Hệ VSV lên men ethanol chủng loại, đặc điểm, hình thái, cấu trúc ứng dụng

Hệ VSV lên men ethanol chủng loại, đặc điểm, hình thái, cấu trúc ứng dụng

MỤC LỤC

Lời mở đầu 2

HỆ VI SINH VẬT LÊN MEN ETHANOL A-Nấm men 3

I- Saccharomyces cerevisiae 3

1-Đặc điểm 3

2-Một số chủng Saccharomyces cerevisiae thường dùng 4

3- Điều kiện lên men 5

4-Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển 6

II- Cơ chế lên men ethanol 10

III-Ứng dụng trong lên men ethanol 12

1.Động học của quá trình lên men 12

2 Tiến hành lên men 13

B-Vi khuẩn 15

I.Giới thiệu chung 15

II.Các vi khuẩn lên men cồn 15

1.Zymomonas mobilis 15

a.Đặc điểm 15

b.Điều kiện phát triển 17

c Nuơi cấy 18

d- Quá trình lên men 19

2.Clostridium 22

a.Đặc điểm 22

b.Điều kiện phát triển 22

C Các ứng dụng của ethanol 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

Ethanol còn được biết đến như là rượu êtylic hay rượu ngũ cốc còn gọi là

cồn, là một hợp chất hữu cơ, nằm trong dãy đồng đẳng của rượu metylic, dễcháy, không màu, là một trong các rượu thông thường có trong thành phầncủa đồ uống chứa cồn Trong cách nói dân dã, thông thường nó được nhắcđến một cách đơn giản là rượu Ethanol là nguồn nguyên liệu hóa học đadạng, và trong thời gian qua đã được sử dụng với phạm vi thương mại đểtổng hợp hàng loạt các mặt hàng hóa chất với sản lượng lớn khác Hiện nay,

nó đã được thay thế trong nhiều ứng dụng bằng các nguyên liệu hóa dầukhác rẻ tiền hơn Bài ‘‘Tiểu luận” này trình bày hệ VSV lên men ethanol Từ

đó người ta biết được các quá trình hình thành, chủng loại đặc điểm và cácứng dụng của nó trong đời sống hằng ngày

Do kiến thức hạn chế và thiếu kinh nghiệm, cuốn tiểu luận này chắc cònnhiều thiếu sót, vì vậy chúng em chân thành tiếp thu mọi góp ý đóng góp,phê bình để chúng em được hoàn thiện những lần sau Chúng em chân thànhcảm ơn những ý kiến đóng góp, chân thành của thầy cô và các bạn

HỆ VI SINH VẬT LÊN MEN ETHANOL

A-NẤM MEN

Nấm men là tác nhân cơ bản gây ra quá trình lên men ethanol Thường sử

dụng nấm men thuộc họ Saccharomycetaceac, lồi S.cerevisiae

I-SACCHAROMYCES CEREVISIAE

1 Đặc điểm

- Hình dạng: tế bào hình bầu dục nếu ở mơi trường giàu chất dinh dưỡng.Trong điều kiện yếm khí, tế bào cĩ hình trịn; ngược lại, trong điều kiện hiếukhí tế bào kéo dài hơn

- Kích thước thay đổi trong khoảng 2,5 - 10 µm × 4,5 -21µm

- Chu kì sống: Các tế bào dinh dưỡng đơn bội (n) cĩ thể tiếp hợp vớinhau để tạo thành tế bào dinh dưỡng lưỡng bội (2n) Sau quá trình giảm phân sẽsinh ra các bào tử túi (thường là 4 bào tử túi) Bình thường khi khơng cĩ sinhsản hữu tính, chúng vẫn liên tục nảy chồi để sinh sơi nảy nở

- Saccharomyces cerevisiae thuộc loại nấm men lên men nổi Trong quá

trình lên men, tế bào của chúng nổi lơ lửng trong dung dịch lên men và tậptrung trên bề mặt Nhờ đĩ tăng diện tích tiếp xúc với cơ chất, quá trình lên menxảy ra nhanh chĩng và mạnh mẽ

-Lên men được nhiều loại đường (glucose, fructose, saccharose,maltose, 1/3 rafinose, các dextrin …)v à nhiều loại nguyên liệu khác nhau( như gạo, ngơ, khoai, sắn… với lượng đường trong dung dịch là 12 – 14%, cĩkhi là 16 – 18%)

- Cĩ khả năng lên men ở nhiệt độ cao ( 36 – 400C), chịu được độ acid

- Chịu được thuốc sát trùng Na2SiF6 nồng độ 0,02 – 0,025% nên cĩ thểlên men trong điều kiện bắt buộc phải dùng thuốc sát trùng

- Sinh sản theo kiểu nảy chồi, cĩ khả năng sinh bào tử, sống kị khí khơngbắt buộc

Hình 1: Nấm men Saccharomycetaceac

2 M ột số ch ủng Saccharomyces cerevisiae thường dùng :

- Chủng XII phân lập từ nấm men bánh mì 1902 Tế bào hình trịnhoặc oval, có kích thước lớn và mập hơn các chủng khác (5-8µ) Chu kỳ sinhtrưởng của 1 thế hệ là 1giờ 39 phút.Sinh sản bằng cách nảy chồi Ở điều kiệnkhắc nghiệt, ở nhiệt độ 250C chỉ trong vịng một ngày cụ thể tạo thành bào tử (1– 4 bào tử) Trong tế bào già thường chứa nhiều glycogen và metaxromatin.Nấm men chủng XII sinh sản mạnh trong 12 giờ đầu nuơi cấy sau đĩ chậm dần

và lên men rất mạnh Chúng cĩ khả năng lên men rất mạnh glucose, matose,fructose, galactose, saccharose, maltose và 1/3 rafinose Chủng này không lênmen được các đường lactose, kxilose, arabinose, inulin Nồng độ rượu trongdịch lên men có thể đạt tới 13% V Theo giáo sư Manxep thì chủng XII đượcxem là tốt nhất khi lên men dịch đường từ tinh bột ở các nhà máy rượu củaLiên Xô cũ

-Chủng XV có tính chất tương tự chủng XII và hay dùng để lên men

dịch đường hỗn hợp gồm tinh bột và rỉ đường

- Chủng số II (do Linder tách ra từ 1889 trong nhà máy rượu) Đây là

chủng đầu tiên được ứng dụng trong sản xuất rượu và các ngành sản xuất khác

Tế bào dài, hình đứng, lớn và sinh sản bằng cách nảy chồi Ở 25oC trong 30 giờ

nuơi cấy cĩ thể tạo thành bào tử (thường trong tế bào cĩ 3 bào tử); lên menđược các loại đường như chủng XII nhưng khả năng sinh sản kém hơn.

- Chủng M.10 (được tách từ năm1916) dùng để sản xuất các loại nguyên

liệu chứa đường Tế bào chủng này cĩ hình trịn hay hình oval với kích thước5-6 x 6-7µ; cĩ khả năng lên men các loại đường như 2 chủng trên.Chúng cĩkhả năng sản sinh rất nhanh và lên men được ở nồng độ rất cao Bền vững vớiacid sulfuric và tồn tại được ở pH =2

- Chủng B, cũng như M.10, được sử dụng rộng rãi trong sản xuất rượu

từ mật rỉ Tế bào hình trụ, hình oval với kích thước tế bào 3,9-9,7 x 39-8,9 µ;

cĩ khả năng lên men rượu rất tốt, đồng thời cĩ đặc tính lên men bánh mì cao

- Chủng M (thu được vào 1905) do Ghenebec phân lập từ hỗn hợp của 4

chủng nấm men nổi Chủng được dùng để lên men trong mơi trường chứa cáchỗn hợp đường khác nhau Chúng rất bền và ổn định, thích nghi được nhữngđiều kiện khơng bình thường trong thực tế sản xuất

- Chủng MTB (Ở nước ta trước 1975, các nhà máy rượu chỉ dùng chủng

này do nhà máy rượu Hà Nội cung cấp) Chủng này cĩ khả năng sinh sản nhanh

và cho hiệu suất lên men tương đối tốt

- Chủng IA : do Iacubopski phân lập từ thùng lên men từ rỉ đường.

Lên men được các đường glucose, maltose, fructose, saccharose, galactosevà 1/3 rafinose Chủng IA không có khả năng lên men dextrin và lactosecũng như đường 5 C

3 Điều kiện lên men:

- Cơ chất (nguồn C): tinh bột, rỉ đường

- Nồng độ đường: 10 – 16%

- pH: 4 – 5

- Nhiệt độ: 28 – 300C

- Nhu cầu về oxy: Giai đoạn đầu của lên men cần cung cấp một lượng

nhỏ O2 vì đây là thành phần cần thiết trong sự sinh tổng hợp các chất béo chưabão hịa và lipid Áp suất của O2 vào khoảng 0,05 – 0,10 mmHg Đến giai đoạnsau khơng cung cấp oxy nữa

- Nhu cầu dinh dưỡng:

+ Cần một lượng tương đối các chất dinh dưỡng dùng trong sự tổng hợpethanol, gồm C, H, O, N Nó tỉ lệ thuận với thành phần chính của tế bào nấmmen.

+ Các nguyên tố P, S, K, Mg cần một lượng ít hơn, dùng để tổng hợpcác thành phần thứ yếu

+ Các muối vô cơ ( Mn, Co, Cu, Zn) và các nhân tố sinh trưởng hữu

cơ ( acid amin, acid nucleic, vitamine…) được yêu cầu dưới dạng vết

- Nấm men rất mẫn cảm với sự ức chế của ethanol Với nồng độ

cồn 1 – 2% (khối lượng/thể tích) đã làm chậm sinh trưởng của vi sinh vật và ởnồng độ 10% (khối lượng/thể tích) thì tốc độ sinh trưởng của nấm men gần nhưngừng hẳn

4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển

a Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ tối ưu của nấm men saccharomyces là khoảng 28 – 320C Tuynhiên nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéodài hơn Mặt khác làm lạnh dịch đường tới 20-220C sẽ hạn chế sự phát triển củatạp khuẩn

Sau 8 – 10 giờ, nhiệt độ lên men sẽ tăng đến 28 – 300C, tiếp đó cần làmlạnh để ổn định nhiệt độ trong giới hạn tối ưu

Ở nhiệt độ cao hoạt tính của nấm men giảm nhanh, chủ yếu là dễ bịnhiễm lactic và nấm men hoang dại Ở nhiệt độ 300C men hoang dại phát triển

nhanh hơn Saccharomyces 2 – 3 lần, còn ở nhiệt độ 35 -380C chúng phát triểnnhanh gấp 6 đến 8 lần

Khi lên men ở 29,50C, tổn thất do tạo men là 7,37 %, ở 17,50C tổn thất

do tạo men là 5,32 % và nếu lên men dịch đường ở 100C thì tổn thất do tạo menchỉ chiếm 4,42 % lượng đường có trong dung dịch

Khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều esther, aldehyde và tổn thất rượutheo CO2 sẽ tăng

b Ảnh hưởng của pH

Nồng độ ion H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động củanấm men Chúng có khả năng làm thay đổi diện tích các chất của vỏ tế bào, làm

tăng hay giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướngcủa quá trình lên men Mỗi vi sinh vật hoạt động tốt ở một pH nhất định.

Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo alcohol ethylic là 4,5 –5,0 Đối với dịch đường từ nguyên liệu tinh bột thường khống chế ở pH = 4,8 –5,2; nhằm giữ cho amylase tiếp tục chuyển hóa tinh bột và dextrin thành đườnglên men được

Tăng pH sẽ dễ bị nhiễm khuẩn; glyxerin tạo nhiều hơn và giảm hiệu suấtlên men Vì vậy, khi gây men giống trong điều kiện sản xuất, người ta điềuchỉnh pH tới 3,8 – 4,0 để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn lactic và nấm menhoang dại

Ở pH ≥ 4,2 nấm men tuy phát triển chậm hơn so với pH = 4,5 – 5,0nhưng tạp khuẩn hầu như không phát triển Tới lúc nào đó nấm men phát triểnnhiều và đủ mạnh ta tăng pH đến tối ưu cho nấm men phát triển nhanh hơn.Lúc này điều kiện cũng tốt cho các tạp khuẩn nhưng vì nấm men đã nhiều và

đủ mạnh để lấn át nên tạp khuẩn cũng khó gây tác hại cho lên men

Phương pháp này được áp dụng để gây men trong điều kiện sản xuất vàgọi là nuôi cấy nấm men thuần khiết tự nhiên

Khi cho acid sulfuric vào đường dịch, chúng sẽ không ở dạng tự do màliên kết hóa học với các muối và giải phóng acid hữu cơ, phosphoric tự do, chủyếu ở dạng KH2SO4 và NaH2PO4

Giữa ion H + và lượng acid có tương quan nhất định đối với mỗi dungdịch nào đó, ví dụ cùng một pH nhưng độ chua của dịch đường hóa từ ngô baogiờ cũng lớn hơn từ sắn Trong thực tế sản xuất không phải cơ sở nào cũng cóđiều kiện đo pH, mà thường chỉ xác định độ chua Đối với mỗi dung dịch nào

đó thì pH có thể xem như gần ổn định còn độ chua lại thay đổi nhiều phụ thuộcvào mức độ nhiễm khuẩn của nguyên liệu và dịch lên men Khi nhiễm khuẩn sẽtạo acid hữu cơ có độ phân ly thấp nên ít làm thay đổi pH Vì vậy trong sảnxuất rượu không chỉ xác định pH mà còn xác định độ chua Độ chua có thể biểudiễn theo độ hay theo gam acid / lít

Một độ chua được biểu diễn bằng 1ml dung dịch NaOH 2N vừa đủ đểtrung hòa acid tự do chứa trong 20 ml dịch hoặc biểu diễn độ chua bằng gam

H2SO4/lít dịch, 10 chua = 2,45 g /l

c Ảnh hưởng của nồng độ lên dịch men

Nồng độ dịch đường cao làm tăng áp suất, mất cân bằng trạng thái sinh

lý của nấm men Kết quả là cồn nhiều sẽ ức chế không những tạp khuẩn mà cảnấm men, dẫn đến tổn thất hoặc phải kéo dài thời gian lên men

Nồng độ dịch đường thấp làm giảm năng suất thiết bị lên men, tốn hơikhi chưng cất, tăng tổn thất rượu trong bã rượu và nước thải

Bình thường người ta khống chế nồng độ chất khô của dịch đường từ 16– 18 % ( tùy theo mức độ thuần khiết), tương đương 13 – 15% đường, để saukhi lên men sẽ nhận được nồng độ rượu trong giấm chín là 8,5 – 9,5 % V

d Ảnh hưởng của một số hóa chất và chất sát trùng

Trong điều kiện sản xuất, dù có vệ sinh sạch đến mấy cũng khó đảm bảo

vô trùng tuyệt đối, vì vậy cần phải dùng chất sát trùng để ngăn ngừa và hạn chếtạp khuẩn

Có thể dùng hóa chất khác nhau như clorua vôi, formalin, fluosilicatnatri Tùy theo chất lượng của hóa chất mà dùng nhiều hay ít, cốt sao hạn chếđược phát triển của tạp khuẩn nhưng không làm ảnh hưởng xấu đến hoạt động

của nấm men Khi dùng formalin hay fluosilicat natri, nồng độ không vượt quá

0,02% so với dịch lên men

Ảnh hưởng của một số acid tới nấm men:

Làm ngừng sinh trưởng Tiêu diệt men

tạo rượu và tăng các tạp chất, giảm hoạt độ của maltase và zymase của nấmmen.

Khi dịch chứa 4 – 6 triệu tế bào/ml thì 0,002% furfurol sẽ ảnh hưởng xấuđến sinh trưởng và sinh lý của dịch lên men; khi dịch lên men chứa 90 triệu /

ml thì 0,006% furfurol mới ảnh hưởng tới sinh lý nấm men

Hàm lượng furfurol trong mật rỉ thường vào khoảng 6 đến 8 g / 100 gchất khô Nếu mật rỉ pha loãng tới 20 – 22% thì nồng độ sẽ khoảng 1,5 – 2,0

mg / 100ml (0,0015 – 0,002%) Trong điều kiện lên men với tỉ lệ men giốnglớm hơn 10%, ảnh hưởng của furfurol xem như không đáng kể

Melanoidin có ảnh hưởng không giống nhau đối với các chủng men Nóảnh hưởng xấu đến sinh sản của chủng B và IA, chỉ trong 12 giờ đầu đối vớichủng r-176 và r-202, melanoidin ảnh hưởng suốt trong thời gian 24 giờ, số tếbào ít hơn 1,3 – 2 lần so với môi trường chứa 0,005 – 0,3g/100 ml Caramelakhông bị hấp thụ trên bề mặt nấm men nhưng với nồng độ 0,005% sẽ làm nhiều

tế bào bị chết đi

e Ảnh hưởng của sục khí

Sục khí để hòa tan oxy vào dịch đường, giúp cho nấm men phát triểnnhanh hơn Tuy nhiên, sục khí không cần thiết đối với dịch đường từ nguyênliệu tinh bột Sục khí sẽ làm tăng lượng đường bay hơi Mặt khác nếu dư dẫnđến tạo nhiều sinh khối và aldehyde, do đó làm giảm hiệu suất lên men rượu

Thực tế thì không cần sục khí vào dịch đường Một lượng nhỏ oxy sẽđược hòa tan trong thời gian khuấy và làm lạnh, đủ đảm bảo cho sinh trưởngphát triển và lên men Với tỉ lệ men giống 10%, sau 50 giờ lên men nồng độbiểu kiến của dịch đã giảm tới số lượng không đổi với hầu hết thùng lên men.Sau 70 – 72 giờ nồng độ rượu trong giấm chín đạt trung bình 9% V, đường sótchỉ vào khoảng 0,3 – 0,5 %

f Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung

Ở nước ta, cồn được sản xuất chủ yếu từ nguyên liệu sắn Do trong sắnchứa ít protid nên lượng nitơ trong dịch đường hóa không đảm bảo cho pháttriển của nấm men

Bổ sung nitơ vào dịch lên men

Các chỉ tiêu Mẫu kiểm chứng không

bổ sung nitơ

Nguồn nitơ từ(NH

II- CƠ CHẾ LÊN MEN ETHANOL :

1 Do xúc tác của glucokinase, glucose kết hợp với gốc phosphat của

phân tử ATP (adenoxintriphosphat) trong tế bào nấm men để tạo thành 6-phosphat và ADP:

C6H12O6 +ATP CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO + ADP

glucokinase

2 Gluco-6-phosphat do tác dụng của enzyme đồng phân gluco phosphat

isomerase sẽ biến thành fructo phosphat:

CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OH

3 Dưới tác dụng của enzime phosphofructokinase, phân tử ATP thứ hai

sẽ đính thêm một gốc phosphat nữa vào 6-phosphat để tạo thành 1,6-diphosphat và phân tử ADP thứ hai:

CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OH + ATP

CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2O(H2PO3) +ADP

[Giai đoạn thực hiện các nối liên kết cao năng thành dạng dễ biến đổidưới tác dụng của các enzime]

4 Mạch cacbon của fructodiphosphat thành hai phân tử triose: aldehyde

phosphoglyceric và phosphodioxyacetone (xúc tác: aldolase):

CH2O(H2PO3)CO(CHOH)3CH2O(H2PO3) CH2O(H2PO3)COCH2OH +CH2O(H2PO3)CHOHCHO

5 Sản phẩm của quá trình trước là aldehyde phosphoglyceric nhưng

trong dịch lên men chúng chứa rất ít do hiện tượng đồng phân dưới tác dụngcủa enzime triphosphat isomerase:

CH2O(H2PO3)COCH2OH CH2O(H2PO3)CHOHCHO

6 Hai phân tử aldehyde phosphoglyceric bị oxi hóa Phản ứng này có sự

tham gia của acid phosphoric trong canh trường nhờ xúc tác của enzymetriphosphatdehydronase, coenzime của nó là NAD (Nicotinamid-Adenin-dinucleotid) Phân tử 3-phosphoglyceroaldehyde kết hợp với phosphat, cònhidro chuyển sang coenzime NAD:

2CH2O(H2PO3)CHOHCHO + 2H3PO4 +2NAD

2CH2O(H2PO3)CHOHCOO~H2PO3 + 2NADH2

[Năng lượng được giải phóng do oxy hóa 3-phosphoglyceroaldehyde sễtióch tụ trong liên kết cao năng của acid 1,3-diphosphoglyceric mới tạo thành]

7 Với sự tham gia của phosphoglyceratkinase, gốc phosphat chứa cao

năng của acid 1,diphosphoglyceric sẽ chuyển vào phân tử Kết quả phosphoglyceric được tạo thành , còn Adp nhận thêm năng lượng và biếnthành, còn ADP nhận thêm năng lượng và biến thành ATP:

2CH (H PO )CHOHCOO~(H PO ) + 2ADP

2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH + 2ATP

8 Dưới tác dụng của enzime phosphoglyceromutase, gốc acid

phosphoric sẽ chuyển từ vị trí cacbon thứ ba sang cacbon thứ hai Kết quả là phosphoglyceric biến thành acid 2-phosphoglyceric theo phản ứng:

3-2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH 2CH2OHCHO(H2PO3)COOH

9 Dưới tác dụngcủa enolase, acid 2-phosphoglyceric sẽ mất nước và

biến thành acid phosphopyrovic:

2CH2OHCHO(H2PO3)COOH 2CH3CO(H2PO3)COOH

+2H2O

10 Acid phosphopyrovic rất không bền nên dễ bị mất gốc acid

phosphoric do enzime pyrovatkinase và do đó acid pyrovic được tạo thành:

2CH2=CO~(H2PO3)COOH + 2ADP 2CH3CO-COOH

+2ATP

11 Acid pyrovic bị decacbocyl để tạo thành aldehyde acetic:

2CH3CO-COOH 2CO2 + 2CH3CHO

12 Aldehyde acetic bị khử bởi NADH2:

2CH3CHO + 2NADH2 2CH3CH2OH + 2NAD

Tóm lại, Phương trình tổng quát của quá trình lên men như sau:

III ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN ETHANOL

1 Động học của quá trình lên men

Lên men được chia thành 3 giai đoạn: lên men sơ bộ, lên men chính vàlên men phụ

Trong giai đoạn đầu, thời gian kéo dài gần 60 giờ, đặc trưng cho thời kìtiềm phát, lượng đường được lên men rất ít

Enzyme zymase