SAN XUAT LYSINE công nghệ sinh học

ứng dụng của sản xuất lysine trong đời sống và trong nhiều lĩnh vực như trong sản xuất nông nghiệp, sản xuất vacxin, sản xuất probiotic, đặc biệt trong sản xuất sữa sản phẩm chuyên dùng của mọi người... của ngành công nghệ sinh học... thuộc các sản phẩm công nghệ sinh học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

Công nghệ sản xuất lysine

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 2 1 Động thái sinh tổng hợp lysine

Hình 2 2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến sản lượng L – lysine

Hình 2 3 Thiết bị thanh trùng bản mỏng

Hình 2 4 Thiết bị lọc

Hình 2 5 Hệ thống 2 cột trao đổi ion

Hình 2 6 Hệ thống sắc kí trao đổi ion trong công nghiệp

Hình 2 7 Máy cô đặc chân không 2 lớp

Hình 2 8 Máy sấy phun tốc độ cao

TÊN CHỦ ĐỀ

1 Tổng quan

Cơ thể người cũng như động vật đều cần các chất cơ bản giúp cơ thể tồn tại và hoạtđộng như protein, lipid, glucid Bên cạnh đó cũng có một số chất tuy hàm lượng cần bổ sungnhỏ nhưng nếu thiếu thì cơ thể khó hoạt động bình thường và khỏe mạnh như vitamin, các chấtkhoáng, các acid amin Một acid amin chúng ta thường không quan tâm đến nhưng vô cùngquan trọng mà cơ thể con người và động vật không thể tự sản xuất được, phải cung cấp trongquá trình ăn uống là lysine, chỉ cần bổ sung đầy đủ lysine thì những acid amin còn lại cũngtăng theo

tử lysine có một cacbon bất đối xứng nên chúng có hai dạng đồng phân quang học: D-Lysinevà L-Lysine Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khảnăng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái làm tính chất sinhhọc của chúng hoàn toàn khác và cơ thể sinh vật sống chỉ hấp thu được lysine dạng L Lysinecòn có tên gọi khác là acid α-e-diamoinocaproic và 2,6-diaminohexanoic acid (Vũ Đình Bính,2010)

Hình 1.1 Công thức cấu tạo

Hình 1.1 Các dạng đồng phân hóa học của lysyne

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của lysine

5 Tính chất

Lysine dễ tan trong nước, acid và kiềm, khó tan trong cồn và không tan trong ether Nó

bị phân hủy ở nhiệt độ 224 – 2250C Lysine tinh thể có màu trắng đục, hình lục giác, có vị chát

Giống như những acid amin không thay thế khác, lysine có thể tham gia phản ứngchuyển amin để tạo thành các acid amin khác.Nhưng nó không có khả năng tự tái sinh, nghĩa làkhi đã bị phân hủy thì không có khả năng tự tổng hợp trở lại Loại acid amin này cần phải đượccung cấp cho người và động vật dưới dạng thức ăn (Quản Lê Hà, 2011)

6 Lịch sử phát triển

Việc sản xuất lysine qui mô lớn với nguyên liệu là thực vật, lên men nhờ vi khuẩn

Corynebacterium glutamicum đã bắt đầuvào năm 1958 bởi Kyowa Hakko ở Nhật Bản Những công ty khác tham gia việc thương mại và sau đó suốt 4 thập kỉ sản xuất với Corynebacterium glutamicum, công nghệ sinh học chế tạo ra L – lysine đã được cải thiện không ngừng và sự tiến

bộ về kỹ thuật tạo ra số lượng lớn lysine đáp ứng nhu cầu ngày nay Sản lượng lysine sản xuấttrên toàn thế giới tăng không ngừng Năm 1983, sản lượng lysine sản xuất trên toàn thế giới là

70000 tấn /năm nhưng đến năm 2000 chỉ còn 55000 tấn/năm Nhiều nhà máy sản xuất L –lysine còn được xây dựng ở Mỹ, Tây Ban Nha, các nước Cộng hòa Liên Xô (cũ) và Nam Tư(cũ)… (Nguyễn Thùy Châu, 2006)

Nhu cầu lysine tại Châu Á Thái Binh Dương tăng 8-10% do ngành sản xuất thức ănchăn nuôi phát triển mạnh, mặc dù nhu cầu lysine tại một số quốc gia trì trệ do giá hàng hóatăng và cúm gia cầm bùng phát Các nước sử dụng nhiều lysine nhất tại Châu Á Thái BinhDương là Thái Lan, Hàn Quốc, Việt Nam Đặc biệt nhất là nhu cầu tăng mạnh mẽ tại ViệtNam (A.M.Bezborodov, Nguyễn Văn Uyển và cáccộng sự, 1994) Việc gia tăng nhanh chóngsản lượng L – lysine trên thế giới đồng nghĩa với nhu cầu rất lớn về sản phẩm này

7 Vai trò

Trong cơ thể, lysine đóng vai trò như các acid amin không thay thế khác, ngoài việc gópphần xây dựng tế bào, còn đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa các chất Khôngnhững chỉ có giá trị sinh học của protein mà nó còn thực hiện nhiều chức năng sinh hóa khác:có tác dụng làm cho các enzyme dịch vị tiết ra, đồng thời góp phần vào việc vận chuyển calcitrong tế bào, làm cân bằng nito trong cơ thể Thiếu lysine, cơ thể con người sẽ không hoạt động

được bình thường, đặc biệt đối với trẻ em, nếu thiếu lysine sẽ dẫn đến hậu quả chậm lớn, còicọc, trí tuệ kém phát triển Nhu cầu của người lớn là 4g/ngày, tương đương với 1,5 kg gạo; 2 kgngô và 14 kg khoai lang tươi.

Hệ số đồng hóa của protein ở động vật cũng phụ thuộc vào thành phần lysine có trongthức ăn Chỉ thêm từ 0,1 đến 0,4% lysine cũng làm giảm tỷ lệ tiêu hao thức ăn một cách đáng

kể Nhu cầu về lysine đối với gia súc, gia cầm rất cao Trung bình đối với gà và lợn, cần 4,2đến 4,5% tổng số protein trong khẩu phần ăn Nếu thiếu lysine, hiệu suất chuyển hóa proteintrong thức ăn thành protein của động vật sẽ thấp Ngoài ra, lợn có thể bị giảm khối lượng, lười

ăn, da khô, rụng lông

Lysine còn ảnh hưởng đến việc tổng hợp hemoglobin Khi khẩu phần ăn thiếu kali thìlysine tự do càng quan trọng vì nó trở thành cation duy trì sự cân bằng ion trong tế bào của bắpthịt

Lysine cần thiết để duy trì trạng thái bình thường của hệ thần kinh Không đủ lysinetrong chế độ dinh dưỡng sẽ gây hiên tượng buồn nôn, chóng mặt Khi thiếu lysine, một lượnglớn các acid hữu cơ không có nhóm ceto sẽ bị bài tiết ra ngoài cùng nước tiểu (Quản Lê Hà,2011)

8 Ứng dụng

9 Trong công nghệ thực phẩm

Lysine làm cải thiện chất lượng thực phẩm bởi làm cân đối các acidamin trong thựcphẩm Nó được sử dụng như là một chất tăng cường dinh dưỡng vì có thể nâng cao hiệu số sửdụng protein Ngoài ra có thể sử dụng để làm chất phụ gia

Người bình thường mỗi ngày cần 1g lysine Tuy nhiên, cơ thể không tự tổng hợp đượcchất này mà phải được cung cấp qua thực phẩm (như lòng đỏ trứng, cá, thịt, các loại đậu và sữatươi) hoặc bổ sung dưới dạng thuốc Trong khẩu phần ăn của người Việt Nam, lượng ngũ cốcchiếm đến 70-80% nên thường bị thiếu lysine, đặc biệt là những người ăn chay (chủ yếu dùngngũ cốc và một lượng rất nhỏ rau họ đậu), vận động viên, bệnh nhân bỏng, mụn rộp Để cung

cấp đủ vi chất này, cần cân đối lại khẩu phần, ăn đủ các thực phẩm như trứng, cá, sữa tươi Tuynhiên, lysine trong thực phẩm rất dễ bị phá huỷ trong quá trình đun nấu Cung cấp lysine quathuốc là không cần thiết đối với người bình thường Hơn nữa, việc dùng thuốc phải có sự chỉđịnh, hướng dẫn của bác sĩ và tuân thủ đúng các hướng dẫn đó, vì mọi loại dược phẩm khidùng không đúng đều có thể gây hại Riêng với lysine, liều lượng quá cao có thể gây chứngcăng cơ bụng và bệnh tiêu chảy Theo các chuyên gia dinh dưỡng, cách cung cấp lysine tiện lợivà hiệu quả nhất là sử dụng các loại thực phẩm chế biến sẵn có bổ sung chất này với một lượngnhỏ, vừa đủ cho nhu cầu của người bình thường, chẳng hạn như sữa tươi Ở các nước phươngTây, nơi có tốc độ phát triển chiều cao khá lý tưởng, các loại sữa tươi chứa lysine rất phổ biến.Hiện nay, tại Việt Nam cũng đã bắt đầu xuất hiện những sản phẩm sữa tươi chứa vi chất này.Công ty nội địa đầu tiên cung cấp sữa tươi bổ sung lysine là Hanoimilk với nhãn hiệu IZZI Kể

từ khi xuất hiện đầu năm 2003, một lượng lớn sữa IZZI chứa lysine trên thị trường đã được tiêuthụ (Bùi Thanh Mai, 2004)

Hình 1.3 Sản phẩm sữa IZZI chứa lysine

10 Trong chăn nuôi

Lysine được ứng dụng trong chăn nuôi và đem lại hiệu quả kinh tế lớn Nếu bổ sung0,9% lysine vào khẩu phần thức ăn cho gà thì tăng khối lượng 28,9% Có thể giảm chi phí thức

ăn cho lợn tới 18% Trong chăn nuôi sử dụng lysine thô có lợi hơn so với lysine tinh khiết vìcòn chứa các vitamin B1, B2, PP (Quản Lê Hà, 2011)

Hình 1.4 Các sản phẩm lysine dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

11 Trong Y học, Y dược

Lysine thường được dùng làm thành phần trong thuốc chữa bệnh, hồi sức Một sốnghiên cứu đã tìm thấy rằng uống lysine trên cơ sở thường xuyên có thể giúp ngăn ngừa sựbùng phát của các vết loét lạnh và herpes sinh dục Lysine có tác dụng kháng virus bằng cáchngăn chặn hoạt động sao chép của Herpes Simplex Virus (HSV)

Lysine giúp cơ thể hấp thụ canxi và làm giảm lượng canxi bị mất trong nước tiểu Bởi vìcanxi rất quan trọng cho sức khỏe của xương, các nhà nghiên cứu nghĩ rằng lysine có thể giúpngăn ngừa mất xương liên quan đến loãng xương Phòng thí nghiệm nghiên cứu cho rằnglysine kết hợp với L-arginine làm cho xương các tế bào xây dựng tích cực hơn và tăng cườngsản xuất collagen.(http://duocanbinh.vn/)

Hình 1.5 Các sản phẩm thuốc

12 Các phương pháp tổng hợp lysine

13 Thủy phân protein

Dùng acid hoặc kiềm để thủy phân các nguyên liệu chứa nhiều protein như bột mì, bộtđậu nành, protein từ máu, keratin Phương pháp này hiện nay vẫn đang được sử dụng rộng rãi.Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là:

- Thiết bị phải chịu được acid hay kiềm

- Sử dụng kiềm để thủy phân sẽ tạo ra nhiều acid amin dạng D

- Sử dụng acid để thủy phân sẽ ô nhiễm môi trường không khí do lượng acid dư bayhơi trong quá trình thủy phân

- Giá thành thường cao (Vũ Đình Bính, 2010)

14 Phương pháp tổng hợp hóa học

Phương pháp này cũng được áp dụng nhiều trong thực tế

Ưu điểm:

- Sản xuất ổn định

- Có thể tiêu chuẩn hóa điều kiện sản xuất

- Đảm bảo hiệu suất

Nhược điểm:Thu được các acid amin dạng Racemic( L và D- acid amin) mà cơ thể không sử

dụng dạng D nên công đọan tách ra rất phức tạp.(Vũ Đình Bính, 2010)

15 Phương pháp kết hợp

Người ta kết hợp phương pháp hóa học và sinh học Bằng con đường hóa học, thu nhậnhợp chất dạng L-Keto và các tiền chất của acid amin Sau đó sử dụng vi sinh vật để chuyển hóanhững chất này thành acid amin

Nhìn chung, phương pháp dùng vi sinh vật để chuyển các chất tiền thân của acid amin thành acid amin tương ứng là một phương pháp có nhiều triển vọng và thường được

sử dụng trong sản xuất lysine

Cơ sở khoa học của phương pháp là: trong quá trình trao đổi chất, vi sinh vật có khảnăng tích lũy acid amin trong môi trường Ở điều kiện sống bình thường, lượng acid amin màchúng tổng hợp được thường đủ đáp ứng nhu cầu bản thân, nhưng trong điều kiện nào đó,lượng acid amin này có thể vượt xa nhu cầu bản thân và tích lũy lại trong tế bào hay thoát

ra môi trường Hiện tượng này được gọi là siêu tổng hợp acid amin của vi sinh vật (Vũ ĐìnhBính, 2010)

16 Phương pháp tổng hợp bằng công nghệ vi sinh vật

Người ta lợi dụng khả năng sinh tổng hợp thừa một số loại acid amin của một số vi sinhvật, vì vậy mà người ta tiến hành nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận các acid amin

Ưu điểm:

- Phương pháp này cho phép ta thu nhận acid amin dạng L

- Nguyên liệu để sản xuất rẻ, dễ kiếm

- Tốc độ trao đổi chất, tốc độ sinh sản và phát triển mạnh của vi sinh vật có năng suấtcao

- Giá thành sản phẩm thấp hơn giá thành sản phẩm từ các phương pháp khác

Nhược điểm:

- Thời gian lên men dài

- Sản phẩm có thể lẫn tạp chất do tế bào tiết ra (Vũ Đình Bính, 2010)

Bảng 1.1 Ưu nhược điểm của 4 phương pháp tổng hợp lysine

Phương pháp thủy

phân

Dùng acid hoặckiềm để thủy phântinh bột chứaprotein

Sử dụng rộng rãiPhản ứng nhanhvà triệt để

Để điều khiển và

kiểm soátSản phẩm ít tạpchất

Cần thiết bị chịuacid và kiềmTạo ra nhiềulysine dạng D khithủy phân bằngkiềm

Dùng acid gây ônhiễm môi trườngGiá thành caoPhương pháp hóa

học Dùng hóa chất đểtổng hợp nên

lysine

Phản ứng nhanh

Dễ thực hiệnSản phẩm ít tạpchất

Cho ra raxemic(hỗn

hợplysinedạng Dvà L) tốn kếm khitách

Giá thành caoPhương pháp lên

men

Nhờ khả năngtổng hợp thừa củamột số vi sinh vật,nuôi cấy thu nhậnlysine

Thu lysine dạng LNguyên liệu sảnxuất rẻ tiền

Năng xuất cao dophản ứng đặc hiệuKhông gây ônhiễm môi trường,và có thể dùngnguyên liệu phếthải từ nhà máy

Thòi gian lên mendài

Điều kiện phảnngứ khó, và phứctạp do điều kiện tếbào sống

Đòi hỏi phải có

kiến thức vi sinhSản phẩm có thể

bị lẫn tạp chất do

tế bào tiết raSản phẩm ức chếngược lại tế bàolàm giảm hiệu suấtphản ứng

Phương pháp kết

hợp hóa học và

sinh học

Kết hợp giữa conđường hóa học và

sinh học

- Con đường hóahọc thu nhận đượchợp chất dạng L-keto và các tiềnchất của lysine,sau đó sử dụng visinh vật để chuyển

Rút ngắn thời gianlên men

Tạo ra các hợpchất trung giankích thích sự sinhamino acid của tếbào nhiều

Năng suất cao

Con đường hóahọc gây ô nhiễmmôi trường

Tốn nhiều kinh phíGiá thành sảnphẩm cao

hóa những chấtnày thành lysine.

17 Hiện trạng sản xuất

Năm 2000, tổng sản lượng lysine trên thế giới là 550 nghìn tấn và thị trường tăng 7 10% mỗi năm Hiện nay hơn 600 nghìn tấn lysine dược sản xuất mỗi năm, chủ yếu tại các côngty: ADM (USA), Ajinomoto (Nhật Bản), BASF (Đức), CJ (Hàn Quốc) và Degussa (Đức) (LêĐan Huy, 2013)

-Bảng 1.2 Sản lượng Lysine sản xuất năm 2006

Hiện nay tại Việt Nam, nhu cầu sử dụng lysine cho thực phẩm con người và thức ănchăn nuôi gia súc gia tăng nhanh chóng Hằng năm, chúng ta phải nhập khẩu 100% lysine với

số lượng lớn Trong những năm qua (1980 – 1985), TS Hồ Sưởng, Viện công nghiệp Thựcphẩm đã sản xuất lysine từ chủng tự nhiên có tên là VTP 22 (không có tên chi và tên loài) ởquy mô 5000l/mẻ, chủng này cho sản lượng lysine 30 – 35g/l TS Ngô Tiến Hiển cũng đãnghiên cứu lên men lysine theo phương pháp bề mặt TS Ngô Thị Mại và cộng sự cũng đã

nghiên cứu về lysine, chủng sản xuất là chủng Corynebacterium glutamicum tự nhiên lấy từ

nguồn ATCC Tuy nhiên thách thức lớn nhất đối với chúng ta là có rất ít nghiên cứu hoànchỉnh về L-lysine và chưa có cơ sở nào triền khai sản xuất L – lysine quy mô công nghiệp, giáthành hạ (Nguyễn Thùy Châu, 2006)

18 Vi sinh vật lên men lysine

19 Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp lysine

Có nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp lysine với lượng khác nhau như:

Corynebacteriumglutamicum, Brevibacteriumflavum, Brevibacteriumlactofermentum, Corynebacteriumacetophilum, Bacilusmethanolicus, Ustilagomaydis, Torulopsisutilis, Bacilusmegaterium, Aerobacterderogences, Escherichia coli, Streptomyces coloniformis, Mycobacterium tuberculocis, Pseudomonas fluorescens,…

Trong sản xuất quy mô công nghiệp, việc lựa chọn loài vi sinh vật tích lũy được nhiềuacid amin là quan trọng nhất Từ đó cần phải tiến hành phân lập giống, tuyển chọn, gây độtbiến,chọn điều kiện tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp (Nguyễn Đức Vịnh, 2014)

20 Đặc điểm của chủng vi khuẩn lên men L – lysine dùng trong sản xuất

Trong tự nhiên có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp lysine, nhưng số chủng vikhuẩn có khả năng sinh tổng hợp thừa lysine có thể sử dụng để sản xuất theo qui mô côngnghiệp không nhiều Trong sản xuất công nghiệp, người ta thường sử dụng những chủng vikhuẩn đột biến để sản xuất lysine Các chủng vi khuẩn được sử dụng nhiều trong công nghiệpnhư:

- Trực khuẩn thẳng hoặc cong, đa hình thái,kích thước tế bào từ 0,6-1,2 μm

- Không có tiên mao, bất động, không sinh nha bào, không hình thành bào tử

- Hình dạng và kích thước có thay đổi nhiều khi nhuộm màu, tế bào thường tạo thànhcác đoạn nhỏ bắt màu khác nhau (Nguyễn Lân Dũng, 2003)

Nhiều chủng được tuyển chọn qua các bước làm đột biến và thu được những chủng mớicó hoạt lực cao hơn nhiều so với chủng nguyên thủy Đặc tính của những chủng này là cầnbiotin với lượng cao hơn nhiều so với chủng nguyên thủy sinh acid glutamic, chịu được ở nồng

độ đường lớn tới 20% hoặc cao hơn và đặc biệt là cần một số acidamin cho sinh trưởng, cũngnhư sinh tổng hợp L-lysine (Nguyễn Thùy Châu, 2006)

Chủng vi khuẩn Corynebacterium glutamicum thường được chọn vì:

- Sống được trên môi trường có hàm lượng methionine cao và threonine thấp

- Tương đối dễ nuôi và áp dụng vào công nghệ lên men ở quy mô công nghiệp

- Có khả năng tổng hợp lysine với mức độ cao (sản lượng lysine tạo ra ngày càng tăngnhờ các giống đột biến) (Lê Đan Huy, 2013)

21.Đặc điểm hình thái của Corynebacterium glutamicum

Hình 1.6 Tế bào Corynebacterium glutamicum

C glutamicum thuộc vi khuẩn Gram (+), là trực khuẩn, phân nhánh, không sinh bào tử,

sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí và không có khả năng di động, kích thước từ 1,5 – 2 μm.Khuẩn lạc đặc trưng có dạng hình tròn, trơn, màu vàng chanh, kích thước từ 1 – 1,5 mm.(Nguyễn Thùy Châu, 2006)

22 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của C glutamicum

- Hoạt tính catalase: (+)

- Khả năng khử NO3- , NO2-: (+)

- Lên men đường glucose: (+)

- Khả năng khử H2S: (-)

- Khả năng làm lỏng gelatine: (+)

- (Nguyễn Thùy Châu, 2006)

23 Cơ chế sinh tổng hợp L – lysine của chủng C Glutamic

Sơ đồ 1.1 Cơ chế tổng hợp L – lysine của C glutamicum

Lysine là một acid amin thuộc họ aspartate và được tổng hợp qua một con đường traođổi chất phân nhánh mà qua đó homoserine, methionine, threonine và isoleucine cũng được tạothành (Nguyễn Thùy Châu, 2006) Cơ chế sinh tổng hợp lysine được giải thích từ aspartate.Một con đường sinh tổng hợp biến aspartate thành lysine, còn con đường kia thì sinh rahomoserine Homoserine là sản phẩm trung gian để tạo thành threonine, isoleucine hoặc tạo ramethionine Khi phá vỡ sự tổng hợp threonine, isoleucine, methionine ở giai đoạn hình thànhhomoserine thì hướng của phản ứng sẽ chuyển sang tổng hợp lysine (Quản Lê Hà, 2011)

Bên cạnh đó, các sản phẩm trao đổi chất là chất làm giảm các hoạt tính của enzymetham gia vào quá trình tổng hợp lysine (Quản Lê Hà, 2011) Enzyme aspartate kinase chịu ứcchế ngược của L-lysine và threonine Enzyme homoserine dehydrogenase chịu sự ức chế ngượccủa threonine (NguyễnThùy Châu, 2006) Như vậy muốn loại bỏ sự ức chế ngược để tổng hợp

dư thừa lysine, ta phải cải tạo giống theo hướng làm giảm tính nhạy của enzyme aspartokinasevới hỗn hợp sản phẩm trên và ức chế enzyme homoserine dehydrogenase để hướng của phảnứng chuyển sang tổng hợp lysine

Có 3 phương pháp được dùng để loại bỏ sự ức chế ngược:

- Sử dụng chủng đột biến trợ dưỡng cần homoserine Chủng này có thể mọc được khitrong môi trường có threonine và methionine Với nồng độ acid amin này thấp thìaspartate kinase sẽ không bị ức chế và L – lysine sẽ tạo thành nhiều hơn Bằng cách

sử dụng các thể đột biến cần homoserine và khuyết homoserine dehydrogenase màthreonine không được tạo thành Nhờ vậy sự ức chế do sản phẩm cuối bị triệt tiêu vàcon đường sinh tổng hợp dẫn tới sản xuất thừa lysine

- Sử dụng các chủng đột biến mẫn cảm cao với threonine Enzyme homoserinedehydrogenase có thể bị ức chế ở nồng độ threonine rất thấp và aspartate kinase cóthể không bị ức chế

- Sử dụng các chủng đột biến có khả năng kháng các chất tương đồng củaenzyme.Cấu trúc của L – lysine khá giống với AEC (S – aminoethylcysteine) Trongquá trình tuyển chọn chủng giống , để thu được chủng bền với ức chế ngược, cácchủng đột biến bền vững với AEC và L – threonine đã được phân lập Chúng có

enzyme aspartate kinase không bị ức chế ngược bởi L – lysine và threonine.

Hình 1.7 Cấu trúc lysine và dạng tương đồng của nó S – aminoethylcysteine AEC

Hiện nay các nhà khoa học đã sử dụng các kỹ thuật đột biến bằng hóa chất(nitrosoguanidin, rafinate) và kỹ thuật sinh học phân tử (tách dòng và biểu hiện các gendihydrodipicolinate synthase, aspartate kinase, dihydrodipicolinate reductase) nhằm tăng hoạtlực của các chủng sản xuất (Nguyễn Thùy Châu, 2006)

24 Quy trình sản xuất theo phương pháp lên men

Môi trường phân lập D2 cho Corynebacterium (g/l): Agar 15g, glucose 10g; LiCl 5g;

đậu tương thủy phân 4g; nước chiết nấm men 2g; Tris amino methanHCl 1,2g; NH4Cl 1g;MgSO4 0,3g; polymicin sulfate 10ml; NaNO3 10ml; pH = 6,9

Thao tác: cân 1 g mẫu đất đã được trộn đều cho vào các ống nghiệm chứa 9ml môitrường D2, trộn đều mẫu bằng thiết bị lắc minishaker, để lắng ở điều kiện phòng trong 30 – 60phút Hút 20 μl dịch trong trải đều lên thạch có chứa môi trường phân lập D2 , trang đều Nuôicấy ở 300C, sau 36 – 48h lấy ra quan sát Phân loại Corynebacterium (theo khóa phân loại

Bergey) và khảo sát khả năng sinh lysine của chúng Kết quả ta thu được 200 chủng

Corynebacterium có khả năng sinh lysine

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp L – lysine của 200 chủng Corynebacterium có khả năng sinh

lysine phân lập được trên môi trường thích hợp D2 Ta thu được kết quả sau:

Bảng 2.1 Khả năng sinh tổng hợp L – lysine của 200 chủng Corynebacterium

Kết quả ở bảng 2.1 cho thấy, từ 200 chủng Corynebacterium có 160 chủng có khả năng

sinh tổng hợp L – lysine ở mức 1 – 2g/l, 16 chủng có khả năng sinh tổng hợp L – lysine ở mức

3 – 9g/l, 16 chủng có khả năng sinh tổng hợp L – lysine ở mức 10 - 12g/l, 8 chủng có khả năngtổng hợp L – lysine ở mức cao nhất là từ 13 – 15g/l trong đó có 2 chủng đạt mức 15g/l

Để định loại các chủng vi khuẩn, quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, kích thước tếbào, sự hình thành bào tử của 10 chủng vi khuẩn sinh L – lysine cao phân lập từ mẫu đất

Bảng 2.2 Kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc, kích thước tế bào và bào tử của 10 vi khuẩn

Corynebacterium có khả năng sinh tổng hợp L – lysine cao

Có 8 chủng có đặc điểm hình thái đặc trưng của loài C glutamicum đó là các loài C glutamicum 3600, C glutamicum 30 (26), C glutamicum 30, C glutamicum 32 (1), C glutamicum 137, C glutamicum 36, C glutamicum 335, C glutamicum 89

Tiếp tục các phản ứng sinh hóa, sinh lý với 8 chủng vi khuẩn trên, kết quả như sau: