3

2.2 Cây Sầu đâu (Azadirachta indica A.) 4

2.3 Tổng quan về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 6

2.3.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 6

2.3.2 Điều kiện sống và gây bệnh 7

2.3.3 Dấu hiệu bệnh lý 7

2.3.4 Sự phân bố, khả năng gây bệnh và sự lan truyền bệnh Edwardsiella ictaluri trên cá .7

2.4 Tổng quan về vi khuẩn Aeromonas hydrophila 8

2.4.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 8

2.4.2 Điều kiện sống và gây bệnh 8

2.4.3 Dấu hiệu bệnh lý 9

2.4.4 Sự phân bố, khả năng gây bệnh và sự lan truyền bệnh Aeromonas hydrophila 9

2.4.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng các loại thảo dược trong phòng trị bệnh trên động vật thủy sản 9

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 12

3.1.1 Thời gian 12

3.1.2 Địa điểm 12

3.2 Vật liệu, dụng cụ và hóa chất 12

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 12

3.2.2 Dụng cụ, hóa chất 12

3.3 Phương pháp nghiên cứu 12

3.3.1 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 12

3.4 Bố trí thí nghiệm 14

3.4.1 Thí nghiệm với rễ cỏ Xước 14

3.4.2 Thí nghiệm với lá Sầu đâu 14

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 15

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16

4.1 Thí nghiệm với rễ cỏ Xước 16

4.1.1 Khả năng kháng Edwardsiella ictaluri của rễ cỏ Xước 16

4.1.2 Khả năng kháng Aeromonas hydrophila của rễ cỏ Xước 18

4.2 Thí nghiệm với lá Sầu đâu 19

4.2.1 Khả năng kháng Edwardsiella ictaluri của lá Sầu đâu 19

4.2.2 Khả năng kháng Aeromonas hydrophila của lá Sầu đâu 21

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 23

5.1 Kết luận 23

5.2 Đề xuất 23

TÀI LIỆU THAM KHẢO 24

PHỤ LỤC A 27

PHỤ LỤC B 28

PHỤ LỤC C 33

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Hình thái bên ngoài của rễ cỏ Xước……… ………….……….2

Hình 2.2 Hình thái bên ngoài của lá Sầu đâu……… ………….……… 3

Hình 2.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri……….……… ……5

Hình 2.4 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila có một tiêm mao….……… 7

Hình 4.1 Vòng kháng khuẩn của dịch chiết rễ cỏ Xước đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri……….15

Hình 4.2 Vòng kháng khuẩn của dịch chiết cỏ Xước đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila……….17

Hình 4.3 Vòng kháng khuẩn của dịch chiết lá Sầu đâu đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri……….………18

Hình 4.4 Vòng kháng khuẩn của dịch chiết lá Sầu đâu đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila……… 20

Bảng 4.1 Khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri của cỏ Xước với nước cất

ngâm, nước cất đun, cồn 70% ngâm, cồn 70% đun………… ……… 15

Bảng 4.2 Khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của cỏ Xước với nước

cất ngâm, nước cất đun, cồn 70% ngâm, cồn 70% đun………… ……….17

Bảng 4.3 Khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri của lá Sầu đâu với nước

cất ngâm, nước cất đun, cồn 70% ngâm, cồn 70% đun ………… ……….18

Bảng 4.2 Khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của lá Sầu đâu với nước

cất ngâm, nước cất đun, cồn 70% ngâm, cồn 70% đun………… ……… 20

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu

Ở Việt Nam việc sử dụng thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản (NTTS) đã đóng góp một phần không nhỏ trong phòng và trị một số bệnh do tác nhân vi khuẩn gây ra Tuy nhiên việc sản xuất, sử dụng và quản lý thuốc, hoá chất dùng trong nuôi trồng thuỷ sản có rất nhiều hạn chế Hơn thế nữa phần lớn các nông dân tham gia NTTS chưa hiểu được hết những hạn chế do thuốc kháng sinh gây ra Vì vậy, họ áp dụng công nghệ nuôi sử dụng thuốc chữa bệnh, hoá chất một cách tuỳ tiện, tràn lan, điều đó ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển bền vững của NTTS Chính vì thế cần

có biện pháp tốt để vượt qua những rào cản này (Chu Viết Luân, 2003)

Những năm gần đây xu hướng sử dụng thảo dược để phòng và trị bệnh trên động vật thủy sản được xem như một giải pháp có độ an toàn cao trong bảo quản, điều trị

bệnh nấm và vi khuẩn gây ra trên động vật thủy sản (Nguyễn Ngọc Phước và ctv., 2007) Huỳnh Kim Diệu (2011) sử dụng bột lá Hoàng ngọc (Pseuderanthemum

palatiferum) để tăng sức đề kháng và giúp cá tăng trọng tốt hơn, Bùi Quang Tề

(2006), phối hợp dịch chiết từ Tỏi (Allium sativum) và Sài đất (Weledia

calendulacea) để tăng cường hệ miễn dịch cho cá tra chống mầm bệnh xuất huyết

do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra Tuy nhiên việc nghiên cứu và cho ra đời

các loaị sản phẩm thuốc từ thảo dược có tác dụng phòng và trị bệnh cho động vật thuỷ sản nói riêng thì còn rất nhiều khiêm tốn Nghiên cứu và sử dụng kháng sinh thảo dược đã thực sự có những lợi ích thiết thực ví như chi phí thấp, dễ sử dụng, không gây hại đến môi trường nuôi cũng như môi trường xung quanh, tạo ra sản phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm, người nông dân có thể tìm kiếm ngoài tự nhiên hoặc có thể tự trồng được Chính vì vậy hiện đã có rất nhiều nước trên thế giới quan tâm nghiên cứu ứng dụng thảo dược vào trong lĩnh vực nuôi trồng thuỷ sản

Từ đó, đề tài “Tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết rễ cỏ Xước (Achyranthes

aspera L.) và lá Sầu đâu (Azadirachta indica A.) lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila” được thưc hiện

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Nhằm đánh giá khả năng kháng vi khuẩn của dịch chiết rễ cỏ Xước và lá Sầu đâu

lên 2 loại vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila

1.3 Nội dung nghiên cứu

Tách chiết dịch chiết rễ cỏ Xước và lá Sầu đâu với dung môi với tỷ lệ khác nhau và theo 2 phương pháp ngâm hoặc đun

Kiểm tra tính kháng của 2 loại thảo dược rễ cỏ Xước và lá Sầu đâu bằng phương

pháp đục lỗ thạch với vi khuẩn chỉ thị là Edwardsiella ictaluri và Aeromonas

hydrophila

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Cây cỏ Xước

Đặc điểm phân loại

Theo Tôn Nữ Liên Hương và ctv., 2011 Cây cỏ Xước được phân loại như sau:

Bộ: Caryophyllales

Họ: Amaranthaceae (Rau dền)

Chi: Achyranthes

Loài: Achyranthes aspera L

Hình 2.1 Hình thái bên ngoài của cây cỏ Xước

(Nguồn: http://caythuoc.org/cay-co-xuoc.html)

Tên thông thường: cỏ Xước, Ngưu tất nam

Cỏ Xước là loại cây thân thảo, cao gần 1 m, có lông mềm, thân cứng, phình lên ở những mấu Lá mọc đối, hình trứng hay mũi mác, nhẵn hoặc hơi có lông, đầu tù hoặc nhọn, dày 3 – 12 cm, cuống lá dài Cụm hoa mọc thành bông đơn ở ngọn thân, dài 20 – 30 cm, lá bắc con hình gai, hoa mọc rủ xuống áp sát vào cuốn Quả nang, nhọn thành gai dễ mắc vào quần áo khi đụng phải, vỏ rất mỏng, dính vào hạt, hạt hình trứng dài, dày 1 mm Mùa hoa quả tháng 7–12

Trong cây cỏ Xước chứa các chất có tính dược lý cao: ancaloid, tanin trong lá, cành, thân cao hơn rễ, ngược lại hàm lượng saponin rễ cao hơn thân, cành, lá

Cỏ Xước phân bố rải rác ở hầu hết các tỉnh vùng đồng bằng, trung du tại Việt Nam, ngoài ra có ở Lào, Campuchia, Thái Lan, Ấn Độ, Trung Quốc và một số nước khác

Cỏ Xước có vị đắng, chua, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, tiêu viêm, lợi tiểu Người ta đã biết là chất saponin trong rễ có tác dụng phá huyết và làm vón albumin

Cỏ Xước còn có tác dụng chống viêm tốt ở cả giai đoạn mãn tính và cấp tính

Ở Ấn Ðộ người ta cho rằng cây có tính lọc máu, lợi tiểu, nước sắc rễ làm săn da

Trong y học cổ truyền Trung Quốc, cỏ Xước được dùng để điều trị nhức đầu, cảm nắng, sốt rét, sỏi niệu, viêm thận mãn tính

Ở Việt Nam, cây thuốc này đã được sử dụng để điều trị một số bệnh cho con người như sổ mũi, quai bị, viêm gan, viêm thận, thấp khớp Ngoài ra, cũng đã có nghiên cứu bào chế sử dụng cỏ Xước để phòng và trị bệnh cho gia súc (heo) (theo Phạm Quang Trung, 2008)

2.2 Cây Sầu đâu

Đặc điểm phân loại

Theo Hutchinson J, 1975 Cây Sầu đâu được phân loại theo khóa sau:

Bộ: Rutales (bộ cam)

Họ: Meliaceae (họ xoan)

Chi: Melieae

Loài: Azadirachta indica A

Hình 2.2 Hình thái bên ngoài của cây Sầu đâu

(Nguồn: tự chụp)

Tên gọi khác: Sầu đâu, Xoan Ấn Độ, Xoan ăn gỏi

Sầu đâu là loại cây thường xuân, tán lá rộng, chiều cao trung bình từ 13 đến 20m, cây trưởng thành có thể cao 30m, chu vi 2,5m Nhánh cây trải rộng có thể vươn dài đến 10m Vào những mùa khô hạn, lá cây vẫn xanh tươi ngoại trừ bị rụng vào mùa thu Đặc điểm của lá: lá có dạng xẻ, lá kép lông chim lẻ, dài 20 – 38 cm, mọc nhiều phía đầu nhánh, so le, dạng mác, xẻ răng cưa sâu và sắc cạnh, nhẵn cả trên hai bề mặt, cân đối hai bên, nhọn, cuống rất ngắn Lá thường xanh tốt quanh năm, không

có thời kỳ rụng lá Kiểu phát hoa: hoa mọc ở nách lá, thường mọc thành cụm, hoa

có 5 cánh, cuống hoa ngắn, có màu trắng và mùi dễ chịu Hoa lưỡng tính, có dạng mác nhỏ, lá bắc rụng sớm Đài hoa có phủ lớp lông mịn bên ngoài, có 5 thùy ở phần nửa thấp, các thùy xếp lớp dạng trứng hoặc tròn, có lông mịn nhỏ Hoa có 5 cánh tràng, mọc xếp lớp, có dạng trứng ngược hoặc dạng thuôn, có lớp lông mịn phủ bên ngoài Ở nước ta, cây thường ra hoa từ tháng 3 đến tháng 5

Vỏ cây: cây có vỏ dày trung bình, có các mấu nhỏ phân tán giữa các rãnh dọc và các rãnh nghiêng nhăn nheo, vỏ có màu xám đậm bên ngoài và màu đỏ lợt bên trong Vỏ cây thay đổi về hình dạng và độ dày tùy theo tuổi của cây cũng như theo điều kiện môi trường và khí hậu Vỏ của các nhánh nhỏ có màu xanh lợt, mềm và trơn, đôi khi có các vân dọc màu xanh Vỏ cây có mùi giống mùi tỏi và hơi đắng

Hệ thống rễ gồm rễ cọc ngắn và nhiều rễ bên mọc ngang khá dài Cấu trúc bên trong

và hình dạng bên ngoài của rễ thường giống nhau ở tất cả các loại rễ Tuy nhiên, độ dày và mức độ cứng của phần vỏ bên ngoài cũng như kết cấu của gỗ thay đổi tương ứng theo tuổi của rễ và thành phần của đất Quả phát triển và chín trong vòng một đến hai tháng, quả được thu hoạch tốt nhất vào lúc quả chuyển sang màu vàng nhạt hay vàng xanh, tốt nhất nên thu hái trực tiếp từ cây vì hạt thường giảm chất lượng khi quả rụng xuống đất Hạt gồm vỏ và nhân hạt, một hạt có từ 1 đến 3 nhân Nhân hạt chứa nhiều hợp chất có khả năng phòng trị nhiều loài dịch hại, đặc biệt là azadirachtin

Tất cả các bộ phận của cây chứa một chất dầu đắng và acid margosic Hạt chứa tới 4,5% dầu, dầu này chứa các chất đắng nimbin, nimbinin và nimbidin; nimbidin là hoạt chất chứa sulfur Cụm hoa chứa một glucosid nimbosterin (0,005%) và 0,5% tinh dầu, nimbosterol, nimbecetin và acid béo Hoa chứa một chất đắng, một chất dầu kích thích đắng Quả chứa một chất đắng bakayamin Vỏ thân chứa 0,04% nimbin, 0,001% nimbinin và 0,4% nimbidin, 0,02% tinh dầu Rễ cũng chứa chất đắng Trong phân tử của chất đắng nimbin, có một acetoxy, một lacton, một ester, một methoxy và một nhóm aldehyd

Sầu đâu được xem là có nguồn gốc ở vùng Assam và Burma thuộc Ấn Độ Tuy nhiên, nguồn gốc chính xác của nó vẫn chưa được biết, một số người cho rằng Sầu đâu sống tự nhiên ở vùng tiểu lục địa Ấn Độ, những người khác lại cho rằng nó thuộc vùng khô hạn trên toàn khu vực Nam Á, Đông Nam Á bao gồm Sri Lanka, Thái Lan, Malaysia, Indonesia và Việt Nam (Dennis Dearth, 1992) và (Gunasena, 1998)

Từ cây Sầu đâu, người ta đã chiết xuất ra rất nhiều hợp chất có khả năng phòng trừ nhiều loài côn trùng, bên cạnh đó, chúng còn được dùng để làm thuốc sát trùng, thuốc giảm đau, mỹ phẩm…và nhiều ứng dụng thực tiễn khác Cho đến nay, người

ta đã chứng minh là Sầu đâu có khả năng ức chế hơn 400 loài dịch hại, bao gồm: côn trùng, nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng

Trong đó, azadirachtin, nimbin, salannin, nimbidin là những hoạt chất sinh học có tác dụng phòng trị côn trùng, được chiết chủ yếu từ hạt của Sầu đâu (Dennis, 1992; Gupta và Sharma, 1998)

Ở Ấn Độ các thầy thuốc dùng lá Sầu đâu để chữa các bệnh ngoài da, ngứa và sốt, đặc biệt là sốt rét Lá cũng dùng để sắc uống hay thoa ngoài da cho tất cả các dạng nhiễm nấm hay nhiễm trùng khác Một bác sĩ dùng dịch chiết đậm đặc lá Sầu đâu để trị chứng ngứa nghiêm trọng, và các bệnh đường ruột liên hệ đến nấm Candida và những bệnh nấm khác Ngoài ra, ở Việt Nam Sầu đâu được sử dụng để điều trị một

số bệnh như bệnh vảy nến, chàm, trị mụn Trong nuôi trồng thủy sản ở một số trại sản xuất giống, người ta đã sử dụng chiết xuất của cây Sầu đâu để xử lý nước, hoặc trộn vào thức ăn để ngăn ngừa bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra

2.3 Tổng quan về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Bộ: Enterobacteriales

Họ: Enterobacteriaceae

Giống: Edwardsiella

Loài: Edwardsiella ictaluri

Hình 2.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri nhuộm Gram

(Nguồn: tự chụp)

2.3.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Vi khuẩn Edwardstella ictaluri là loài vi khuẩn Gram âm, hình que mảnh, kích

thước 1 x 2 – 3µm, không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy tiện Di động yếu hoặc không di động Catalase dương tính, oxidase âm tính và lên men glucose, không sinh ra H2S và Indole âm tính Vi khuẩn E ictaluri phát triển trên môi trường

TSA chậm 36 – 48 giờ ở nhiệt độ 28 – 300C (Từ Thanh Dung, 2005)

2.3.2 Điều kiện sống và gây bệnh

Theo Từ Thanh Dung (2005) bệnh bắt đầu xuất hiện vào tháng 5 và phát triển mạnh nhất vào khoảng tháng 7 đến tháng 10 rồi giảm xuống ở các tháng còn lại Đặc biệt bệnh mủ gan xuất hiện vào thời gian lũ về là cao nhất với tỉ lệ 87,8% số hộ nuôi cá ghi nhận ở An Giang (Trần Anh Dũng, 2005) Lê Thị Bé (2002) cũng cho rằng bệnh xuất hiện mạnh vào mùa lũ trong năm, nước đục mang nhiều phù sa, chất lượng nước biến động, đồng thời nước chảy mạnh cá dễ bị sốc, giảm khả năng đề kháng đối với mầm bệnh vì vậy bệnh dễ dàng bộc phát

Theo Lương Trần Thục Đoan (2006), nhiệt độ nước dao động trong khoảng 260C –

280C là điều kiện tốt cho vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá, khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri trên cá ở nhiệt độ khoảng 27,5 ± 0,80C đã kết luận mật độ vi khuẩn 1×106 CFU/ml và 1×105 CFU/ml có độc lực đủ mạnh để gây chết

cá

2.3.3 Dấu hiệu bệnh lý

Cá bị bệnh không có những dấu hiệu bất thường bên ngoài, ở giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi Tuy nhiên ở giai đoạn này nếu không phát hiện sớm và môi trường nuôi quá bẩn thì bệnh cá sẽ trở nên trầm trọng hơn và rất khó khăn trong điều trị Khi bị bệnh, cá có biểu hiện gầy, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn Bên trong nội quan (gan, thận, tỳ tạng) xuất hiện những đốm trắng đường kính từ 1 – 3 mm các cơ quan này sưng to và có hiện tượng

nhũn ở thận (Từ Thanh Dung và ctv., 2004)

2.3.4 Sự phân bố, khả năng gây bệnh và sự lan truyền bệnh Edwardsiella

ictaluri trên cá

Vi khuẩn E ictaluri gây bệnh xuất huyết được phân lập lần đầu tiên trên cá Nheo

Mỹ (Ictalurus puntatus) bởi Hawke, 1979

Năm 1985, Boonyaratpalin cũng đã phát hiện E ictaluri gây bệnh trên cá trê trắng (Clarias batrachus) và trong môi trường nước ở Thái Lan (Trích dẫn bởi Từ Thanh

Dung, 2004) Ngoài ra, mầm bệnh này cũng được công bố ở hầu hết Bắc Mỹ và các

tiểu bang khác như Indiana, Idaho, California, Arizona và New Mexico (Inglis et al,

1994)

Ở Việt Nam, bệnh trắng gan hay còn gọi là bệnh mủ gan được ghi nhận lần đầu tiên xuất hiện trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 với tên gọi BNP (Bacillary Necrosis of Pangasius) và trở nên trầm trọng vào năm 1999 (Ferguson et al, 2001) Theo Brown và Cratzek (1980), mật độ ương nuôi cao sẽ làm tăng khả năng tiếp xúc giữa ký chủ và mầm bệnh Do đó, tình hình dịch bệnh ngày càng tăng với nhiều dạng bệnh khác nhau và nguyên nhân gây bệnh ngày càng phức tạp hơn Theo Từ

Thanh Dung (2004) khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao từ 10 – 90% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi Đồng thời trên gan, thận và tỳ tạng xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1-3 mm, bên trong chứa dịch màu trắng đục nên người dân thường gọi là bệnh mủ gan, không có những biểu hiện bất thường bên ngoài

2.4 Tổng quan về vi khuẩn Aeromonas hydrophila

Bộ: Aeromonadales

Họ: Aeromonadaceae

Giống: Aeromonas

Loài: Aeromonas hydrophila

Hình 2.4 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila nhuộm Gram

(Nguồn: tự chụp)

2.4.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Aeromonas hydrophila là một loài vi khuẩn Gram âm dị dưỡng, hình que chủ yếu

được tìm thấy trong các khu vực có khí hậu ấm áp Vi khuẩn này có thể được tìm thấy trong nước ngọt hoặc nước lợ Nó có thể tồn tại trong môi trường hiếu khí và

kỵ khí, có thể tiêu hóa các vật liệu như gelatin và hemoglobin Aeromonas

hydrophila được phân lập từ người và động vật trong những năm 1950 Nó có khả

năng chống thuốc kháng sinh phổ biến nhất Vi khuẩn này có thể xuất hiện ở những vùng nước bẩn, nước bùn, cống rãnh

2.4.2 Điều kiện sống và gây bệnh

Ở Châu Âu, bệnh do A hydrophila gây bệnh trên cá chình, thường xuất hiện vào

mùa xuân – hè, nhiệt độ nước khoảng 170C – 220C, khoảng nhiệt độ này cũng được

cho là khoảng nhiệt độ để vi khuẩn này phát triển (Esteve et al., 1993)

Báo cáo của Rahman et al, 2000 cũng cho rằng vi khuẩn A hydrophila có độc lực

cao nhất ở 170 C (LD 50 = 106,03 CFU/ml) và 250C (102 CFU/ml) khi tác giả gây

cảm nhiễm trên cá vàng (Carassius auratus) Ngoài ra, theo điều tra của Trần Anh

Dũng (2005), vào thời gian lũ rút thì các hộ nuôi cá tra ao ghi nhận bệnh xuất huyết xuất hiện cao nhất với 85,4%

2.4.3 Dấu hiệu bệnh lý

Theo Bùi Quang Tề (2006) cá bị nhiễm A hydrophila có biểu hiện chung là da

thường đổi màu tối, không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện các đốm xuất huyết đỏ trên thân, các gốc vây, quanh miệng, xuất huyết hậu môn, mắt lồi đục Ở

cá tra và cá basa, xoang bụng xuất huyết, mô mỡ xuất huyết nặng, gan tái nhợt, mật sưng to, thận sưng, ruột, dạ dày, bóng hơi đều xuất huyết, xoang bụng chứa nhiều

dịch nhờn mùi hôi thối, cá trê giống bị bệnh thường tách đàn

2.4.4 Sự phân bố, khả năng gây bệnh và sự lan truyền bệnh Aeromonas

hydrophila

Vi khuẩn A hydrophila tồn tại trong những hệ thống nuôi thủy sản trên toàn cầu,

điều này thể hiện cho sự thích ứng của vi khuẩn trong môi trường nước Nó là nguyên nhân gây sự hư thối trên thực phẩm tươi sống bao gồm cả cá và hải sản Vi

khuẩn A hydrophila hiện diện trong môi trường nước chảy nhiều hơn trong môi

trường nước

Bệnh cá là một trong những nhân tố gây rủi ro trong ngành nuôi trồng thủy sản quy

mô công nghiệp với sự thất thoát hàng tỷ đô la (Boulanger et al., 1977) Sự lây nhiễm A hydrophila là hậu quả của việc nuôi cá nước ngọt trên những khu vực có khí hậu ấm áp (Torres et al., 1990) đặc biệt là ở Trung Quốc và Ấn Độ (Karunasagar et al., 1989) Đây cũng là tác nhân gây bệnh quan trọng cho những người tiêu thụ các sản phẩm cá và giáp xác bị nhiễm A hydrophila (Vivekanandhan

nguyên thủy hay được chế biến” (Nguyễn Ngọc Phước và ctv, 2007; Phạm Thiệp,

Vũ Ngọc Thuý, 2001; Bùi Quang Tề và ctv, 2006.)

Hiện nay việc chữa bệnh cho tôm, cá bằng thảo dược đang trở thành xu hướng của giới nuôi trồng thuỷ sản, khắc phục tình trạng lệ thuộc vào dùng hóa chất, kháng

sinh phòng trị bệnh cho cá nuôi, tiến tới phát triển nuôi theo hướng tạo sản phẩm bảo đảm an toàn thực phẩm, tiết kiệm kinh tế, dễ thực hiện, bảo vệ môi trường đồng thời nâng cao sản lượng xuất khẩu theo đúng tiêu chuẩn

2.4.5.1 Tình hình nghiên cứu thảo dược trong phòng trị bệnh ở động vật thủy sản trên thế giới

Theo kinh nghiệm dân gian, có khá nhiều loại cây thuốc nam, thảo mộc đã và đang được sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản như lá xoan, tỏi, cây chó đẻ răng cưa, hạt cau, hạt bí ngô… Mỗi một loại có tác dụng khác nhau trong việc phòng và trị bệnh, một số cây có ưu thế trong việc phòng trị bệnh do tác nhân gây bệnh là ký sinh trùng và một số cây có ưu thế phòng trị bệnh nhiễm khuẩn Hợp chất có trong thảo dược rất phong phú, chúng được chia thành các nhóm trong đó bao gồm kháng sinh thực vật (phytocide) có tác dụng diệt khuẩn cũng như hạn chế sự sinh trưởng của các loại vi khuẩn Trong báo cáo “Sử dụng kháng sinh thảo mộc phòng và chữa trị một số bệnh nhiễm khuẩn trong nuôi động vật thủy sản”, Nguyễn Thị Vân Thái và

ctv đã trình bày về khả năng sử dụng y dược y học cổ truyền trong phòng và chữa trị

một số bệnh nhiễm khuẩn cho tôm cá, động vật thân mềm… thay thế các thuốc kháng sinh hiện đang phổ biến trên thị trường Các tác giả đã đưa ra phương pháp phòng bệnh bằng thức ăn bổ trợ có tác dụng tăng cường sức đề kháng của động vật thuỷ sản

Trong một nghiên cứu vào năm 2006, Nguyễn Viết Khuê và ctv cho thấy trong số

những người được phỏng vấn có 41,33% người nuôi sử dụng thảo dược, phổ biến là tỏi và lá xoan, 15% dùng không hiệu quả, 85% đạt hiệu quả từ ít đến nhiều Việc nghiên cứu thành phần các hợp chất có trong thảo mộc là cơ sở nghiên cứu cho ra các sản phẩm thuốc ứng dụng phòng trị bệnh động vật thủy sản nói riêng Thành phần thuốc bao gồm các cây thuốc có kháng sinh thực vật (tỏi, sài đất, nhọ nồi, cỏ sữa, chó đẻ răng cưa….), vitamin và một số vi lượng khác Thuốc được nghiền thành bột, có mùi đặc trưng của tỏi Thuốc có tác dụng phòng và trị bệnh nhiễm khuẩn như đốm đỏ, thối mang, viêm ruột của cá nuôi lồng hoặc nuôi ao Bên cạnh

đó một số tác giả cho rằng khi cá có dấu hiệu ban đầu của bệnh nhiễm khuẩn có thể trị bằng cách cho tỏi (0,5 kg tỏi/100 kg cá) và bổ sung 0,3% muối ăn trong thức ăn viên cho cá ăn, hiệu quả đạt được rất tốt (Võ Thị Cúc Hoa và Thái Bá Hồ (1980)

Năm 2007, Nguyễn Ngọc Phước và ctv đã tiến hành nghiên cứu sử dụng lá trầu

không để trị bệnh do nấm, vi khuẩn gây ra trên đối tượng nuôi động vật thuỷ sản Bước đầu đã có kết quả tốt ở quy mô phòng thí nghiệm Gần đây nhất (2008), Trương Thị Mỹ Hạnh và ctv đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch triết lá trầu và cũng đạt được những kết quả nhất định.Tuy nhiên đó mới chỉ là những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

2.4.5.2 Tình hình nghiên cứu thảo dược trong phòng trị bệnh ở động vật thủy sản tại Việt Nam

Năm 1995, Hà Ký cùng cộng sự đã nghiên cứu một số loài thảo dược dùng để phòng trị bệnh trên cá trắm ở Miền Bắc Bước đầu chọn được 9 loài cây thuốc: rau

nghể (Polygonum hydropiper), rau sam (Portulaca cleracea), cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta), cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolis), sài đất (Wedelia calendu

lacae), nhọ nồi (Eclipta alba), bồ công anh (Lactuca indica), cây vòi voi

(Heliotropium indicum) và cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria) có thể sử dụng trong phòng trị bệnh đốm đỏ ở cá trắm cỏ (Hà Ký và ctv., 1995)

Năm 2000, Nguyễn Ngọc Hạnh cùng cộng sự tiến hành nghiên cứu thử nghiệm thành công các hợp chất chiết xuất từ thảo dược, như Hepato, Alixin với tác dụng hỗ trợ tiêu hoá tốt, giúp tôm khoẻ mạnh, sinh trưởng bình thường, chống nhiễm bệnh đặc biệt các bệnh về gan Ngoài ra, Hepato có thể sử dụng phòng bệnh cho cá (Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám, 1999)

Năm 2002, Phan Xuân Thanh và cộng tác viên đã xác định được chất: 2 - 6-pentandecatrienilbenzoat có nguồn gốc từ thảo dược, có tác dụng phòng trừ các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra Nhằm mục đích sử dụng các hoạt chất sinh học thay thế các kháng sinh, hoá chất độc trong lĩnh vực nuôi trồng thuỷ sản (Phan

hydroxy-Xuân Thanh và ctv., 2002)

Năm 2007, chế phẩm sinh học bokashi được chiết xuất từ lá trầu của Nguyễn Ngọc Phước được xem như một trong những hướng nghiên cứu đột phá trong phòng và trị bệnh cho thủy sản, dùng để điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra trên động vật thủy sản mà không sử dụng kháng sinh và thân thiện với môi trường

Về vấn đề chế tạo những sản phẩm thuốc nam ở dạng sản phẩm công nghiệp đã được các nhà nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản cũng đã có sự quan tâm bước đầu Nhóm nghiên cứu thuộc Viện Sinh học (Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc Gia) đã thực hiện thành công đề tài chế tạo sản phẩm sinh học từ cây thuốc cá để xử lý môi trường ao nuôi tôm, ứng dụng hiệu quả qua các tỉnh Bạc

Liêu, Sóc Trăng, Cà Mau (Bùi Quang Tề và ctv., 2006)

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Nguồn vi khuẩn: Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila được cung cấp từ

khoa Thủy sản Đại học Cần Thơ

Nguồn thảo dược: Thu hái ngoài tự nhiên gồm: rễ cỏ Xước và lá Sầu đâu được xác định thông qua hình dạng bên ngoài dựa trên sự miêu tả của Đỗ Tất Lợi (1968) Lưu ý nên hái lá Sầu đâu vào thời điểm trưa nắng và nên thu rễ cỏ Xước ở thời điểm cây chuẩn bị ra hoa

3.2.2 Dụng cụ, hóa chất

Ống nghiệm có nắp nhựa, cốc 100ml, chai thủy tinh nấu môi trường (250ml và 500ml), đĩa petri, khay nhựa, giá để ống nghiệm, micropipet BIOHIT – Phần Lan, đũa tán thủy tinh, que cấy, găng tay, khẩu trang, giấy thấm, giấy bạc

Môi trường BHI (Brain Heart Infusion – hãng Merck), môi trường NB (Nutrient Broth – hãng Merck), môi trường NA (Nutrient agar – hãng Merck K), nước cất vô

trùng, cồn 70%, nước muối sinh lý 0,9% (Phụ lục A)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp tiến hành thí nghiệm

* Phương pháp ly trích dược thảo:

Dùng rễ cỏ Xước và lá Sầu đâu rửa sạch, để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ phòng, cho vào máy xay nhuyễn, sau đó tiến hành làm theo 2 phương pháp như sau:

 Phương pháp ngâm: cho thảo dược vào nước cất và cồn 70% ngâm trong 3 giờ ở nhiệt độ phòng

 Phương pháp đun: cho thảo dược vào nước cất và cồn 70% đun ở nhiệt độ

980C trong thời gian 3 giờ

Tỷ lệ giữa mỗi loại thảo dược và dung môi lần lượt là 1:1, 1:2, 1:3 Sau đó lọc qua giấy lọc được dung dịch chiết Đun dịch chiết ở 700C để cồn bốc hơi khi ngửi thấy hết mùi cồn thì bổ sung nước cất cho cân bằng thể tích, bảo quản ở nhiệt độ 4 - 60C

*Phương pháp lập đĩa thảo dược

Sau khi thu được các dung dịch từ các phương pháp ly trích trên, tiến hành xác định hiệu quả kháng khuẩn trên vi khuẩn theo phương pháp đục lỗ thạch (Sarkar & Banerjee, 1996) Các thao tác được thực hiện trong điều kiện vô trùng:

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila sau khi được tách ròng và

định danh, tiến hành đổ 20ml dung dịch môi trường trên mỗi đĩa, khi môi trường đã khô, tiếp tục lấy 50µl dung dịch ở ống nghiệm chứa vi khuẩn có mật độ 106 cfu/ml cho vào đĩa và dàn đều trên mặt thạch bằng que trải vi khuẩn, để khô tự nhiên Mỗi đĩa thạch đục 4 lỗ trên mặt thạch với đường kính 6 mm/lỗ Nhỏ vào mỗi lỗ 100µl dịch chiết dược liệu rồi giữ ở nhiệt độ 30 – 320 C trong tủ ấm

*Xác định và chọn lọc tính kháng khuẩn của vi khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của những dòng vi khuẩn phân lập được tính bằng đường kính vòng kháng khuẩn quanh khuẩn lạc hay quanh miệng giếng trên đĩa (Schillinger và Luke, 1989) So sánh khả năng kháng khuẩn của các dòng và chọn lọc những dòng vi khuẩn có tính kháng khuẩn cao Đánh giá mức độ đối kháng như sau:

Đường kính vòng kháng khuẩn X ≥ 10 mm: tính kháng mạnh (+++)

Đường kính vòng kháng khuẩn 5 < X < 10 mm: tính kháng trung bình (++)

Đường kính vòng kháng khuẩn X ≤ 5 mm: tính kháng yếu (+)

X = 0: không có tính kháng

*Phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn được tính bằng đường

kính vòng kháng khuẩn (Schillinger et al., 1989)

Việc đọc kết quả được thực hiện sau 24 giờ ủ trong tủ ấm (t0 = 320C) Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn được xác định bằng sự hiện diện của vòng kháng xung quanh lỗ Nếu đường kính vùng kháng lớn hoặc bằng 6 mm (Schillinger và Luke, 1989) thì được xem là có khả năng ức chế tích cực