Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối sơi Ganoderma lucidum

Từ những kinh nghiệm lưu truyền trong nhân gian, loài người đã biết sử dụng Linh chi theo nhiều cách khác nhau.Đến nay khoa học kỹ thuật phát triển, nấm Linh chi còn được các nhà khoa họ

Phần 1: MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo chúng ta đã biết thì Linh chi là một trong dược thảo thiên nhiên được xếp vào loại thượng dược Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh Chi đã được dùng để làm thuốc, các sách dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhận Linh Chi được sử dụng làm thuốc từ lâu đời Giá trị dược liệu của linh chi đã dược ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung Quốc, cách nay hơn 4000 năm (Zgao, J.D., 1994) Từ những kinh nghiệm lưu truyền trong nhân gian, loài người đã biết sử dụng Linh chi theo nhiều cách khác nhau.Đến nay khoa học kỹ thuật phát triển, nấm Linh chi còn được các nhà khoa học trên thế giới chứng minh được tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh: ung thư, cao huyết

áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan siêu vi, suy nhược thần kinh… [3, 9]

Hiện nay Linh chi không còn khan hiếm như lúc trước do con người có thể áp dụng kỹ thuật để nuôi trồng Linh chi trong môi trường nhân tạo và ngày càng phát triển mạnh trên thế giới và đạt đến quy mô công nghiệp Trong hai thập niên gần đây, các nhà khoa học ở nước Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Singapore, Hongkong đã tăng cường nghiên cứu sản xuất nấm Linh Chi và mở rộng hiệu quả sử dụng dược liệu này

Tại thị trường Việt Nam, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh ở trong nước cũng như xuất khẩu ngày càng tăng Nhiều cơ sở đã tiến hành nghiên cứu nuôi trồng, chế biến và thăm dò các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi Các thành phần hóa học có trong nấm Linh chi rất phong phú bao gồm các nhóm: acid béo, steroid, alcaloid, protein, polysaccharide… [19] Trong đó thành phần có tác dụng dược lý quý báu, đặc trưng cho nấm Linh chi phần lớn thuộc nhóm triterpenoid [2]

Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa và nguồn nguyên liệu cellulose dồi dào, đã tạo điều kiện cho nghề trồng nấm không ngừng phát triển Hiện nay cả nước có 32/61 tỉnh thành đã có cơ sở nuôi trồng nấm dược liệu (tháng 12/2001) [6]

Dựa vào tình hình ngày càng phát triển của ngành nấm ở Việt Nam và sự cho phép của bộ môn công nghệ sinh học của Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ TP Hồ Chí

Minh chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối sơi

“Ganoderma lucidum”.

1.2 MỤC ĐÍCH

Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối nấm Linh chi

1.3 YÊU CẦU

Xác định các yếu tố dinh dưỡng đến tốc độ phát triển của sợi nấm Linh chi

Xác định các yếu tố pH, xác định đường cong tăng trưởng của sợi nấm Linh chiTối ưu hóa điều kiện nuôi cấy sợi nấm theo quy trình thực nghiệm

Phân tích thành phần hoạt chất có trong sợi nấm

1.4 HẠN CHẾ ĐỀ TÀI

Chưa khảo sát hết các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến môi trường nuôi cấy

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 NẤM LINH CHI [2, 5, 6, 12]

2.1.1 Khái quát chung

Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, người miền Bắc xưa còn

gọi là nấm lim Trong thư tịch cổ nấm Linh chi còn được gọi với tên khác như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung…

Nấm Linh chi thường phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chúng thường phát triển trên giá thể là gỗ mục hoặc các nguyên liệu có chất sơ

Hình thái quả thể nấm Linh chi được mô tả như sau: Tai nấm hóa gỗ, hình quạt hoặc thận Mặt trên mũ có vân đồng tâm và bóng loáng, màu vàng cam cho đến màu đỏ đậm hoặc nâu đen Mặt dưới phẳng, có nhiều lổ nhỏ li ti, là cơ quan sinh bào tử Cuống nấm đặc và cứng, sậm màu và bóng loáng

Giá trị dược liệu của Linh chi đã dược ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung Quốc, cách nay hơn 4000 năm (Zgao, J.D., 1994) Trong sách “Thần nông bản thảo“ cách đây khoảng 2000 năm thời nhà Châu và sau đó được nhà dược học nổi tiếng Trung Quốc

Lý Thời Trân phân ra thành “Lục Bảo Linh Chi“ thời nhà Minh với các khái quát công dụng dược lý khác nhau, ứng theo từng màu (Lý Thời Trân, 1590)

Theo Lý Thời Trân thì nấm Linh chi có 6 màu khác nhau:

 Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi)

 Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi)

 Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi)

 Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi)

 Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi)

 Tử chi (Linh chi tím)Cho đến nay Linh chi không còn giới hạn trong phạm vi đất nước Trung Quốc, mà mang tính toàn cầu Hiện tại có khoảng 250 bài báo của các nhà khoa học liên quan đến dược tính và lâm sàng của Linh chi đã được công bố

Cấu trúc độc đáo của Linh chi chính là thành phần khoáng vi lượng đủ loại, trong

đó một số khoáng tố như germanium, vanadium, crôm Chúng đã được sử dụng là nhân

tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào với hàm lượng rất thấp

Ở các nước Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…, việc nghiên cứu phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm Đồng thời nghiên cứu hóa dược các hoạt chất có tác dụng dược lý và phương pháp điều trị lâm sàng

Ở Việt Nam, trong các tài liệu lưu lại của Hải Thượng Lãn Ông, Lê Hữu Trác (1720-1791) cũng thấy đề cập đếnllinh chi Sau đó, Lê Quý Đôn còn khẳng định, đây là

nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam Trong quyển “Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” (1991), giáo sư Đổ Tất Lợi còn mô tả chi tiết và trình bày về đặc tính trị liệu của

loài nấm này, đồng thời cho rằng đây là loại Siêu thượng dươc

2.1.3 Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Linh chi

2.1.3.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)

Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại Từ khi xác lập thành

một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay tính ra có hơn 200 loài được ghi nhận, riêng Ganoderma lucidum đã có 45 loài [3]

Nấm Linh chi là một trong những loại nấm phá gỗ, đặc biệt trên các cây thuộc bộ

Đậu (Fabales) Nấm xuất hiện nhiều vào mùa mưa, trên thân cây hoặc gốc cây Ở Việt

Nam Nấm Linh chi được gọi là nấm Lim và được phát hiện ở miền Bắc bởi Patouillard N.T (1890 đến 1928)

Hình 2.1: Nấm Linh chi

Nấm Linh chi (quả thể) cây nấm gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến đối diện với mũ nấm) Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5-3cm Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm

Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có hình quạt Trên mặt mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím nhẵn bóng như láng vecni Mũ nấm có đường kính 2 - 15cm, dày 0,8 - 1,2cm, phần đính cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm

2.1.3.2 Chu trình sống của nấm Linh chi

Hình 2.2: Chu trình phát triển của nấm Linh chi [5]

2.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐẶC TÍNH DƯỢC LÝ CỦA NẤM LINH CHI

(GANODERMA LUCIDUM)

Các phân tích của G-Bing Lin đã chứng minh các thành phần hóa dược tổng

quát của nấm Linh chi như sau : [18]

Polysaccharide: 1.0 – 1.2% (chống hoạt động khối u, tăng

sức đề kháng và hệ miễn dịch cho cơ thể)

Sterol: 0.14 – 0.16%

Thành phần khác: K, Zn, Ca, Mn, Na, khoáng thiết yếu,

nhiều vitamin, amino acid, enzyme và hợp chất alcaloid

Quả thểSợi nấm song nhân

Sợi nấm đơn nhân

Đảm và bào tử đảm

Phối nhân trong đảmĐảm

Từ những năm 1980 đến nay, bằng các phương pháp hiện đại: phổ kế UV (tử ngoại), IR (hồng ngoại), phổ kế khối lượng - sắc ký khí (GC – MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân và đặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cùng phổ kế plasma (ICP), đã xác định chính xác gần 100 hoạt chất và dẫn xuất trong nấm Linh chi [2]

Bảng 2.1: Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi (Ganoderma

lucidum) [19]

Thành phần hoạt

Loại mô nấmARN Nucleic acid Kích thích hệ miễn dịch

**(Không xác

Adenosine Nucleotide Tăng sự lưu thông máu

Thư giản cơ, giảm đau Quả thể

Beta – D - glucans Polysaccharide

Chống khối uKích thích hệ miễn dịchGiảm lượng đường huyết

Bổ tim

Quả thể

Ganoderic Acids Triterpenoid

Chống dị ứng Bảo vệ gan

Ức chế tổng hợp cholesterol

Quả thể

Ganodermadiol Triterpenoid Giảm huyết áp

Adenosine Nucleotide Tăng sự lưu thông máu

Thư giản cơ, Giảm đau Hệ sợi nấmBeta – D -glucans Polysaccharide

Chống khối uKích thích hệ miễn dịchTăng sản suất kháng thể

Hệ sợi nấm

Uridine, Uracil Nucleoside Phục hồi sự dẻo dai Hệ sợi nấm

Ling Zhi – 8 Protein Chống dị ứng quang phổ

Điều hoà huyết áp Hệ sợi nấm

Ganoderic Acids Triterpenoid Bảo vệ gan Hệ sợi nấmGanodermic Acid T

Ức chế tổng hợp

Năm 2001, Masao Hattori đã ly trích được 10 triterpene mới, bao gồm lucidumol

A và B, các ganoderic acid: A, B, E, F, H, K, Y và R Trong đó kiểu Lanostane triterpene

có thành phần chính là lipophilic Có khoảng 130 hợp chất được ly trích từ quả thể, hệ sợi

và bào tử nấm Linh chi Thành phần và hàm lượng triterpene phụ thuộc vào nguồn giống, yếu tố môi trường Vai trò của triterpene có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống căn bệnh HIV [22]

Hàng loạt các nghiên cứu của Shufeng Zhou chứng minh rằng polysaccharide và triterpene của nấm Linh chi có khả năng chữa trị bệnh viêm gan mãn tính Ganopoly ức chế quá trình dịch mã của ADN polymerase của virút gây bệnh HBV, ngăn chặn sự hoạt động của virút Ngoài ra polysaccharide và triterpene tác động hữu hiệu trong việc điều trị bệnh đái đường loại 2 (type II diabetes mellitus) cho các bệnh nhân [14]

Năm 1994, Lin Zhibin và Lei Lin Sheng đã xác định được trọng lượng phân tử của

Polysaccharide từ G.lucidum là khoảng 7.100 – 9.300 Những tổng kết về vai trò sinh

dược học của nhóm polysaccharide ở các loài nấm Linh chi đã được giới thiệu tại Hội thảo Bắc Kinh với các báo cáo của các tác giả Đài Loan, Trung Quốc, Hoa kỳ

He, Y et al (1992) đã khảo cứu các BN3B - gồm 4 polycaccharide đồng nhất có hoạt tính tăng miễn dịch Trong đó BN3B1 được xác định là glucan (chỉ chứa glucose) và BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kết glycoside.

Hikino, H.et al từ 1985 đến 1989 chứng minh hoạt lực hạ đường huyết của nhiều polysaccharide Đó là các heteroglycan có cả hoạt tính chống ung thư Các ganoderan B

có tác dụng làm tăng mức insuline trong huyết tương, giảm sinh tổng hợp glycogen và giảm hàm lượng glycogen trong gan Đây chính là cơ sở trị liệu trên các bệnh nhân đái tháo đường

Các phức hợp polysaccharide – protein có hoạt tính chống khối u và tăng tính miễn dịch Năm 1994, Byong Kak Kim tiến hành lai hệ sợi nấm bằng phương pháp dung hợp

Protoplast giữa chủng G.lucidum với G.applanatum, thậm chí với cả nấm hương (Lentinus edodes), qua đó tăng cường hoạt tính chống khối u sarcom 180 của các phức

polysaccharide – protein lên đáng kể

Lei L.S và Lin L.B (1993) đã chứng minh tác dụng tăng sinh tổng hợp IL – 2 (Interleukine-2) và hoạt tính ADN polymerase ở chuột già tuổi bởi polysaccharide, càng soi sáng thêm khả năng trẻ hóa, tăng tuổi thọ của các nấm Linh chi

Những nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước cũng chứng tỏ hiệu lực

chống khối u rất rõ, thậm chí làm tan khối u với tỷ lệ ¾ ở các loài G.lucidum và G.applanatum (Takashi, 1985; Liu G.T, 1993) [2]

Có lẽ đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh nhất là nhóm Saponine, triterpenoide và các acid ganoderic Vai trò của các chất này chủ yếu là ức chế giải phóng histamine, ức chế Angiotensine Conversino emzyme (ACE), ức chế sinh tổng hợp Cholesterol và hạ huyết áp [2, 3, 19]

2.3 KHẢ NĂNG CHỮA BỆNH CỦA NẤM LINH CHI

Linh chi được dùng như một thượng dược khoảng từ 4000 năm nay ở Trung Quốc

và người ta chưa thấy tác dụng xấu hay độc tính của Linh Chi Chúng đã được khẳng định

là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào

Tài liệu cổ nhất nói tương đối cụ thể về khả năng trị liệu của nấm Linh chi cũng của Lý Thời Trân (1595) Theo tác giả trong 6 loại Linh chi thì mỗi loại có đặc tính riêng.

Bảng 2.2: Lục bảo Linh chi và tác dụng trị liệu (Lý Thời Trân, 1590)

Thanh chi Xanh Vị chua, tính bình, không độc chủ trị sáng mắt,

bồ gan khí an thần, tăng trí nhớ

Hồng chi Đỏ Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ,

dưỡng tim, bổ trung, chữa trị tức ngực

Hoàng chi Vàng Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần ích tì khí

Bạch chi Trắng Vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông

mũi, an thần, chữa ho nghịch

Hắc chi Đen Vị mặn, tính bình, không độc, trị chứng bí tiểu

Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụng lớn của nấm Linh chi như sau: [1, 7, 8]

- Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn)

- Bảo can (bảo vệ gan)

- Cường tâm (thêm sức cho tim)

- Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hoá)

- Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp)

- Giải độc (giải tỏa trạng thái dị cảm)

- Trường sinh (tăng tuổi thọ)

Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược lý và sử dụng nấm Linh chi, người ta thấy Linh chi có tác dụng với một số bệnh:

Đối với các bệnh tim mạch: Nấm Linh chi có tác dụng điều hoà, ổn định huyết áp

Khi dùng cho người huyết áp cao, nấm Linh chi không làm tăng mà làm giảm bớt, dùng nhiều thì huyết áp ổn định Đối với những người suy nhược cơ thể, huyết áp thấp thì nấm Linh chi có tác dụng nâng huyết áp lên gần mức dễ chịu nhờ cải thiện, chuyển hoá dinh dưỡng Đối với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch, dùng nấm Linh Chi có tác dụng giảm cholesterol toàn phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỷ trọng cao trong máu, làm giảm hệ số sinh bệnh Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu, giảm nồng độ mỡ trong

máu, giảm co tắc mạch, giải tỏa cơn đau thắt tim Nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra vai trò của các nguyên tố khoáng vết hiếm Vanadium (V) có tác dụng chống tích đọng cholesterol trên thành mạch Germanium giúp lưu thông khí huyết, tăng cường vận chuyển oxy vào mô Hiện nay, chỉ số Ge trong các dược phẩm Linh chi được xem như là một chỉ tiêu quan trọng, có giá trị trong điều trị tim mạch và giảm đau trong trị liệu ung thư [2, 3]

Đối với các bệnh về hô hấp: nấm Linh Chi đem lại kết quả tốt, nhất là với những

ca điều trị viêm phế quản dị ứng, hen phế quản tới 80% có tác dụng giảm và làm nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn.[7, 8]

Hiệu quả chống ung thư: Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hoá trị, giải

phẫu với trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày có thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm Nhiều thông tin ở Đài Loan cho biết nếu dùng nấm Linh chi trồng trên gỗ long não điều trị cho các bệnh nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt - khối u tiêu biến hoàn toàn Các nhà khoa học ở Đại học Haifa, Israel khẳng định nấm linh chi - một loài nấm dại thường dùng trong Đông

Y ở Trung Quốc (và Việt Nam) - có thể chữa ung thư tuyến tiền liệt Ung thư tiền liệt tuyến là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất ở đàn ông, với hơn 543.000 người được chẩn đoán mỗi năm trên toàn thế giới

Khả năng kháng HIV: Để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợp chất trong

nấm Ganoderma lucidum, người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thể trong thử nghiệm

kháng virút HIV – 1 trên các tế bào lympho T ở người Sự nhân lên của virút được xác định qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt các tế bào lympho T đã được gây nhiễm HIV – 1 Kết quả cho thấy có sự ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virút này (Gau J.P, 1990; Kim, 1996) Do đó, nhiều quốc gia đã đưa Linh chi vào phác đồ điều trị tạm thời, nhằm tăng cường khả năng miễn dịch và nâng đỡ thể trạng cho các bệnh nhân trong khi AZT, DDI, DDC, còn hiếm và rất đắt Các nghiên cứu tại Nhật Bản đã chứng minh các hoạt chất từ nấm Linh chi có tác dụng như sau: (Masao Hattori, 2001)

 Ganoderiol F và ganodermanontirol có hoạt tính chống HIV – 1

 Ganoderderic acid B và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease HIV – 1

 Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth – A (mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma)

Ngoài ra các ganoderma alcohol là lanostane triterpene với nhóm hydroxol (-OH)

ở vị trí C25 có khả năng chống HIV – 1, Meth – A và LLC ở chuột [2, 22]

Khả năng antioxydant: Nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các saponine và

triterpenoid, mà trong đó Ganoderic acid được coi là hiệu quả nhất (Wang C.H, 1985) Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu Selenium - một yếu tố khoáng có hoạt tính antioxydant rất mạnh – vào nấm Linh chi Chính vì vậy con người có thể chờ đợi vào một dược phẩm tăng tuổi thọ, trẻ hoá từ nấm Linh chi nói chung và Linh chi Việt Nam nói riêng [2]

Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốc tự do trong

cơ chế chống não hóa, chống ung thư Bảo vệ và chống ảnh hưởng của các tia chiếu xạ Linh chi cũng có tác dụng giúp cơ thể thải loại nhanh các chất độc, kể cả các kim loại năng như: Chì, Germanium

2.4 MỘT SỐ ỨNG DỤNG LÂM SÀN

Trị suy nhược thần kinh: Bệnh viện Hoa sơn thuộc Viện Y học số 1 Thượng hải

báo cáo: Dùng cả 2 loại Linh chi nhân tạo và Linh chi hoang dại chế thành viên ( mỗi viên tương đương 1g thuốc sống), mỗi lần uống 3 viên, ngày 3 lần, một liệu trình từ 10 ngày đến 2 tháng Trị 225 ca, tỷ lệ kết quả 83,5 - 86,3%, nhận xét thuốc có tác dụng an thần, điều tiết thần kinh thực vật và tăng cường thể lực ( theo báo Tân y học, số phụ chuyên đề

về bệnh hệ thống thần kinh 1976,3:140)

Trị chứng cholesterol máu cao: Báo cáo của Sở nghiên cứu kháng khuẩn tố công

nghiệp Tứ xuyên, dùng liên tục từ 1 đến 3 tháng cho 120 ca thuốc có tác dụng hạ

cholesterol huyết thanh rõ rệt, tỷ lệ kết quả 86% ( theo báo cáo đăng trên báo thông tin Trung thảo dược 1973,1:31)

Trị viêm phế quản mạn tính: Tổ nghiên cứu Linh chi tỉnh Quảng đông báo cáo

dùng siro Linh chi và đường Linh chi, trị 1.110 ca có kết quả và có nhận xét là thuốc có

tác dụng đối với thể hen và thể hư hàn ( theo tờ báo cáo tư liệu Y dược Quảng đông 1979,1:1).

Trị viêm gan mạn tính: Tác giả dùng polysaccarit Linh chi chiết xuất từ Linh chi

hoang dại chế thành thuốc bột hòa nước uống, trị các loại bệnh viêm gan mạn hoạt động, viêm gan mạn kéo dài và xơ gan gồm 367 ca, có nhận xét phần lớn triệu chứng chủ quan được cải thiện, men SGOT, SGPT giảm tỷ lệ 67,7% ( Tạp chí Bệnh gan mật 1985,4:242)

Trị chứng giảm bạch cầu: dùng polysaccarit chế thành viên (mỗi viên có 250mg

thuốc sống) cho uống, theo dõi 165 ca, ghi nhận tỷ lệ có kết quả 72,57% ( Báo cáo của Lưu chí Phương đăng trên tạp chí Trung hoa huyết dịch bệnh 1985,7:428)

Trị bệnh xơ cứng bì, viêm da cơ, bệnh liput ban đỏ, ban trọc: dùng Linh chi chế

thành dịch, tiêm bắp và viên uống Trị xơ cứng bì 173 ca, tỷ lệ kết quả 79,1%, viêm da cơ

43 ca, có kết quả 95%, Liput ban đỏ 84 ca có kết quả 90%, ban trọc 232 ca, có kết quả 78,88% ( Thông tin nghiên cứu Y học 1984,12:22)

Theo sách Trung dược ứng dụng lâm sàng: thuốc có tác dụng đối với bệnh loét

bao tử, rối lọan tiêu hóa kéo dài, thường dùng phối hợp với Ngũ bội tử, Đảng sâm, Bạch truật, Trần bì, Kê nội kim, Sa nhân, Sinh khương

Trị xơ cứng mạch, cao huyết áp, tai biến mạch não: thường phối hợp với Kê

huyết đằng, Thạch xương bồ, Đơn bì, Cẩu tích, Đỗ trọng, Thỏ ty tử, Hoàng tinh Thuốc còn dùng chữa bệnh động mạch vành, đau thắt ngực

Dùng giải độc các loại khuẩn: phối hợp với Cam thảo, Gừng, Táo.

Ngoài ra sách Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam của Đỗ tất Lợi có ghi: Thuốc chữa bệnh phụ nữ thời kỳ mãn kinh, giúp thông minh và trí nhớ, dùng lâu ngày giúp cho nhẹ người, tăng tuổi thọ Nhiều người mua nấm Linh chi về nấu canh, nấu súp làm món

GL-B: Glu: Rham: Xyl (6,8: 2,0: 1,0) M= 25.000 Da

GL-A có thành phần chính là Gal, nên gọi là Galactan, còn GL-B có thành phần chính là Glu, nên gọi là Glucan

b (1-3) -D-glucan, khi phức hợp với một protein, có tác dụng chống ung thư rõ rệt (Kishida & al., 1988)

Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100,000 – 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM) Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng

Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận từ quá trình nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa trị

Polysaccharid có nguồn gốc từ Linh chi dùng điều trị ung thư đã được công nhận sáng chế (patent) ở Nhật Năm 1976, Cty Kureha Chemical Industry sản xuất chế phẩm trích từ Linh Chi có tác dụng kháng carcinogen Năm 1982, Cty Teikoko Chemical Industry sản xuất sản phẩm từ Linh Chi có gốc glucoprotein làm chất ức chế neoplasm Bằng sáng chế Mỹ 4051314, do Ohtsuka & al (1977), sản xuất từ Linh Chi chất mucopolysaccharid dùng chống ung thư

2.5.2 Ganoderic Acid

Ganoderic acid được định hướng là một cyclopropene hoặc cyclopentene Hàm lượng G.acid thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử ganodermal Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng Hàm lượng G.acid cao thì có nhiều vị đắng [18, 19]

Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren Các triterpen có

bộ khung chính từ 27 – 30 nguyên tử carbon (C38H48) rất thường gặp trong thực vật Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một

số nhóm chức như: -OH; -Oac; eter -O-; Carbanil C=O; nối đôi C=C Đặc tính chung là

có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexan, eter ethyl, cloroform), ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid [10, 11]

Bảng 2.3: Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm

Linh chi (Ganoderma lucidum) (Lê Xuân Thám, 1996)

Triterpenoid đặc biệt là acid ganoderic có tác dụng chống dị ứng, ức chế sự giải

phóng histamin, tăng cường sử dụng oxy và cải thiện chức năng gan Hiện nay, đã tìm thấy trên 80 dẫn xuất từ acid ganoderic Trong đó ganodosteron được xem là chất kích thích hoạt động của gan và bảo vệ gan

 Tăng lượng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin

 Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lượng máu cung cấp cho não

 Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể

2.5.4 Alcaloid [10, 11]

Alcaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng

Ganoderic acid R,S Ức chế giải phóng histamin

Ganoderic acid B, D, F, H, K, S, Y Hạ huyết áp

Ganodermic acid Mf Ức chế tổng hợp cholesterol

Ganodermic acid T.O Ức chế tổng hợp cholesterol

Ganodermic acid Ức chế tổng hợp cholesterol

Các alcaloid ở dạng tự do hầu như không tan trong nước, thường tan trong dung môi hữu cơ: cloroform, eter diethyl, alcol bậc thấp Các muối của alcaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: cloroform, eter, benzen Chính vì thế, tính hòa tan của các alcaloid đóng vai trò quan trọng trong việc ly trích alcaloid ra khỏi nguyên liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống.

Alcaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y dược

và nhiều chất rất độc Các alcaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của alcaloid

 Tác dụng lên hệ thần kinh

 Tác dụng lên huyết áp

 Tác dụng trị ung thư

2.5.5 Hợp chất Saponin [21, 23]

Saponin là một loại glycosid, có cấu trúc gồm hai phần: phần đường gọi là glycon

và phần không đường gọi là aglycon

- Saponin triterpenoid: Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30 cacbon, cấu

tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm:

Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean

Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan, cucurbitan

- Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan,

Gemanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm

1885 Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của oxygen Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến 1,5 lần Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa

Cơ thể con người là thành phần của các electron Khi mức năng lượng tăng hoặc giảm thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý Gemanium hữu cơ

sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khoẻ Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất Gemanium sẽ điều hoà

và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển

Chức năng của Germanium:

 Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện ung thư

 Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ

 Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ

Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

THÍ NGHIỆM3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM LÀM THÍ NGHIỆM

Đề tài được thực hiện từ 27/09/2008 đến 1/1/2009 tại Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ TP Hồ Chí Minh

3.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)

3.3 VẬT LIÊU THÍ NGHIỆM

3.3.1 Thiết bị

Cân phân tíchKính hiển viMáy chụp ảnh kỹ thuật số

Tủ cấy vô trùngNồi hấp thanh trùng

Tủ sấy

3.3.2 Hóa chất

Các hóa chất bao gồm: MgSO4, KH2PO4, Glucose, Agar

3.3.3 Môi trường sử dụng

3.3.3.1 Môi trường dinh dưỡng

Môi trường PGA (Potato glucose agar)

Nước cất vừa đủ: 1000 (ml)Các môi trường đều được khử trùng ở 1210C trong 15 phút

3.3.3.2 Môi trường nhân giống

Chọn loại lúa gạo tốt, nấu cho lúa vừa nứt nanh, vớt ra để ráo, sau đó phối trộn với cám bắp

3.4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.4.1 Quan sát hình thái quả thể nấm Ganoderma lucidum

3.4.1.1 Hình thái quả thể

3.4.1.2 Phương pháp quan sát hệ sợi nấm [9]

 Lấy một ít sợi nấm dàn đều vào 1 giọt nước có trên lam kính

 Cố định sợi nấm trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới lam kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn

 Nhuộm bằng dung dịch fuchsin trong 5 – 10 phút

 Rửa thuốc nhuộm bằng cồn 95%

 Rửa ngay với nước cất để chấm dứt công đoạn tẩy màu

 Quan sát mẫu vật dưới vật kính x100

3.4.1.3 Phương pháp quan sát bào tử nấm Linh chi [13, 17]

 Lấy quả thể nấm Linh chi trong giai đoạn phóng thích bào tử, đặt lên

1 tờ giấy trắng để thu bào tử

 Dùng khuyên cấy lấy ít bào tử rồi dàn đều vào 1 giọt nước trên lam kính

 Cố định bào tử trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới của lam kính qua ngọn lửa đèn cồn đến khô

 Quan sát bào tử nấm dưới vật kính x100

3.4.2 Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi trên các môi trường lỏng

Cách tiến hành thí nghiệm: Các môi trường đều được pha với nồng đô như sau, sau

đó môi trường đều hấp khử trùng ở 121oC/15 phút Sau 9 ngày ta thu sinh khối và sấy ở nhiệt độ 500C Sau đó tiến hành cân trọng lượng khô

Tổng số chai cấy: 52 chai

3.4.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO 4 đến tốc độ tăng sinh khối trong môi trường lỏng

Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường

Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy

3.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên môi trường nuôi cấy

PH ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ tăng trưởng của sợi nấm trong môi trường lỏng Ở các giá trị pH khác nhau thì tốc độ sinh trưởng của sợi nấm khác nhau Điều này dẫn đến lượng sinh khối thu được sẽ phụ thuộc vào giá trị pH Do đó, trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH đến tốc độ sinh trưởng và phát triển của sợi nấm Linh chi để tìm được giá trị pH thích hơp cho moi trường lỏng

Cách tiến hành: pha môi trường lỏng PG (potato glucose) với nồng độ pH khác nhau và đổ vào chai thuỷ tinh 100ml một lượng môi trường 20 ml Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào (mỗi lần cấy gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng Tiến hành thu nhận sinh khối sau 9 ngày Sinh khối được sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC và tiến hành cân trọng lượng khô

Thí nghiệm được thực hiện với 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 2 chai Vậy tổng

số chai cấy là 14 chai

3.4.4 Nghiên cứu đường cong sinh trưởng của Ganoderma lucidum

Chúng tôi khảo sát sự tích lũy sinh khối sợi nấm Linh chi trên môi trường lỏng PG

Cách tiến hành: pha môi trường và đổ vào chai thuỷ tinh 0,5 lít một lượng môi trường 20

ml Hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào (mỗi lần cấy gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng Tiến hành thu nhận sinh khối ở các ngày 3, 6,

9, 12, 15, 21 Sinh khối được sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC và tiến hành cân trọng lượng khô

Trong quá trình thí nghiệm, gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 2 chai Tổng số chai cấy là 10 chai

3.5 PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM

3.5.1 Mục đích

Tìm điều kiện tối ưu để thực hiện các quá trình hoặc chọn lựa thành phần tối ưu của nhiều phần tử trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật Phương pháp quy hoạch thực nghiệm nhiều yếu tố cho phép thay đổi đồng thời nhiều yếu tố và xác định được tương tác giữa các yếu tố, nhờ đó giảm bớt số thí nghiệm

3.5.2 Phương pháp xử lý số liệu

Phương trình hồi quy được xây dựng từ các kết quả thực nghiệm Các hệ số trong phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến mật độ tế bào Ảnh hưởng của các yếu tố được đánh giá dựa trên xác xuất tin cậy hay mức ý nghĩa p của chúng

Ảnh hưởng được coi là rất lớn khi p ≤ 0,0001, ảnh hưởng là đáng kể khi 0,0001 <

p ≤ 0,05 và không đáng kể khi p > 0,05

Chỉ có những hệ số biểu diễn ảnh hưởng rất lớn và đáng kể mới được giữ lại trong phương trình hồi qui cuối cùng Khi ảnh hưởng của các yếu tố hay ảnh hưởng tương hổ giữa các yếu tố là đáng kể thì hệ số biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố đó luôn được giữ lại trong phương trình

Phương trình hồi quy

Yi = b0 +b1x1+ b2x2 + b3x3 + b12x x1 2 + b13x x1 3 + b23x x2 3 + b123x x x1 2 3

Trong đó

 Yi: Sinh khối nấm thu được (g/l)

 x i (i= 1 – k): là các yếu tố ảnh hưởng, mỗi yếu tố có hai mức là hai giới hạn biên của nó.

 bo, bi, bj, bij:là các hệ số trong phương trình hồi quy

Để đơn giản trong tính toán, chuyển từ hệ trục tự nhiên sang hệ trục không thứ nguyên (hệ mã hoá) Xét yếu tố được kí hiệu là Zi

Z i o = ( Z i max + Z i min )/2

Với: + Zimax: mức cao

+ Zimin: mức thấp+ Zio: mức cơ sở

 Điểm có tọa độ (Z1, Z2 , Z3 ,…Zk) gọi là tâm của phương án

 Việc mã hoá được thực hiện dễ dàng nhờ chọn tâm của miền được nghiên cứu làm gốc tọa độ

 Phương pháp xử lý số liệu từ các kết quả thực nghiệm Các hệ số trong phương trình mô tả ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến khả năng tăng sinh khối

Phương trình hồi quy