khảo sát tập đoàn đậu tương kháng virus khảm vàng lá bằng chỉ thị phân tử dna

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐINH THỊ THU NGẦN KHẢO SÁT TẬP ĐOÀN ĐẬU TƯƠNG KHÁNG VIRUS KHẢM VÀNG LÁ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phan Hữu Tôn HÀ NỘI, NĂM 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu với giúp đỡ tận tình thầy giáo hướng dẫn Các số liệu, kết trình bày khóa luận trung thực chưa sử dụng công bố trước Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn ghi rõ nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo quy định Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm lời cam đoan này! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Đinh Thị Thu Ngần Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo PGS.TS Phan Hữu Tôn, người tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ suốt trình thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ, nhân viên Bộ môn Sinh học phân tử Công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam thầy giáo, cô giáo Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, gia đình người thân nhiệt tình giúp đỡ, động viên suốt thời gian thực đề tài hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Đinh Thị Thu Ngần Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình ảnh vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract ix Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Giả thiết khoa học 1.3 Mục tiêu nghiên cứu 1.4 Phạm vi nghiên cứu 1.5 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Cây đậu tương 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Đặc điểm đậu tương 2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất đậu tương giới Việt Nam 2.2.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất đậu tương giới 2.2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất đậu tương Việt Nam 2.3 Bệnh đậu tương 2.4 Bệnh khảm vàng đậu tương 10 2.5 Nghiên cứu chọn tạo giống kháng bệnh virus khảm đậu tương 12 2.5.1 Các gen kháng bệnh khảm đậu tương 12 2.5.2 Các loại thị phân tử DNA 13 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 17 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 17 3.2 Thời gian nghiên cứu 17 3.3 Đối tượng nghiên cứu 17 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 3.4 Nội dung nghiên cứu 17 3.5 Phương pháp nghiên cứu 17 3.5.1 Phương pháp khảo sát tập đoàn 17 3.5.2 Đánh giá tính kháng bệnh ứng dụng thị phân tử DNA xác định gen kháng 22 3.5.3 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền thị SSR 23 Phần Kết thảo luận 26 4.1 Kết nghiên cứu 26 4.1.1 Đặc điểm nông sinh học mẫu giống đậu tương 26 4.1.2 Kết PCR phát gen kháng khảm Rsv1 Rsv3 56 4.1.3 Đánh giá đa dạng di truyền mẫu giống đậu tương 58 4.2 Thảo luận 60 Phần Kết luận đề nghị 62 5.1 Kết luận 62 5.2 Đề nghị 62 Tài liệu tham khảo 63 Phụ lục 69 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Amplified Fragment Length Plymorphism - Đa hình chiều dài AFLP đoạn DNA nhân chọn lọc BYMV Bean yellow mosaic virus CNSH Công nghệ sinh học ĐC Đối chứng DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid NN&PTNT Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn NSLT Năng suất lý thuyết NST Nhiễm sắc thể NSTT Năng suất thực thu PCR Polymerase Chain Reaction - phản ứng khuếch đại gen Randomly Amplified Polymosphic DNA - đa hình đoạn RAPD DNA khuyếch đại ngẫu nhiên Restriction Fragme Length Polymorphism - Đa hình chiều dài đoạn RFLP cắt giới hạn RNA Axít ribonucleic SMV Soybean mosaic virus SSR Simple Sequence Repeats - Sự lặp lại trình tự đơn giản TB/cây Trung bình/cây TGST Thời gian sinh trưởng TT Thứ tự USDA United States Department of Agriculture - Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tình hình sản xuất đậu tương giới Bảng 2.2 Sản lượng đậu nành Việt Nam Bảng 3.1 Danh sách mẫu giống đậu tương đánh giá đa dạng di truyền 24 Bảng 3.2 Các mồi phản ứng SSR đánh giá đa dạng giống đậu tương 24 Bảng 4.1 Một số đặc điểm hình thái mẫu giống đậu tương 26 Bảng 4.2 Tỷ lệ mọc mầm thời gian mọc mẫu giống đậu tương 33 Bảng 4.3 Đặc điểm sinh trưởng phát triển mẫu giống đậu tương 36 Bảng 4.4 Năng suất yếu tố cấu thành suất 42 Bảng 4.5 Các tiêu chất lượng hạt mẫu giống đậu tương 49 Bảng 4.6 Mức độ sâu bệnh, khả chống chịu với điều kiện bất thuận 50 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Cây đậu tương Hình 2.2 Các bệnh hại phổ biến đậu tương Hình 2.3 Lá đậu tương bị khảm vàng 10 Hình 2.4 Potyvirus, SMV 11 Hình 2.5 Rệp muội Aphis gossypii 11 Hình 3.1 Bộ chưng cất đạm Kjeldahl Soxhlet 22 Hình 4.1 Màu sắc hoa giống đậu tương 31 Hình 4.2 Màu sắc giống đậu tương 31 Hình 4.3 Màu sắc vỏ hạt rốn hạt đậu tương 32 Hình 4.4 Lá đậu tương bị bệnh khảm 55 Hình 4.5 Điện di sản phẩm PCR với mồi Sat_154 phát gen Rsv1, ladder 1000 bp 57 Hình 4.6 Điện di sản phẩm PCR với mồi Satt569 phát gen Rsv3, ladder 1000 bp 58 Hình 4.7 Phổ điện di sản phẩm PCR cặp mồi SSR 59 Hình 4.8 Sơ đồ hình phân loại mẫu giống đậu tương 59 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Bệnh virus khảm đậu tương (SMV) bệnh nguy hại ngành sản xuất đậu tương Việt Nam Để phòng trừ bệnh hại biện pháp có hiệu chọn tạo sử dụng giống kháng Để chọn tạo giống thành công nguồn gen đóng vai trò định Trong nghiên cứu này, 150 mẫu giống đậu tương khảo sát, đánh giá đặc điểm nông sinh học, suất chất lượng Đồng thời, phát khả chứa gen kháng Rsv1 Rsv3 mẫu giống đậu tương thị phân tử DNA Sử dụng cặp mồi đánh giá đa dạng di truyền mẫu giống đậu tương chứa gen kháng bệnh nhờ thị phân tử SSR Kết quả, tuyển chọn 11 mẫu giống đậu tương triển vọng có thời gian sinh trưởng ngắn (81-83 ngày), cho suất cao FC 31745 (20,7 tạ/ha), FC 31952 (15,1 tạ/ha), có hàm lượng protein cao (từ 32,23 - 41,88%) lipit cao (PI 88447 đạt 23,2%), đồng thời có gen kháng bệnh khảm gồm: FC 31745, FC 31952, PI 567767B, PI 89471, PI 68706, PI 171434, PI 423740, PI 88447, PI 157437, PI 86449, FC 02109, để từ dùng làm vật liệu đưa sản xuất Đã xác định 25 mẫu giống mang gen Rsv1 có mẫu giống FC 02109, PI 68706, PI 171434 47 mẫu giống mang gen Rsv3 có FC 31745, FC 31952, PI 567767B, PI 89471, PI 423740, PI 88447, PI 157437, PI 86449 Nghiên cứu đa dạng di truyền 30 mẫu giống đậu tương chia thành hai nhóm lớn, có khoảng cách di truyền hai nhóm 0,74 Trong đó, mẫu giống PI 567627B PI 567767B có nguồn gốc gần Các mẫu giống PI 68706, PI 88447 PI 89471, PI 86449 có quan hệ xa mặt di truyền so với giống khác Đây nguồn vật liệu lai tạo quan trọng cho chương trình chọn giống tương lai Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii THESIS ABSTRACT Soybean mosaic virus (SMV) is one of the most dangerous diseases to soybean production industry in Vietnam In order to prevent this disease, selection, breeding and use of resistant varieties are the most effective ways For successful selection and breeding, the gene plays a decisive role In this study, 150 samples soybeans were surveyed and assessed in terms of agricultural biological characteristics, yield and quality Also, Rsv1 and Rsv3 resistance genes of soybean samples were detected by using DNA molecular markers Five primers, which assess the genetic diversity of soybean samples containing resistance genes thanks to molecular marker SSR, were used Finally, we have selected 11 potential soybean samples with short growth period (81-83 days), high yields such as FC 31745 (20.7 kg / ha), FC 31952 (15.1 kg/ha), high protein content (from 32.23 to 41.88%) and high lipid content (PI 88447 has 23.2%), and containing mosaic disease - resistance genes such as FC 31745, FC 31952, PI 567767B, PI 89 471, PI 68706, PI 171434, PI 423740, PI 88447, PI 157437, PI 86449, FC 02109, which could be used as material or put into production We has identified 25 samples containing Rsv1 gene such as FC 02109, PI 68706, PI 171434 and 47 samples containing Rsv3 gene such as FC 31745, FC 31952, PI 567767B, PI 89471, PI 423740, PI 88447, PI 157437, PI 86449.The study of genetic diversity of 30 soybean samples is divided into two large groups withthe genetic distance between the two groups of 0.74 Of which, PI 567627B and PI 567767B samples are close in term of origin PI 68706, PI 88447 and PI 89471, PI 86449 samples showed the relatively difference ingenetics compared with other breeds This is an important source of breeding materials for future selection and breeding Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix Kết lập phân loại: Phân tích sơ đồ hình cho thấy 30 giống đậu tương nghiên cứu có hai nhánh rõ rệt chia thành hai nhóm lớn nhóm I nhóm II, có khoảng cách di truyền hai nhóm 0,74 Nhóm I gồm 18 dòng/giống đậu tương chia tiếp thành hai nhánh nhỏ hơn, nhánh thứ phân nhóm Id, nhánh thứ hai bao gồm phân nhóm Ia, Ib, Ic Trong phân nhóm Ia gồm mẫu giống 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9; phân nhóm Ib gồm mẫu giống 10, 11, 12, 13, 14; phân nhóm Ic gồm mẫu giống 15 16 phân nhóm Id gồm mẫu giống 17 18 Nhóm II bao gồm 12 dòng/giống lại chia thành hai nhánh nhỏ hơn, nhánh thứ phân nhóm IIc, nhánh thứ hai gồm hai phân nhóm IIa IIb Trong phân nhóm IIa gồm mẫu giống 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25; phân nhóm IIb có mẫu giống 26; phân nhóm IIc có mẫu giống 27, 28, 29, 30 Trong đó, mẫu giống 17, 18 có hệ số tương đồng 0,74 điều chứng tỏ mẫu giống 17 18 có nguồn gốc gần nhau, có đặc điểm sinh trưởng phát triển tương đồng với Về mặt phát sinh giống giống đậu tương có chung nguồn gốc từ giống đậu tương Như vậy, mức độ đa dạng di truyền 30 giống đậu tương nghiên cứu có khác biệt mẫu giống Mẫu giống 17 (PI 567627B) 18 (PI 567767B) có nguồn gốc gần Các mẫu giống 19 (PI 68706), 21 (PI 88447) 24 (PI 89471), 25 (PI 86449) cho thấy có quan hệ xa mặt di truyền so với giống khác có số ưu điểm hình thái nông học bật Đây nguồn vật liệu lai tạo quan trọng cho chương trình chọn giống tương lai 4.2 THẢO LUẬN Qua kết nghiên cứu, nhận thấy có số mẫu giống đậu tương có triển vọng FC 31952, PI 567767B, PI 89471, PI 68706, PI 171434, PI 423740, PI 88447, PI 157437, PI 86449, FC 02109, FC 31745 Các mẫu giống có nhiều ưu điểm suất tương đối cao FC 31745 PI 88302-1 có NSTT 20,7 tạ/ha, FC 31952 đạt 15,1 tạ/ha; đồng thời có đặc điểm nông sinh học quý mẫu giống PI 171434 chiều cao thân thấp (26,3 cm), PI 86449 (25,7 cm) có TGST ngắn (81 ngày), FC 02109 (TGST 83 ngày), thân thấp chống đổ ngã bị sâu bệnh hại thích hợp cho lai tạo đưa sản xuất Bên cạnh đó, có số mẫu giống đậu tương có chất lượng tốt mẫu giống FC 31745, PI 423740, PI 423813, PI 548338, PI 548420 có hàm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 60 lượng protein tổng số cao (>40,46%), có ý nghĩa lớn cho việc sử dụng làm thực phẩm thay thịt Các mẫu giống ĐTTQ 02, FC 31700, PI 398774, PI 408235, PI 424216, PI 567767B, PI 80834-2 có hàm lượng lipid cao (>20,88%), có ý nghĩa cho ngành công nghiệp sản xuất dầu, việc xuất Đặc biệt, mẫu giống FC 31952, PI 567767B, PI 89471, PI 68706, PI 171434, PI 423740, PI 88447, PI 157437, PI 86449, FC 02109, FC 31745 có đặc điểm nông sinh học quý, chất lượng tốt mà có chứa gen kháng bệnh virus khảm vàng lá- bệnh nguy hại ngành sản xuất đậu tương Việt Nam Khoảng cách di truyền 30 mẫu giống đậu tương có chứa gen kháng bệnh 0,74 Trong có mẫu giống PI 567627B PI 567767B có nguồn gốc gần Các mẫu giống PI 68706, PI 88447, PI 89471, PI 86449 có quan hệ xa mặt di truyền so với giống khác, nguồn vật liệu lai tạo quan trọng cho chương trình chọn giống Như mẫu giống đậu tương triển vọng cho công tác chọn tạo giống đậu tương có suất cao, có hàm lượng protein lipit cao Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 61 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu, đưa số kết luận sau: Kết khảo sát đặc điểm nông sinh học mẫu giống cho thấy mẫu giống có đặc điểm nông sinh học đa dạng Chúng nhận thấy có 25 mẫu giống đậu tương có triển vọng, có thời gian sinh trưởng ngắn, dạng đẹp, cho suất cao, chất lượng tốt là: ĐTTQ 02, FC 31745, FC 31952, PI 157437, PI 180519, PI 253653A, PI 408235, PI 423740, PI 423813, PI 567767B , PI 68706, PI 88302-1, PI 88447, PI 89471, PI 157458, FC 19976, PI 548420, PI 548338, PI 86449, PI 171434, FC 31921, PI 171434, PI 80471, FC 02109, PI 88499 Kết PCR cho thấy 25 mẫu giống có chứa gen kháng Rsv1 47 mẫu giống có chứa gen kháng gen Rsv3 Trong có 11 mẫu giống triển vọng có thời gian sinh trưởng ngắn, cho suất cao, chất lượng tốt, chống chịu sâu bệnh, đồng thời mang gen kháng Rsv1 gen Rsv3 là: : FC 31952, PI 567767B, PI 89471, PI 68706, PI 171434, PI 423740, PI 88447, PI 157437, PI 86449, FC 02109, FC 31745 Kết đánh giá đa dạng di truyền mẫu giống đậu tương cho thấy mẫu giống PI 567627B PI 567767B có nguồn gốc gần Các mẫu giống PI 68706, PI 88447, PI 89471, PI 86449 có quan hệ xa mặt di truyền so với giống khác có số ưu điểm đặc điểm nông học bật, nguồn vật liệu lai tạo quan trọng cho chương trình chọn giống 5.2 ĐỀ NGHỊ Cần tiếp tục nghiên cứu, khảo sát, chọn lọc vụ giống có khả kháng bệnh chọn lọc Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Minh Chơn, Phan Thị Bích Trâm Nguyễn Thị Thu Thủy (2005) Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Văn Chương, Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2010) Kết nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương định hướng nghiên cứu phát triển đậu tương cho vùng Đồng sông Cửu Long Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung Phạm Thị Đào (1999) Cây đậu tương Nxb Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Danh Đông (1971) Sâu bệnh hại đậu tương biện pháp phòng trừ, Nxb Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Phạm Thành Hổ (2006) Di truyền học NXB Giáo dục Nguyễn Thị Lang, Nguyễn Đức Thuận, Bùi Chí Bửu (2007) Nghiên cứu đa dạng di truyền sốgiống đậu nành thị phân tử RAPD SSR Tạp chí Công nghệ sinh học 5(2): 233-245 Vũ Triệu Mân (2003) Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật Nxb Nông nghiệp Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân (1999) Bệnh vi khuẩn bệnh virus hại trồng Nxb Giáo dục Khuất Hữu Thanh (2006) Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng, NXB KH & KT 10 Triệu Thị Thịnh, Vũ Thị Thúy Hằng Vũ Đình Hòa (2010) Phân tích đa dạng di truyền đậu tương thị SSR, Tạp Chí Khoa học Phát triển, Tập số 4: 638-646 11 Lò Thị Mai Thu, Hoàng Hà, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà Chu Hoàng Mậu (2014) Đặc điểm đoạn gen mã hóa coat protein phân lập từ soybean mosaic virus Tạp chí sinh học, 36(1se): 283-292 12 Lò Thị Mai Thu, Phạm Thanh Tùng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà Chu Hoàng Mậu (2013) Thiết kế vector mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen coat protein virus SMV BYMV Tạp chí Sinh học Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, 129-135 Tài liệu tiếng Anh 13 Abe J, Xu DH, Suzuki Y, Kanazawa A, Shimamoto Y (2003) Soybean germplasm pools in Asia revealed by nuclear SSRs Theoretical and Applied Genetics 106, 445Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 63 453 14 Afanasiev M M., Morris H E (1952) Bean Virus (yellow) on Great Northern bean in Montana, Phytopathology, 42, pp 101-104 15 Ainong Shi, Pengyin Chen, Cuiming Zheng, Anfu Hou, and Bo Zhang (2008) A PCR-based Marker for the Rsv1 Locus Conferring Resistance to Soybean Mosaic Virus Crop Sci 48: 262–268 16 Ainong Shi, Pengyin Chen, Dexiao Li, Cuiming Zheng, Bo Zhang, Anfu Hou (2009) Pyramiding multiple genes for resistance to Soybean mosaic virus in soybean using molecular markers Mol Breeding 23: 113–124 17 Akkaya M.S., Bhagwat A.A., Cregan P.B (1992) Length polymorphism of simple sequence repeat DNA in soy bean, Genetic, 132, pp 1131-1139 18 Buss GR, Chen P, Tolin SA, Roane CW Breeding soybeans for resistance to soybean mosaic virus In: Pascade AJ, editor World Soybean Research Conference 1989 1989 March 5–9; Buenos Aires Buenos Aires (Argentina): Actas Proceedings p 1144–1154 19 Buss GR, Ma G, Chen P, Tolin SA Registration of V94-5152 soybean germplasm resistant to soybean mosaic potyvirus Crop Sci 1997;37:1987-1988 20 Buss GR, Ma G, Kristipati S, Chen P, Tolin SA 1999 A new allele at the Rsv3 locus for resistance to Soybean mosaic virus In: Kauffman HE, editor Superior Printing p.490 21 Chen P, Buss GR, Roane CW, Tolin SA 1991 Allelism among genes for resistance to Soybean mosaic virus in strain differential soybean cultivars Crop Sci 31:305309 22 Chen P, Buss GR, Tolin SA, Gunduz I, Cieck M.2002 A valuable gene in Suweon 97 soybean for resistance to Soybean mosaic virus Crop Sci42:333-337 23 Chen P, Buss GR, Tolin SA 1993 Resistance to Soybean mosaic virus conferred by two independent dominant genes in PI 486355 J Hered 84:25-28 24 Chen P, Ma G, Buss GR, Gunduz I, Roane CW, Tolin SA 2001 Inheritance and allelism tests of Raiden soybean for resistance to Soybean mosaic virus J Hered 92:51-55 25 Chen Y, Nelson RL (2005) Relationship between origin and genetic diversity in Chinese soybean germplasm Crop Science 45, 1645-1652 26 Cho EK, Goodman RM 1979 Strains of Soybean mosaic virus: classification based Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64 on virulence in resistant soybean cultivars Phytopathology 69:467- 470 27 Cho EK, Goodman RM 1982 Evaluation of resistance in soybeans to Soybean mosaic virus strains Crop Sci 22:1133-1136 28 Clive James, 2011 Global status of commercialized biotech/GM crop 2011 ISAAA Brief 43.2011 29 Diers BW, Mansur L, Imsande J, and Shoemaker RC, 1992 Mapping Phytophthora resistance loci in soybean with restriction fragment length polymorphism mark-ers Crop Sci 32:377–383 30 Diwan N., Cregan P.B (1997) Automated sizing of fluorescentlabeled simple sequence repeat (SSR) marker to assay genetic variation in soybean Theor Appl Genet, 95, pp 723-733 31 Doyle, J.J and J.L.Doyle 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochemistry Bulletin, 19:11- 15 32 Hartman G L., Sinclair J B., Rupe J C (1999) Compendium of Soybean Diseases, Fourth Edition, The American Phytopathological Society Press, Minnesota, USA 33 Hill J H (1999) Soybean mosaic virus In Compendium of Soybean Diseases, 4th edn, pp 70-71, Edited by G L Hartman J B Sinclair & J C Rupe St Paul, MN: American Phytopathological Society 34 Hill J., Bailey T B., Benner H I., Tachibana H., Durand D P (1987) Soybean mosaic virus: Effects of primary disease incidence on yield and seed quality, Plant Disease, 71, pp 237-239 35 Humphry M.E., Magner T., McIntyre C.L., Aitken E.A., Liu C.J., (2003) “Identification of a major locus conferring resistance to powdery mildew (Erysiphe polygoni DC) in mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek] by QLT”, Geneome, 46(5) pp 738 - 744 36 Hwang T-Y, Nakamoto Y, Kono I, Enoki H, Funatsuki H, Kitamura K, Ishimoto M (2008) Genetic diversity of cultivated and wild soybeans including Japanese elite cultivars as revealed by length polymorphism of SSR markers Breeding Science 58, 315-323 37 K Li, QH Yang, HJ Zhi, JY Gai 2010 Identification and Distribution of Soybean mosaic virus Strains in Southern China The American Phytopathological Society Volume 94, number Pages 351-357 38 Kiihl RAS, Hartwig EE 1979 Inheritance of reaction to Soybean mosaic virus in Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 65 soybeans Crop Sci 19:372-375 39 Killgore E, Heu R (1994) First report of soybean rust in Hawaii, Plant Dis 78, pp 1216 40 Lambrides C J., Lawn R J., Godwin I D., Manners J., Imrie B C (2004) Two genetic linkage maps of mungbean (Vigna radiata L Wilczek) using RFLP and RAPD markers, Australian Journal of Agricultural Research, 51(4) pp 415 - 425 41 Lim SM 1985 Resistance to Soybean mosaic virus in soybean Phytopathology 75:199-201 42 Lohnes DG and Schmitthenner AF, 1997 Position of the Phytophthora resistance gene Rsv7 on the soybean mo-lecular map Crop Sci 37:555-556 43 M A Saghai Maroof, Dominic M Tucker, Jeffrey A Skoneczka, Brian C Bowman, Sucheta Tripathy, and Sue A Tolin 2010 Fine Mapping and Candidate Gene Discovery of the Soybean Mosaic Virus Resistance Gene, Rsv4 Plant Genome 3:14-22 44 Ma G, Chen P, Buss GR, Tolin SA 1995 Genetic characteristics of two genes for resistance to Soybean mosaic virus in PI 486355 soybean Theor Appl Genet 91:907-914 45 Ma, G., P Chen, G.R Buss, and S.A Tolin 2003 Genetic study of a lethal necrosis to soybean mosaic virus in PI 507389 soybean J Hered 94:205–211 46 Maughan P.J., Maroof M.A.S., Buss G.R., (1995) Microsatellite and amplyfied sequence length polymorphism in cultivated and wild soybean, Genome, 38, pp 715-723 47 Narvel J.M., Fehr W.R., Chu W.C., Grant D Shoemaker R.C (2000) Simple sequence repeat diversity among soybean plant introductions and elite genotypes Crop Sci 40:1452-1458 48 Nei M (1987) Molecular Evolutionary Genetics Columbia University Press NY 49 Rafalski J.A., Tingey S., (1993) Genetic diagnostics in plant breeding: APDs, microsatellites and mechines, TIG, 9, pp 275-280 50 Riaz, Mian N (2006) Soy Applications in Food Boca Raton, FL: CRC Press ISBN 0-8493-2981-7 51 Roane CW, Tolin SA, Buss GR 1983 Inheritance of reaction to two viruses in the soybean cross ‘York’ x ‘Lee68’ J Hered 74:289-291 52 Sambrook J & Russell D.,(2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edn Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 66 Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory 53 Sholihin, Hautea D.M., (2002) “Molecular mapping of drought resistance in mungbean (Vigna radiata L.): 1.QTL linked to drought resistance, 2.Linkage map in mungbean using AFLP markers”, Jurnal Bioteknologi Pertanian, 7(1-2) pp 17 - 61 54 Silva, Marcia F., Almeida, Álvaro M R and Arias, Carlos A A 2003 Evaluation of losses caused by two strains of Soybean mosaic virus in two soybean cultivars Fitopatol bras., vol.28, n.6, pp 597-601 55 Singh S., Reddy K.S., Jawali N., (2000) PCR analysis of mungbean genotypes using anchored simple sequence repeat primer, In: DAEBRNS symposium on the use of nuclear and molecular techniques in crop improvement, BARC, pp 359- 369 56 Singh, R J and T Hymowitz (1999) Soybean genetic resources and crop improvement Genome 42 (4) pp: 605 57 Song QJ, Marek LF, Shoemaker RC, Lark KG, Concibido VC, Delannay 2004 A new integrated genetic linkagemap of the soybean Theor Appl Genet 109:122–128 58 Tolin, S.A & Lacy, G.H (2004) Viral, bacterial, and phytoplasmal diseases of soybean In Soybean: Improvement, Production, and Uses, (3rd ed) pp.765-819, ASA-CSSA-SSSA, Madison, WI 59 Verma D.P.S, Shoemaker R.C (1996) Soybean, genetics, molecularbiology and biotechnology, Cab International, pp 37-40 60 Wang K-J and Takahata Y (2007) A preliminary comparative evaluation of genetic diversity between Chinese and Japanese wild soybean (Glycine soja) germplasm pools using SSR markers Genetic Resources and Crop Evolution 54, 157-165 61 Wang, A (2009) Soybean mosaic virus: research progress and future perspectives Proceedings of World Soybean Research Conference VIII (www.wsrc2009.cn) Beijing, China 62 Xiaoyan Cui, Xin Chen and Aiming Wang (2011) Detection, Understanding and Controlof Soybean Mosaic Virus, Soybean - Molecular Aspects of Breeding, Dr.Aleksandra Sudaric (Ed.) ISBN: 978-953-307-240-1 63 Yu, G Y., Saghai-Maroof, M A., Buss, G R., Maughan, P., and Tolin, S 1994 RFLP and microsatellite mapping of a gene for Soybean mosaic virus resistance Phytopathology 84:60-64 Tài liệu internet Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 67 64 FAO (2013) Statistic Databaase, Available on the World Wide Web: http://www.fao.org/statistic/database Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 68 PHỤ LỤC Bảng phụ lục 1: Chỉ tiêu phương pháp đánh giá (theo TCN Bộ NN&PTNT): T T Chỉ tiêu Ngày gieo Ngày mọc Ngày hoa Thời gian sinh trưởng Giai đoạn Mọc Phương pháp đánh giá ngày Khoảng 50% số Quan sát cây/ô mọc mầm ô ngày Khoảng 50% số cây/ô có hoa nở Khoảng 90% số ô có vỏ chuyển màu nâu đen Ra hoa Quả hạt chín Kiểu sinh trưởng Ra hoa, hạt chín Dạng Ra hoa Màu hoa Ra hoa Màu sắc vỏ Hạt khô hạt (trừ rốn sau thu hạt) hoạch 10 Mức độ biểu biện ngày Đơn vị tính điểm Màu sắc rốn hạt Hạt khô sau thu hoạch Chiều cao thân Thu hoạch ngày 2 Hữu hạn Vô hạn Đứng Nửa đứng Ngang 2 Tím Trắng Vàng Xanh vàng Xanh Nâu nhạt Nâu Nâu xẫm Đen Xám Vàng Nâu nhạt Nâu đậm Đen không hoàn toàn Đen cm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Quan sát ô Quan sát ô Quan sát ô Quan sát ô Quan sát ô Quan sát ô Quan sát ô Đo từ đốt mầm đến đỉnh sinh Page 69 11 Số cành cấp 1/cây Thu hoạch cành 12 Số thực thu ô Thu hoạch 13 Số quả/cây Thu hoạch 14 Số chắc/cây Thu hoạch 15 Số hạt/cây Thu hoạch 16 Số hạt/cây Thu hoạch Khối lượng Hạt khô 17 1000 hạt sau thu hoạch Năng suất 18 hạt khô Chất lượng hạt: Hàm lượng 19 prôtêin dầu Hạt khô sau thu hoạch Hạt khô sau thu hoạch gam tạ/ha % Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp trưởng thân 10 mẫu/ô Đếm số cành mọc từ thân 10 mẫu/ô Đếm số thực tế ô thí nghiệm Đếm tổng số 10 mẫu/ô Tính trung bình Đếm số 10 mẫu/ô Tính trung bình Đếm số có hạt 10 mẫu/ô Tính trung bình Đếm số có hạt 10 mẫu/ô Tính trung bình Cân mẫu, mẫu 1000 hạt độ ẩm 12%, lấy chữ số sau dấu phẩy Thu riêng hạt khô ô, tính suất toàn ô (gồm khối lượng hạt 10 mẫu) độ ẩm 12% qui suất ha, lấy chữ số sau dấu phẩy Mỗi giống phân tích lần trình khảo nghiệm (khi có yêu cầu), theo phương pháp phòng kiểm nghiệm Page 70 Sâu đục 20 Eitiella zinekenella Trước thu hoạch % Giòi đục thân 21 Melanesgr omyza sojae Cây % Sâu Trước 22 Lamprosem thu a indicata hoạch Bệnh gỉ sắt Phakopsor 23 a pachyrhizi Sydow Ra hoa rộ-vào % Rất nhẹ (5% đến 25% diện tích bị hại) Nặng (> 25%-50% diện tích bị hại) Rất nặng (>50% diện tích bị hại) Rất nhẹ (5% đến 25% diện tích Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Điều tra 10 đại diện theo phương pháp điểm chéo góc Điều tra 10 đại diện theo phương pháp điểm chéo góc Page 71 bị hại) Bệnh đốm nâu 25 Septoria glycines Hemmi Bệnh lở cổ rễ Rhizoctoni 26 a solani Kunh Ra hoa rộvào Cây (sau mọc ngày) Nặng (> 25%-50% diện tích bị hại) Rất nặng (>50% diện tích bị hại) Rất nhẹ ( 25%-50% diện tích bị hại) Rất nặng (>50% diện tích bị hại) Khi xuất bệnh Điều tra 10 đại diện theo phương pháp điểm chéo góc Tỷ lệ bị bệnh= Số bị bệnh/tổng số điều tra Điều tra toàn ô % Bệnh phấn trắng 27 Erysiphe polygoni Trung bình (>5% đến 25% diện tích bị hại) Không nhiễm (76% số có Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72 vết bệnh) Không có tách vỏ Tính tách 28 Quả hạt chín Trước Tính chống 29 thu đổ hoạch Thấp (75% tách vỏ) Điều tra 10 đại diện theo phương pháp điểm chéo góc Không đổ (Hầu hết đứng thẳng) Nhẹ (75% số bị đổ rạp) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 73 Bảng phụ lục 2: Chỉ số đa dạng thị SSR Chỉ thị SSR Dạng SSR Kích thước alen (bp) Số alen Chỉ số đa dạng (H) Sat_182 AT)26 200 - 300 0,811 Satt529 (ATT)13 220 - 240 0,7730 Sat_228 (AT)40 210 0,6465 Satt622 (AAT)27 180 - 200 0,4995 Sat_259 (AT)22 200 - 300 0,1608 Trung bình Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 0,5859 Page 74 [...]... để phòng virus là chọn tạo giống kháng virus Để chọn tạo giống thành công phải có nguồn gen, đánh giá các đặc điểm nông sinh học, dùng chỉ thị phân tử DNA phát hiện khả năng chứa gen kháng Lai tạo và ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc gen kháng trong quần thể phân ly để xác định giống có nguồn gen kháng hữu hiệu nhanh và chính xác Vậy, cần khảo sát tập đoàn đậu tương bằng chỉ thị phân tử để chọn... giống đậu tương kháng khảm lá bằng chỉ thị phân tử DNA ở Việt Nam đã được nghiên cứu bởi: Lò Thị Mai Thu và cộng sự (2013, 2014) Đặc điểm của đoạn gen mã hóa coat protein phân lập từ SMV (Lò Thị Mai Thu và cộng sự, 2014) Triệu Thị Thịnh và cộng sự, (2010) phân tích đa dạng di truyền của đậu tương bằng chỉ thị SSR; Nguyễn Thị Lang và cs., (2007) nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu nành bằng. .. khảo sát tập đoàn đậu tương bằng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống kháng bệnh Từ những lí do trên chúng tôi tiến hành đề tài: Khảo sát tập đoàn đậu tương kháng virus khảm vàng lá bằng chỉ thị phân tử DNA 1.3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Chọn lọc ra các mẫu giống đậu tương vừa có năng suất cao, chất lượng tốt vừa có khả năng kháng bệnh vius khảm lá để từ đó có thể dùng làm vật liệu hoặc đưa ra sản xuất 1.4 PHẠM... Các loại chỉ thị phân tử DNA Đánh giá sự đa dạng di truyền có vai trò quan trọng trong cung cấp thông tin cho quản lý và sử dụng hiệu quả nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn tạo giống Chỉ thị phân tử DNA là chỉ thị phân tích đa dạng di truyền hiệu quả và không bị ảnh hưởng nhiều từ các yếu tố môi trường Trong các loại chỉ thị phân tử RFLP, AFLP, RAPD, SSR, chỉ thị SSR là chỉ thị đồng trội biểu thị tính... (hình thái, đặc điểm sinh trưởng và phát triển ), năng suất, chất lượng của đậu tương - Dùng chỉ thị phân tử DNA phát hiện 2 gen kháng Rsv1, Rsv3 - Đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống đậu tương bằng chỉ thị SSR 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1 Phương pháp khảo sát tập đoàn - Bố trí thí nghiệm: Theo phương pháp khảo sát tập đoàn tuần tự không nhắc lại - Khoảng cách, mật độ gieo trồng: Khoảng cách... LÁ ĐẬU TƯƠNG 2.5.1 Các gen kháng bệnh khảm lá đậu tương Hiện nay trên thế giới sử dụng giống đậu tương kháng SMV được xem là cách hiệu quả nhất để kiểm soát bệnh Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm hơn đến vấn đề “chọn giống nhờ chỉ thị phân tử , sử dụng các chỉ thị phân tử phát hiện ra nguồn gen kháng khảm lá đậu tương Các nhà khoa học đã tìm được vị... chưa cao, sức biến động khá lớn giữa các vùng, miền Khả năng kháng virus và sâu bệnh của các giống đậu tương đang trồng là rất thấp Đậu tương là cây trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, như bệnh virus khảm lá (Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm vàng hại đậu tương (Bean yellow mosaic virus - BYMV), bệnh xoăn lá và một số bệnh virus trên lá khác Theo kết quả điều tra về bệnh của Cục Bảo vệ thực vật... tiềm ẩn (Hill et al., 1987) Hình 2.3: Lá cây đậu tương bị khảm vàng (Nguồn: http://ssnavi.public.iastate.edu/soybeanmosaicviruspics.html) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10 Tác nhân gây bệnh: Bệnh khảm lá đậu tương do virus Soybean mosaic virus (SMV) gây ra SMV thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae gây bệnh khảm lá đậu tương Chúng có dạng hình sợi mềm với đường... đề tài là cơ sở cho việc chọn tạo được giống đậu tương có gen kháng bệnh virus khảm lá và có năng suất cao, chất lượng tốt - Xác định được nguồn gen kháng bệnh virus khảm lá làm vật liệu cho chọn tạo giống đậu tương Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG 2.1.1 Nguồn gốc Đậu tương (tên khoa học Glycine max (L) Merrill)... Trứng Hình thoi Trứng Xanh đậm Xanh đậm Xanh đậm Xanh đậm Xanh đậm Xanh đậm Xanh đậm Xanh đậm Xanh nhạt Xanh đậm Xanh nhạt Xanh nhạt Xanh đậm Vàng Xanh Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Nâu Nâu Nâu Nâu Vàng Nâu Nâu Nâu Vàng Nâu Nâu Vàng Vàng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26