Đề cương ôn kiểm nghiệm lương thực thực phẩm

Nhóm thực phẩm dễ bị nhiễm của từng loại vi khuẩn: [đất, trong phân người] Clostridium botulinum Thịt, rau quả, thực phẩm nhiễm đất, phân động vật được chế biến chưa đủ nhiệt trước kh

TÀI LIỆU THAM KHẢO TRƯƠNG TẤN TÀI

HƯỚNG DẪN HỌC MÔN KIỂM NGHIỆM LƯƠNG THỰC - THỰC PHẨM

MỤC LỤC

Chương 1 Ngộ độc thực phẩm và các chỉ tiêu vi sinh thường được kiểm soát trong thực

phẩm 4

I VI KHUẨN 4

II NẤM MỐC 6

III VIRUT THỰC PHẨM 6

Chương 2 Thành phần môi trường và các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật 7

I THÀNH PHẦN CỦA MÔI TRƯỜNG 7

II PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG THEO THÀNH PHẦN 10

III PHÂN LOẠI THEO TRẠNG THÁI VẬT LÝ 10

IV PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG THEO CÔNG DỤNG 10

V PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG 11

VI BẢO QUẢN MÔI TRƯỜNG 13

VII KHỬ TRÙNG VẬT LIỆU SAU KHI NUÔI CẤY 14

Chương 3 Phương pháp thu nhận, bảo quản và chuẩn bị mẫu thực phẩm để phân tích vi sinh vật 14

Chương 4 Phương pháp định lượng vi sinh vật 17

I PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP 17

II PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC 17

Bài tập 1 19

Bài tập 2 21

Bài tập 3 21

III PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC ĐỂ ĐẾM VI SINH VẬT 21

IV PHƯƠNG PHÁP MPN 22

Bài tập 4 22

Bài tập 5 22

Chương 5 Các thử nghiệm sinh hóa quan trọng dùng kiểm tra định tính vi sinh vật 23

Chương 6 Quy trình phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật 35

I COLIFORMS VÀ E.COLI 35

II STAPHYLOCOCCUS AUREUS 38

III FAECAL STREPPTOCOCCUS 39

IV SALMONELLA 40

V SHIGELLA 41

VI VIBRIO 41

VII LISTERIA MONOCYTOGENES 43

VIII CLOSTRIDIUM 44

IX NẤM MỐC VÀ NẤM MEN 44

Chương 7 Quy trình phân tích vi sinh vật theo phương pháp hiện đại 44

I PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG SINH HỌC ATP 44

II PHƯƠNG PHÁP ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent Assay) 45

III PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ 47

IV PHƯƠNG PHÁP PCR 47

Chương 1 Ngộ độc thực phẩm và các chỉ tiêu vi sinh

thường được kiểm soát trong thực phẩm

KIẾN THỨC CHUNG:

+ Vi sinh vật gây độc bởi ngoại độc tố hoặc nội độc tố

- Ngoại độc tố là chất được tiết ra bên ngoài bản chất là protein có tính sinh kháng

cao, dễ bị phá hủy bởi nhiệt độ 600C Tính độc mạnh

𝑁𝑔𝑜ạ𝑖 độ𝑐 𝑡ố (𝑓𝑜𝑟𝑚𝑜𝑙 𝑜𝑟 𝑇)/𝑎 𝑡𝑖𝑚𝑒→ 𝑀ấ𝑡 độ𝑐 𝑡í𝑛ℎ 𝑛ℎư𝑛𝑔 𝑣ẫ𝑛 𝑐ò𝑛 𝑡í𝑛ℎ 𝑘ℎá𝑛𝑔 𝑠𝑖𝑛ℎ →

Sản phẩm giải độc tố dùng làm vacxin phòng bệnh đặc hiệu

- Nội độc tố là độc tố LK chặc chẽ với vách tế bào VK Gram -, không khuếch tán ra

môi trường bên ngoài, tính độc yếu hơn ngoại độc tố Thành phần độc tố chủ yếu là

lipit A của nhóm lipopolysaccharide của vách tế bào Tính chất miễn dịch yếu,

không thể dùng formol như ở ngoại độc tố

+ Nhiễm ít → tăng sinh nhanh → nhiễm độc

+ Giới hạn vsv trong thực phẩm là 0

Nấm mốc: Aspergillus, độc tố aflatoxin cho phép ≥ 20ppb

Virus: HAV, HEV

I VI KHUẨN

- Chỉ trừ Clostridium botulinum không bị tiêu chảy mà chỉ bị ói mửa và buồn nôn → rối

loạn hệ thần kinh

- Campylobacter bị tiêu diệt hoàn toàn bằng phương pháp Pasteur (60 – 700C)

- Vibrio là tác nhân gây bệnh tả

Commented [TST1]: 1 milion cell/ 1g TP; tiêu chảy, ói

mửa, buồn nôn

Commented [TST2]: Gây đau thắt vùng bụng, tiêu chảy Commented [TST3]: Viêm nhiễm đường ruột: đau nhức,

tiêu chảy, sốt, đau đầu, khó chịu, chuột rút, lạnh cóng

Commented [TST4]: Sinh độc tố botulin

Commented [TST5]: Tác nhân gây bệnh tả

Commented [TST6]: Tiêu chảy, nôn mửa

Commented [TST7]: Chỉ thị khả năng vệ sinh thực phẩm Commented [TST8]: Tiêu chảy, sốt nhẹ, nhiễm trùng máu,

tổn thương hệ thần kinh trung ương, tim, mắt

Sẩy thai, đẻ non, nhiễm vào thai nhi

Commented [TST9]: Tiêu chảy nhẹ, cao hơn tiêu ra máu,

có những mảnh niêm mạc ruột, mất nước, sốt cao, bị co rút thành bụng

Commented [TST10]: Gây tiêu chảy hoặc buồn nôn,

- Nhiễm trùng máu: V vulnificus hoặc Listeria monocytogenes

Nhóm độc tố tiết ra từ vi khuẩn:

trong 30min

tính mạnh gây tiêu chảy)

+ Độc tố hemolysine như tetrodotoxin ở cá nóc

Emetictoxin gây nôn mửa

Nhóm vi khuẩn tấn công trực tiếp vào tế bào:

Salmonella, Campylobacter, Clostridium pertrigens, Coliforms, Shigella, Listeria monocytogenes

Nhóm thực phẩm dễ bị nhiễm của từng loại vi khuẩn:

[đất, trong phân người]

Clostridium botulinum

Thịt, rau quả, thực phẩm nhiễm đất, phân động vật được chế biến chưa đủ nhiệt trước khi dùng, các sản phẩm đóng hộp không đúng qui cách

Shigella

Bacillus cereus đất, bụi, các loại thực phẩm( Thịt, sữa, rau

quả, gia vị, các sản phẩm khô)

II NẤM MỐC

+ Các loại ngũ cốc, nông sản mà không được phơi sấy kĩ sẽ dễ bị lên nấm mốc

+ Sau 1 – 3 ngày nấm mốc sẽ tiết độc tố vào cơ thể

III VIRUT THỰC PHẨM

1 Con đường lây nhiễm

- Sống trong đường ruột một người, thải ra phân và nhiễm vào thực phẩm, từ đó lây nhiễm

vào miệng của người khác

2 Kỹ thuật xét nghiệm

- Bằng kỹ thuật sinh học phân tử PCR hoặc lai phân tử,…

3 Nhóm virus

+ 2 loại là Rotavirus và Norovirus

+ HAV ( Virus hepatitis A)

- Tồn tại trong nước từ 3 đến 10 tháng

- Hủy diệt virus:

 Chiếu xạ

 T = 560C / 30 min

 850C / 1 min

+ HEV (Virus hepatitis E)

Rất giống virus viêm gan A

3 Kết luận đặc điểm virus thực phẩm

- Các virus đường ruột thường sẽ lây nhiễm vào con người qua sản phẩm thủy sản

- Tất cả các virus đường ruột đều kháng với acid, các enzyme thủy giải, hay muối mật có

trong đường tiêu hóa

- Kháng nhiệt như Hepatits type A

Commented [TST11]: Triệu chứng: sốt, nhức đầu, nôn

mửa, đau bụng, tiêu chảy và đôi khi biểu lộ một cách tạm thời dấu hiệu bất dung nạp đường lactose của sữa

Commented [TST12]: Triệu chứng: nhức đầu, nôn mửa,

đau bụng, tiêu chảy, đau nhức các cơ bắp, sốt nhẹ nóng lạnh + Bệnh thường khỏi sau hai ba ngày

+ Khả năng lây nhiễm cao

+ Hiện diễn trong phân và trong nước ói mửa

- Kháng các chất tẩy uế như phenolic, ethanol,…

→ Ozon và Chlorine có thể bất hoạt một vài virus đường ruột

4 Phòng virus thực phẩm

- Thức ăn nấu chín

- Khử virus trước khi tiêu thụ

- Các loại nhuyễn thể ăn lọc phải được khai thác trong những vùng nước không nhiễm virus hay được nuôi trong các vùng nước sạch trước khi tiêu thụ

Chương 2 Thành phần môi trường và các loại môi

trường nuôi cấy vi sinh vật

I THÀNH PHẦN CỦA MÔI TRƯỜNG

+ Tạo môi trường rắn

+ Rất nhiều vsv không dùng được agar làm

cơ chất dinh dưỡng

Pepton

𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 + 𝑛𝐻2𝑂

𝐻𝐶𝐿

⟶𝑃𝑒𝑝𝑠𝑖𝑛𝑃𝑒𝑝𝑡𝑜𝑛 …

+ 𝐶𝑎𝑠𝑒𝑖𝑛 𝑝𝑎𝑛𝑐𝑟𝑒𝑎𝑡𝑖𝑛→ 𝑃𝑒𝑝𝑡𝑜𝑛𝑡𝑟𝑦𝑝𝑡𝑖𝑐𝑎𝑠𝑒 + Bột đậu nành phân giải thành Phytone hoặc pepton papainic)

+ Pepton thịt: sản phẩm phân giải của thịt nhờ pepsin

Cao thịt

+ Thịt không bao gồm gân và mỡ được xử

lý bằng enzyme sau đó ly trích và cô đặc được cao thịt

→ Thành phần dinh dưỡng cực tốt

Cao nấm men

+ Dung dịch trích ly từ nấm men đã qua quá trình tự phân thực hiện đông khô được cao nấm

→ Giàu vit, đk tốt của vsv(thường bổ sung 3g/L)

Một số tác nhân tạo môi trường kị khí

+ Bột gan: cung cấp dinh dưỡng, hệ thống oxy hóa khử tự nhiên

+ Cung cấp S để thay thể O: Sodium thioglycolater, solium formaldehyde sulfoxylate cysteine

Nếu là môi trường khô thì chọn các muối hemin – muối chloride của heme như ion protoporphyrin có trong thành phần của nhiều enzyme oxy hóa khử như cytochrome hoặc hemoglobin,…

+ Cung cấp các chất kích thích sự phát triển của vi sinh vật kỵ khí

Chế phẩm từ mật bò

+ Ứng dụng: ứng dụng phân lập và chọn lọc hệ vi sinh vật đường ruột và ức chế vk Gram +

+ Chức năng: giảm sức căng bề mặt tại vùng tiếp xúc giữa màng và môi trường, kích thích men autolysin nội bào dẫn đến

sự phân giải màng tế bào

+ Mật bò: mật bò tươi làm sạch và đông

khô

1g mật bò khô = 10 – 12g mật tươi

Cmt = 10 – 20g/L của mật bò

+ Hỗn hợp muối từ mật bò: hỗn hợp muối

Na của các acid có trong mật bò(cholic, taurocholic, desoxycholic,…) như mật bò như hoạt tính cao hơn và dùng với C thấp hơn

+ Sodium desoxycholate: dùng nhiều để phân lập vk đường ruột và Gram -

Các chất ức chế chọn lọc + Azide và sufite ức chế trực khuẩn Gram –

trong môi trường chọn lọc Streptococii

+ Lauryl sulphate ức chế phần lớn các vk

tạp nhiễm trong môi trường canh lauryl sulfate dùng tăng sinh chọn và chuẩn đoán

sơ bộ Coliforms

Các cơ chất để thử phản ứng sinh hóa + Vsv tạo enzyme phân giải hoặc biến đổi

những chất trong môi trường thành chất mới

+ Cơ chất thường dùng là đường(-ose) hoặc rượu(-ol): nồng độ cho phép 0,5 – 1%

+ Chỉ thị pH thường dùng: Bromothymol Blue (BB), Bromocresol, Neutral red và đặc biệt là phenol red

→ Phenol red đổi từ màu đỏ sang vàng khi vsv chuyển từ đường sang acid làm pH giảm

+ Sự thay đổi oxi trong môi trường được

Khi thế oxy tăng = lượng oxy trong môi trường tăng: sodium resazurin chuyển từ vàng sang đỏ, methylene blue chuyển từ không màu sang màu xanh lam

II PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG THEO THÀNH PHẦN

Môi trường tự nhiên

Có thành phần là các sản phẩm tự nhiên như dịch nước chiết thịt, nước chiết khoai tây, máu động vật, Thành phần hóa học của loại môi trường này không được xác định chính xác

do sự không ổn định của sản phẩm tự nhiên

Môi trường tổng hợp

Chứa các chất hóa học mà thành phần của chúng được xác định và định lượng một cách cụ thể và chính xác như Czapeck, Hansen, EMB, .Nhiều vi khuẩn hoá dưỡng dị dưỡng có thể sinh trưởng trong môi trường chứa glucose là nguồn cacbon và muối amôn là nguồn nitơ

Môi trường bán tổng hợp Chứa các chất hóa học lẫn các sản phẩm tự nhiên như Potato

glucose agar (PGA),

III PHÂN LOẠI THEO TRẠNG THÁI VẬT LÝ

- Môi trường rắn: chứa agar hoặc gelatin

- Môi trường lỏng

- Môi trường bán rắn

IV PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG THEO CÔNG DỤNG

 Môi trường tiền tăng sinh (preenrichment media): là môi trường lỏng dùng để

tăng sinh không có tính chọn lọc, làm giàu mật độ của vi sinh vật hiện diện trong mẫu Loại môi trường này giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế tăng trưởng đặc hiệu, có tác dụng phục hồi và giúp sự tăng trưởng đồng thời của nhiều loài VSV

 Môi trường tăng sinh (enrichment media): là môi trường lỏng dùng để tăng sinh

chọn lọc đối tượng VSV cần kiểm nghiệm, ức chế tăng trưởng của các VSV khác

do có chứa chất ức chế tăng trưởng đặc hiệu Ví dụ MT tetrathionate là MT tăng

sinh chọn lọc cho Salmonella

 Môi trường chọn lọc (selective media): là môi trường rắn dùng phân lập chọn lọc

các khuẩn lạc đơn của đối tượng VSV mục tiêu Các môi trường phân lập khác nhau

có mức độ chọn lọc khác nhau Mức độ chọn lọc có thể kiểm soát bằng chất ức chế tăng trưởng, thành phần môi trường, nhiệt độ, oxy Ví dụ: Môi trường VCN là môi

trường chọn lọc cho N meningitidis

 Môi trường phân biệt (differential media): là môi trường rắn chọn lọc chứa các

thành phần chỉ thị giúp cho sự phát hiện dễ dàng đối tượng vi sinh vật mục tiêu

 Môi trường chọn lọc - phân biệt (selective - differential media): là môi trường kết

hợp giữa công dụng chọn lọc và phân biệt nhờ sử dụng kết hợp các hóa chất khác nhau Ví dụ môi trường Manitol Salt Agar chứa nồng độ cao của muối (7.5%) giúp

sự tăng trưởng chọn lọc Staphylococcus trong khi ức chế sự tăng trưởng của đa số

các VSV khác; mặt khác mantinol và chỉ thị pH trong môi trường giúp nhận diện

các khuẩn lac Staphylococcus dựa vào khả năng lên men manitol sinh acid làm đổi

màu chỉ thị đỏ phenol

 Môi trường thử nghiệm sinh hóa: là môi trường dùng để xác định một hoặc vài

đặc điểm sinh hóa của chủng VSV đã được phân lập và làm thuần, tạo cơ sở để định danh chủng phân lập Ví dụ MT MIR (Motility Indol Red) dùng để xác định tính di động, khả năng tạo indol và khả năng phân giải ure của một chủng phân lập

V PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

1 Pha chế môi trường có qua hấp khử trùng

2 Pha chế môi trường không qua hấp khử trùng

𝑀ô𝑖 𝑡𝑟ườ𝑛𝑔 đô𝑛𝑔 𝑘ℎô 𝑑ù𝑛𝑔 𝑝ℎổ 𝑏𝑖ế𝑛 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑐á𝑐 𝑝ℎò𝑛𝑔 𝑙𝑎𝑏 𝑘𝑖ể𝑚 𝑛𝑔ℎ𝑖ệ𝑚 𝑣𝑖 𝑠𝑖𝑛ℎ. Thông thường môi trường được pha chế có giá trị pH thích hợp, không cần phải hiệu chỉnh

pH sau khi được pha chế

VI BẢO QUẢN MÔI TRƯỜNG

Bảo quản môi trường đông khô Bảo quản môi trường đã pha chế + Mt khô, tối, nhiệt độ 15 – 250C + Giữ lạnh 1 – 60C

+ Nếu chứa mật bò thì phải giữ lạnh 10 –

150C

+ Phải đậy nắp kín trách nhiễm nước Nước

vào môi trường làm môi trường sẽ bị vón

cục và thay đổi pH

+ Môi trường thạch không được giữ dưới

00C vì cấu trúc gel bị phá hủy

VII KHỬ TRÙNG VẬT LIỆU SAU KHI NUÔI CẤY

+ Thủy tinh khử trùng 30 min ở nhiệt độ 30min

Chương 3 Phương pháp thu nhận, bảo quản và chuẩn

bị mẫu thực phẩm để phân tích vi sinh vật

→ kiểm nghiệm: tăng sinh vsv, hoặc tăng sinh chọn lọc

→ làm tăng độ nhạy dễ phát hiện vi sinh vật

+ Sodium thiosulfate (Na2S2O3):

Khử mẫu có nhiều Clo bỏ vào bình trước

+ Loại bỏ kim loại nặng Na2S2O3, có thể kết hợp với Sodium thiosulfate

Lấy mẫu

+ Giới hạn mật độ vi sinh vật được qui định bởi các khoảng như sau:

m: giới hạn cho phép

M: giới hạn không chấp nhận

n: số mẫu cần lấy (5, 10, 15 ) c: số mẫu tối đa được phép vượt chỉ tiêu vi sinh m

+ Nên lấy mẫu nguyên gói

+ Nên sử dụng chai nhựa có nắp để lấy mẫu

+ Chỉ lấy 2/3 thể tích bình chứa Thể tích mẫu phải lấy không được nhỏ hơn 100mL + Chú ý: nút chai giữ không được nhiễm trong khi lấy mẫu + Sau khi lấy mẫu xong phải đậy nút miệng chai ngay

+ Nếu phải lấy mẫu một phần:

- Dụng cụ chứa mẫu theo môn

vi sinh

Ưu tiên: dụng cụ bằng nhựa hay kim loại, hạn chế sử dụng dụng cụ bằng thủy tinh

- Dụng cụ lấy mẫu như thí nghiệm vi sinh

+ Lấy mẫu ít nhất 100g cho mỗi mẫu, không được lấy mẫu đầy bình chứa

+ Kiểm soát điều kiện lấy mẫu

+ Mẫu phải có số nhận diện rõ ràng và không sử dụng các loại viết mực có thể ngấm qua bao chứa vào mẫu

+ Cách lấy mẫu nước:

- Vòi nước: khử trùng vòi nước bằng cồn hoặc nước nóng hoặc clo sau đó mở vòi chảy nước từ

2 – 3 min sau đó vặn nhỏ lại rồi lấy nước

- Nước giếng đào

- Nước sông, suối: cho bình chìm vào dòng nước và để hướng ngược bình lại để lấy nước

- Nước hồ tĩnh: đẩy bình nước

về trước để tạo dòng chảy nhân tạo

- Nước sông hồ: lấy ở giữa dòng phải cách xa bờ, không lấy sát mặt nước hay quá gần đây

+ Nếu chưa phân tích được thì chỉ bảo quản trong vòng 1h bảo

- Mẫu khô hoặc đồ hộp: vận chuyển và bảo quản ở nhiệt độ thường

- Mẫu đông lạnh chứa trong dụng cụ cách nhiệt và nhiệt độ bảo quản 0 - 40C

+ Bảo quản mẫu ở trong phòng thí nghiệm:

- Ưu tiên đến phòng thí nghiệm nên phân tích ngay

- Mẫu đông lạnh phải được bảo quản -180C không quá 72h

- Mẫu bảo quản lạnh: bảo quản 0 – 40C, không đông lạnh mẫu

* Chuẩn bị mẫu vsv:

+ Giải đông mẫu trước khi phân tích trong điệu kiện vô trùng

+ Cân mẫu chính xác sai số 0,1g

vi sinh

* Pha loãng mẫu:

100 trích 1 mL + 9mL nước cất được 10-1…

Chương 4 Phương pháp định lượng vi sinh vật

I PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP

Đếm ở vị trí 5 ô lớn, trong một ô chỉ chọn 2 cạnh liền kề và đếm số tế bào có trên hai cạnh

và số tế bào nằm bên trong ô không đếm số tế bào nằm trên 2 cạnh còn lại

80.10.4000

mL tb F n

Điều kiện: tế bào đó phải đủ lớn để có thể quan sát dưới kính hiển vi

Không dùng để xác định số tế bào khi mẫu ở dạng huyền phù vi sinh vật

II PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

+ Đếm được vsv còn sống, định lượng và chọn lọc vsv

+ Chuẩn bị dịch pha mẫu → chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu → Cấy mẫu vào môi trường,

ủ mẫu → đếm số khuẩn lạc hình thành

+ Dung dịch pha loãng mẫu:

- SPW: NaCl 8.5g, Peptone 1g, Nước cất 1L

- BPW: NaCL 5g, Peptone 10g, Nước cất 1L

- Không sử dụng nước cất và nướcmuối sinh lý để pha loãngmẫu thực phẩm

+ Pha loãng mẫu theo dãy thập phân:

Đối với mẫu rắn hoặc bán rắn 10g mẫu + 90mL dd pha loãng → F = 101

+ Cấy vào môi trường:

CFU /ml là số đơn vị khuẩn lạc trong 1 ml mẫu

Bài tập 1 Bình chứa có dung tích 8L Để tích khối lượng vi sinh vật trong bình người

ta đem 1mL + 9mL nước cất Rút 1 mL của ống 1, pha với 9mL nước cất,… tương tự làm tới ống 5 Ống 5 người ta lấy 0,1 mL để quan sát thấy 40 tế bào vi khuẩn Tính số lượng vi sinh vật ở bình 8L

8000mL → y tế bào

Vậy y = 8000.40.106 = 3,2.1011 tb

+ Xác định số tế bào trong 1mL hoặc 1g mẫu:

)01,01,0

i

n

i i

n n

n Vd

a A

Với ai số khuẩn lạc / đĩa / độ pha loãng

ni: Số đĩa ở mỗi độ pha loãng

d: độ pha loãng đầu tiên

V: Thể tích của mẫu cho vào đĩa cấy

Điều kiện: số tế bào đếm được trên mỗi đĩa phải lớn hơn hoặc bằng 25, nhỏ hơn 25 loại

với độ pha loãng và 250 với nồng độ pha loãng

Ví dụ: Phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1 gram thịt heo sống đã qua bảo quản 3

2,310111012

26235224

10-4 số đếm > 250 thì kết quả ghi: > 2,5 x 10-6 CFU/g

Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa < 25, ví dụ ở nồng độ

10-1 số đếm nhỏ hơn 25 thì kết quả ghi: < 2,5 x 10-2 CFU/g

Bài tập 2 Pha loãng mẫu và lựa chọn độ pha loãng là 10-2, 10-3, 10-4 Số đĩa đếm được của từng độ pha loãng đều là 2 đĩa Số tế bào đếm được ở độ pha loãng 10-2 là 27 và 25,

ở độ pha loãng 10-3 là 97 và 119, và ở độ pha loãng 10-4 là 207, 239 Thể tích của mẫu cho vào đĩa cấy là 0,1mL Xác định A CFU/mL or g ?

+ Phương pháp đổ đĩa, phương pháp cấy trang giống như học thí nghiệm vi sinh

III PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC ĐỂ ĐẾM VI SINH VẬT

IV PHƯƠNG PHÁP MPN

+ Pha loãng môi trường thành các độ pha loãng khác nhau rồi cấy với mỗi độ pha loãng thành 3 đến 5 ống khảo sát sự sinh hơi hoặc sự đổi màu để xác định ống dương tính Tra bảng MPN nhờ các số ống dương tính → Mật độ vi sinh vật

+ Phương pháp này giúp xác định gần đúng số vsv có trong mẫu với mật độ vsv thấp MPN/mL là số xác suất lớn nhất để đạt được CFU

Biết rằng Kết quả số ông dương tính trên loạt 5 ống nghiệm ở 3 độ pha loãng khác nhau là 5:4:1 Xác định số vsv có trong mẫu ban đầu

Đáp án: Khi tra bảng MPN, kết quả 5:4:1 cho trị số MPN là 170

Như vậy mật độ vi sinh vật trong mẫu ban đầu là 170 MPN/100ml

Bài tập 5

Đáp án: 53

Chương 5 Các thử nghiệm sinh hóa quan trọng dùng

kiểm tra định tính vi sinh vật

1 Khả năng lên men - Xác định khả năng sử dụng một

nguồn carbon nhất định bởi vsv

để tăng trưởng

- Vsv used glucid → tạo acid hữu

cơ, rượu, CO2 → giảm pH môi trường

 Các nguồn carbon:

- Monosaccharide: glucose, xylose, rhannose

- Disaccharide: saccarose, lactose

- Phenol red

- pH < 6.8: đỏ

→ vàng Mt: Phenol Red Broth

Base(pH=7.4)

 Sinh acid: (+): đỏ  vàng

(-): giữ nguyên màu

đỏ ban đầu

- Polysaccharide: tinh bột, cellulose

- Các loại đường khử: chứa –CHO

- Rượu

→ Khả năng lên men của chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid và sự sinh hơi

→ Định danh vsv đường ruột

→ Vsv lên men nguồn đường tạo acid sẽ làm giảm

pH → thay đổi màu của phenol red

2 Khả năng oxh- lên

men

Vsv dị dưỡng cần được cung cấp nguồn carbon dưới dạng chất hữu cơ(carbonhydrat) từ môi trường Thông qua 1 trong 2 hình thức biến dưỡng: lên men hoặc hô hấp

Cơ sở:

Bromocresol purple Mt: oxidation/ Fermentation media

Lên men: các sp(trên mặt + phần sâu) có tính acid của quá trình lên men → làm thay đổi màu chỉ thị pH Oxh: sp bị oxh phần đáy ống

Lên men:

Kỵ khí → tạo mt acid cao

Đổ lớp dầu khoáng

→ tạo đk kỵ khí → lên men

tạo acid nhiều → vàng

Oxi hóa:

Hiếu khí → ít acid tạo acid <

giữ nguyên

→Vàng 1 phần của ống

3 Bile Esculin - Phân biệt vsv dựa trên khả năng

thủy phân liên kết glucoside trong esculin → esculetin + glucose(có sự hiện diện của muối mật.)

Mt: Bile esculin agar

→ Nếu chủng có hoạt tính thủy phân

- Esculin là một hợp chất nhân tạo(dẫn xuất của acetaldehyde của một monosaccharide)

Cơ sở sinh hóa: Esculetin + Fe2+ → đen

Cơ sở sinh hóa:

→ Có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất Sự phân giải muối ammonium  sinh NH3 làm kiềm hóa mt

pH<6 pH pH>7.6 acid trung tính kiềm

Bromothylmol Blue

pH=6.9 Mt: SCA (Simmons Citrate Agar)

Pứ (+): xanh dương

Pứ (-) : xanh lục(màu của mt)

5 Khả năng biến

dưỡng Malonate

Vsv có khả năng sử dụng Malonate làm nguồn carbon duy nhất để thu năng lượng và vật chất

Cơ sở sinh hóa: Same thử nghiệm biến dưỡng Citrate

6 Catalase Catalase thủy phân hydrogen

peroxide(H2O2) H2O2 → H2O + O2, ngăn cản sự tích tụ của pt có độc trong tb

→ Phát hiện vsv có hệ enzyme Catalase trong tb

Cơ sở sinh hóa:

Catalase hiện diện ở vsv hiếu khí và kỵ khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome

→ Phân biệt vsv hiếu khí với vsv kỵ khí

H2O2 30%

Thử nghiệm: Trên KHV

Trên đĩa petri

Pứ (+): sủi bọt khí(O2 tạo ra)

Pứ (-): không có sủi bọt

7 Decarboxylase Đk kỵ khí: enzyme carbonxylase xúc tác

pứ cắt nhóm carboxyl  amine, diamine, CO2

 3 thử nghiệm quan trọng:

LDC(lysine decarboxylase) ODC(ornithine decarboxylase) ADC(arginine decarboxylase)

→ CO2 tăng → tăng pH

Mt: Decarboxylase Basal Medium Bromocresol Purple pH5.2-6.8 Pứ(+): pH mt tăng

→ tím đục

Pứ(-): pH mt giảm

→ vàng

8 Coagulase - Enzyme Coagulase làm kết tụ các

thành phần của huyết tương →

Huyết tương/fibrinogen