khảo sát tập đoàn đậu tương kháng virus khảm vàng lá bằng chỉ thị phân tử dna

2.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam 6 2.2.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu tương trên thế giới 6 2.2.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu t

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự giúp đỡ tận tình của thầy giáo hướng dẫn Các số liệu, kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực và chưa được sử dụng trong bất kỳ công bố nào trước đây

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn đều đã được ghi rõ nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo đúng quy định

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này!

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả

Đinh Thị Thu Ngần

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo PGS.TS Phan Hữu Tôn, người đã tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ, nhân viên Bộ môn Sinh học phân tử

và Công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam và các thầy giáo, các cô giáo Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các bạn bè, gia đình và người thân đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả

Đinh Thị Thu Ngần

2.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam 6 2.2.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu tương trên thế giới 6 2.2.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu tương tại Việt Nam 7

2.5 Nghiên cứu chọn tạo giống kháng bệnh virus khảm lá đậu tương 12

3.4 Nội dung nghiên cứu 17

3.5.2 Đánh giá tính kháng bệnh và ứng dụng chỉ thị phân tử DNA xác định gen kháng 22 3.5.3 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR 23

4.1.2 Kết quả PCR phát hiện gen kháng khảm lá Rsv1 và Rsv3 56 4.1.3 Đánh giá đa dạng di truyền của các mẫu giống đậu tương 58

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

NN&PTNT Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn

PCR Polymerase Chain Reaction - phản ứng khuếch đại gen

SSR Simple Sequence Repeats - Sự lặp lại của trình tự đơn giản

USDA United States Department of Agriculture - Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Danh sách các mẫu giống đậu tương đánh giá đa dạng di truyền 24 Bảng 3.2 Các mồi của phản ứng SSR đánh giá đa dạng các giống đậu tương 24 Bảng 4.1 Một số đặc điểm hình thái các mẫu giống đậu tương 26 Bảng 4.2 Tỷ lệ mọc mầm và thời gian mọc của các mẫu giống đậu tương 33 Bảng 4.3 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển mẫu giống đậu tương 36

Bảng 4.5 Các chỉ tiêu chất lượng hạt của các mẫu giống đậu tương 49 Bảng 4.6 Mức độ sâu bệnh, khả năng chống chịu với điều kiện bất thuận 50

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 4.5 Điện di sản phẩm PCR với mồi Sat_154 phát hiện gen Rsv1, ladder 1000 bp 57 Hình 4.6 Điện di sản phẩm PCR với mồi Satt569 phát hiện gen Rsv3, ladder 1000 bp 58

Hình 4.8 Sơ đồ hình cây phân loại các mẫu giống đậu tương 59

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Bệnh virus khảm lá đậu tương (SMV) là một trong những bệnh nguy hại nhất đối với ngành sản xuất đậu tương ở Việt Nam Để phòng trừ bệnh hại thì biện pháp có hiệu quả nhất là chọn tạo và sử dụng giống kháng Để chọn tạo giống thành công thì nguồn gen đóng vai trò quyết định Trong nghiên cứu này, 150 mẫu giống đậu tương đã được khảo sát, đánh giá về các đặc điểm nông sinh học, năng suất và chất lượng Đồng

thời, phát hiện khả năng chứa gen kháng Rsv1 và Rsv3 của các mẫu giống đậu tương

bằng chỉ thị phân tử DNA Sử dụng 5 cặp mồi đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống đậu tương chứa gen kháng bệnh nhờ chỉ thị phân tử SSR Kết quả, chúng tôi đã tuyển chọn được 11 mẫu giống đậu tương triển vọng có thời gian sinh trưởng ngắn (81-83 ngày), cho năng suất cao như FC 31745 (20,7 tạ/ha), FC 31952 (15,1 tạ/ha), có hàm lượng protein cao (từ 32,23 - 41,88%) và lipit cao (PI 88447 đạt 23,2%), đồng thời có gen kháng bệnh khảm lá gồm: FC 31745, FC 31952, PI 567767B, PI 89471, PI 68706,

PI 171434, PI 423740, PI 88447, PI 157437, PI 86449, FC 02109, để từ đó có thể dùng

làm vật liệu hoặc đưa ra sản xuất Đã xác định được 25 mẫu giống mang gen Rsv1 trong

đó có mẫu giống FC 02109, PI 68706, PI 171434 và 47 mẫu giống mang gen Rsv3 trong

đó có FC 31745, FC 31952, PI 567767B, PI 89471, PI 423740, PI 88447, PI 157437, PI

86449 Nghiên cứu đa dạng di truyền 30 mẫu giống đậu tương chia thành hai nhóm lớn,

có khoảng cách di truyền giữa hai nhóm là 0,74 Trong đó, mẫu giống PI 567627B và PI 567767B có nguồn gốc gần nhau Các mẫu giống PI 68706, PI 88447 và PI 89471, PI

86449 có quan hệ xa về mặt di truyền so với các giống khác Đây chính là nguồn vật liệu lai tạo quan trọng cho chương trình chọn giống trong tương lai

THESIS ABSTRACT

Soybean mosaic virus (SMV) is one of the most dangerous diseases to soybean production industry in Vietnam In order to prevent this disease, selection, breeding and use of resistant varieties are the most effective ways For successful selection and breeding, the gene plays a decisive role In this study, 150 samples soybeans were surveyed and assessed in terms of agricultural biological characteristics, yield and

quality Also, Rsv1 and Rsv3 resistance genes of soybean samples were detected by

using DNA molecular markers Five primers, which assess the genetic diversity of soybean samples containing resistance genes thanks to molecular marker SSR, were used Finally, we have selected 11 potential soybean samples with short growth period (81-83 days), high yields such as FC 31745 (20.7 kg / ha), FC 31952 (15.1 kg/ha), high protein content (from 32.23 to 41.88%) and high lipid content (PI 88447 has 23.2%), and containing mosaic disease - resistance genes such as FC 31745, FC 31952, PI 567767B, PI 89 471, PI 68706, PI 171434, PI 423740, PI 88447, PI 157437, PI 86449,

FC 02109, which could be used as material or put into production We has identified 25

samples containing Rsv1 gene such as FC 02109, PI 68706, PI 171434 and 47 samples containing Rsv3 gene such as FC 31745, FC 31952, PI 567767B, PI 89471, PI 423740,

PI 88447, PI 157437, PI 86449.The study of genetic diversity of 30 soybean samples is divided into two large groups withthe genetic distance between the two groups of 0.74

Of which, PI 567627B and PI 567767B samples are close in term of origin PI 68706, PI

88447 and PI 89471, PI 86449 samples showed the relatively difference ingenetics compared with other breeds This is an important source of breeding materials for future selection and breeding

PHẦN 1: MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Đậu tương (Glycine max), một loại cây họ Đậu (Fabaceae), là loài bản địa

của Đông Á Đậu tương là một trong ba cây đậu đỗ chính trong nhóm các cây đậu ăn hạt, đứng trước lạc và đậu xanh Đậu tương giàu hàm lượng chất đạm protein, được trồng để làm thức ăn cho người và gia súc Ngoài ra, đậu tương còn

là một trong những mặt hàng xuất khẩu, và cũng chính là cây trồng có vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp của nhiều nước, trong đó có Việt Nam Cây đậu tương là cây thực phẩm có hiệu quả kinh tế lại dễ trồng Mặt khác, cây đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất các cây trồng khác Điều này có được

là do hoạt động cố định N2 của loài vi khuẩn Rhizobium cộng sinh trên rễ cây họ

Đậu (Riaz and Mian N.,2006)

Tuy nhiên, hiện nay năng suất và sản lượng đậu tương ở nước ta thấp là do nhiều giống hiện trồng có tính ổn định chưa cao, sức biến động khá lớn giữa các vùng, miền Khả năng kháng virus và sâu bệnh của các giống đậu tương đang trồng là rất thấp

Đậu tương là cây trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, như bệnh virus khảm

lá (Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm vàng hại đậu tương (Bean yellow mosaic virus - BYMV), bệnh xoăn lá và một số bệnh virus trên lá khác Theo kết quả điều tra về bệnh của Cục Bảo vệ thực vật trên cây trồng, đã xác định 20 loài bệnh hại, trong đó bệnh do nhiễm virus đã gây tổn thất lớn cho năng suất đậu tương và hiện nay vẫn chưa có biện pháp hiệu quả để phòng trừ hiệu quả Vì vậy, nghiên cứu chọn tạo cây đậu tương kháng virus là rất cần thiết

1.2 GIẢ THIẾT KHOA HỌC

Bệnh khảm lá đậu tương phân bố rộng khắp và gây thiệt hại lớn đến năng suất và chất lượng sản phẩm Bệnh do virus SMV gây lên, virus lan truyền qua rệp muội, bọ trĩ làm môi giới Sự lan truyền cây bệnh sang cây khoẻ do rệp muội

ở ngoài đồng vẫn là chủ yếu, bệnh còn truyền qua hạt Hiện nay các biện pháp phòng bệnh phổ biến là: Chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống, vệ sinh đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng, diệt trừ côn trùng truyền bệnh

Tuy nhiên, các biện pháp truyền thống thường phức tạp, tốn thời gian,

hiệu quả không cao và kém bền vững Biện pháp hiệu quả nhất để phòng virus là chọn tạo giống kháng virus Để chọn tạo giống thành công phải có nguồn gen, đánh giá các đặc điểm nông sinh học, dùng chỉ thị phân tử DNA phát hiện khả năng chứa gen kháng Lai tạo và ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc gen kháng trong quần thể phân ly để xác định giống có nguồn gen kháng hữu hiệu nhanh và chính xác Vậy, cần khảo sát tập đoàn đậu tương bằng chỉ thị phân tử

để chọn tạo giống kháng bệnh

Từ những lí do trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Khảo sát tập đoàn đậu

tương kháng virus khảm vàng lá bằng chỉ thị phân tử DNA”

1.3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Chọn lọc ra các mẫu giống đậu tương vừa có năng suất cao, chất lượng tốt vừa có khả năng kháng bệnh vius khảm lá để từ đó có thể dùng làm vật liệu hoặc đưa ra sản xuất

1.4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Trồng và đánh giá các đặc điểm nông sinh học, năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của 150 mẫu giống tại Trung tâm Bảo tồn và Phát triển nguồn gen cây trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Đánh giá chất lượng 28 mẫu giống đậu tương

- Phát hiện sự có mặt gen Rsv1 và Rsv3 khánh bệnh khảm lá của các mẫu

giống đậu tương

- Đánh giá đa dạng di truyền 30 mẫu giống đậu tương có chứa gen kháng bệnh nhờ chỉ thị phân tử SSR

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1 đến tháng 12 năm 2015

1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 1.5.1 Những đóng góp mới

- Đề tài đã tuyển chọn được 11 giống đậu tương có năng suất cao, chất lượng tốt, có gen kháng bệnh khảm lá là: FC 31745, FC 31952, PI 567767B, PI

1.5.2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Kết quả đề tài là cơ sở cho việc chọn tạo được giống đậu tương có gen kháng bệnh virus khảm lá và có năng suất cao, chất lượng tốt

- Xác định được nguồn gen kháng bệnh virus khảm lá làm vật liệu cho chọn tạo giống đậu tương

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG

2.1.1 Nguồn gốc

Đậu tương (tên khoa học Glycine max (L) Merrill) là một trong những cây

trồng loài người đã biết, sử dụng và trồng từ lâu Đậu tương được thuần hóa từ

đậu tương dại Glycine Soja Sieb và Zucc, đậu tương có số NST 2n=40, thuộc họ đậu Fabaceae, họ phụ Faboideae, tộc Phaseoleae, chi Glycine Willd, Glycine bao gồm 2 chi phụ là Glycine và Soja Cây đậu tương là loài bản địa của Đông Á,

có nguồn gốc từ Trung Quốc, được thuần hóa và trồng từ triều đại Shang (1700-

1100 trước công nguyên) Sau đó, đậu tương được phát tán đến các nước Châu Á như Hàn Quốc, Nhật Bản, Indonesia, Philipines, Ấn Độ, Thái Lan, Nepal và Việt Nam Đến thế kỷ 16-17, đậu tương được du nhập vào Châu Âu và Bắc Mỹ (Singh, R.j and T Hymowitz, 1999)

Cây đậu tương là cây thực phẩm có hiệu quả kinh tế lại dễ trồng Đây là loại cây trồng quan trọng bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị cải tạo đất Đậu tương giàu hàm lượng chất đạm protein, được trồng để làm thức ăn cho người và gia súc Trong hạt đậu tương có các thành phần dinh dưỡng cao như protein (30-40%), lipid (12-25%), glucid (10-15%); có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K,

Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose Protein đậu tương có đủ các acid amin cơ bản isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, tryptophan, valin Ngoài ra, đậu tương còn là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lượng đáng kể các amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể người

Sản phẩm đậu tương được lưu hành trên thế giới chủ yếu dưới 3 dạng: hạt, dầu và bột Đậu tương là loại cây lấy dầu giữ vai trò quan trọng hàng đầu trên thế giới Dầu đậu tương được sử dụng làm thực phẩm như dầu rán, salat Trong công nghiệp, dầu đậu tương còn được sử dụng làm xi, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, cao su nhân tạo, len nhân tạo, … Bên cạnh dầu đậu tương thì bột đậu tương cũng

là sản phẩm tham gia trong nhiều mặt hàng hóa khác nhau Bột đậu tương là thành phần quan trọng trong khẩu phần thức ăn Hạt đậu tương có thể chế biến thành nhiều loại thực phẩm khác nhau như các loại thức ăn như đậu phụ, tương, sữa đậu nành…

2.1.2 Đặc điểm cây đậu tương

Hình 2.1: Cây đậu tương

Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, lấy hạt và thuộc nhóm cây hàng năm.Về thời gian sinh trưởng của đậu tương được chia làm 3 loại: nhóm ngắn ngày thời gian sinh trưởng từ 75 - 85 ngày; nhóm trung ngày thời gian sinh trưởng từ 85 - 100 ngày, nhóm dài ngày thời gian sinh trưởng từ 100 - 120 ngày

Đậu tương là loại rễ cọc, gồm rễ chính và các rễ bên Rễ tập trung ở tầng đất mặt 30-40 cm, ăn lan khoảng 20-40 cm Trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi

khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm (Ngô Thế Dân và

cs.,1999) Thân cây đậu tương ít phân cành, cây thảo, dạng bụi, có hình trụ, nhiều lông, mang nhiều đốt, thân thường đứng, có khi dạng bò hay nửa bò Cành đậu tương mọc ra từ các đốt trên thân, đốt đầu tiên của thân chính mang hai lá mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên mỗi đốt mang một lá kép Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa lưỡng tính, hoa được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân Hoa thuộc hoa cánh bướm, mọc thành chùm, có màu tím hay trắng, thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ (Ngô Thế Dân và cs., 1999; Nguyễn Danh Đông, 1971) Quả đậu tương là loại quả ráp, bên ngoài vỏ quả thường có lớp lông bao phủ, màu sắc vỏ khi chín có màu vàng hoặc xám đen Quả thẳng hoặc hơi cong Mỗi quả thường có từ 1 - 4 hạt nhưng phổ biến là 2 hạt Hạt đậu tương có nhiều hình dạng như bầu dục, tròn dài, tròn dẹt Vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen…

nhưng đa số là hạt màu vàng Khối lượng hạt dao động từ 200 - 400 mg/hạt và khối lượng 1000 hạt dao động trung bình 100-200g Hình dạng và màu sắc rốn hạt là dấu hiệu đặc trưng cho mỗi giống đậu tương (Ngô Thế Dân và cs., 1999; Nguyễn Danh Đông, 1971)

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT ĐẬU TƯƠNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

2.2.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu tương trên thế giới

Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật (Tổng cục thống

kê, 2010) Bên cạnh đó cây đậu tương cũng được coi là một thành phần quan trọng trong hệ thống canh tác về phương diện sinh thái Do có khả năng cố định đạm, đậu tương ít bị phụ thuộc vào phân đạm hơn so với các loài cây trồng khác Hơn thế, nó còn có khả năng cố định nitơ và cung cấp nguồn đạm cho cây trồng

vụ sau Vì thế đậu tương trở thành cây trồng quan trọng trong luân canh và trồng xen ở nước ta cũng như nhiều nước trên thế giới

Trên thế giới, diện tích và sản lượng đậu nành tăng lên rất nhanh trong vòng 5 năm qua Năm 2011, diện tích cây trồng ứng dụng công nghệ sinh học trên toàn cầu đạt 140 triệu ha, trong đó đậu nành chiếm gần 60% Theo FAO

2013, diện tích trồng đậu nành năm 2013 trên thế giới chiếm 111,27 triệu ha, năng suất bình quân 24,84 tạ/ha, sản lượng đạt 276,41 triệu tấn, tăng 14,40 triệu

ha và 45,46 triệu tấn so với năm 2008 (Bảng 2.1)

Bảng 2.1: Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới

Năm Diện tích (triệu ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (triệu tấn)

ăn chăn nuôi gia súc ngày càng gia tăng Năng suất và hàm lượng protein là chỉ

tiêu phản ánh tiến bộ nghiên cứu về đậu nành trên thế giới Dự báo diện tích trồng đậu nành trên thế giới có thể tăng nhiều vào cuối thập kỷ này do chính sách quản lý và thương mại của các quốc gia, đặc biệt trong hoàn cảnh ngày càng có nhiều quốc gia sử dụng các giống được cải tiến thông qua chỉ thị phân tử, biến đổi gen (Clive James, 2011) Diện tích đậu nành trên thế giới, tập trung chủ yếu ở

Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Argentina, Ấn Độ, trong đó nước Mỹ thường chiếm 1/3 diện tích đậu nành hằng năm (31 triệu ha) Trong khu vực châu Á, diện tích đậu nành Việt Nam đang được tăng dần, đã vượt qua Myanmar và đang đứng thứ 4 sau các nước Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên (Faostat, 2012)

Mặc dù chọn giống truyền thống đã góp phần tạo ra các giống đậu tương mới làm tăng năng suất cải thiện chất lượng sản phẩm, nhưng quá trình chọn giống quá dài, thời gian để tạo ra được giống đậu tương mới khoảng từ 8-10 vụ Ngày nay cùng với sự phát triển của di truyền phân tử và công nghệ sinh học, việc ứng dụng chỉ thị phân tử DNA đã giúp các nhà chọn giống xác định nhanh

sự có mặt của các gen mục tiêu Việc chọn lọc có thể được tiến hành ngay từ các giai đoạn phát triển sớm của cây, không cần chờ đợi tới khi cây phát triển thành thục Hơn nữa, sử dụng chỉ thị DNA tạo điều kiện chọn lọc bố mẹ đúng

để lai tạo có hiệu quả hơn Khi kết hợp với dữ liệu kiểu hình, chỉ thị DNA đánh giá ở con lai thử sớm có thể sử dụng để dự đoán năng suất con lai ở các thể hệ sau (Eathing ton, 1997)

2.2.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu tương tại Việt Nam

Với những giá trị kinh tế và sử dụng, đậu tương được xem là loại cây trồng chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới, đứng thứ tư sau lúa, ngô và lúa mỳ Ở Việt Nam, cây đậu tương được trồng từ rất lâu và nhu cầu tiêu thụ đậu tương cũng rất lớn, nên sản xuất đậu tương trong nước đang được chú trọng, diện tích gieo trồng vì thế đã tăng lên đáng kể Đậu tương được trồng ở cả 7 vùng sinh thái, ở 28 tỉnh thành trên khắp cả nước, trong đó 70% ở miền Bắc và 30% ở miền Nam Cây đậu tương ở nước ta được trồng chủ yếu ở vùng cao, những nơi đất không cần màu

mỡ (khoảng 65%) và 35% được trồng ở những vùng đất thấp, ở khu vực đồng bằng sông Hồng Theo số liệu của Tổng cục thống kê, từ năm 2008 đến nay, diện tích trồng, năng suất và sản lượng đậu tương không có sự tăng đáng kể so với những năm trước Năm 2012, sản lượng đậu nành nước ta giảm 34,3% so với cùng

kỳ năm trước, xuống còn 175,2 nghìn tấn do thời tiết lạnh khác nghiệt vào cuối năm 2011 và đầu năm 2012 khiến cho năng suất và diện tích gieo trồng giảm mạnh (Bảng 2.2: Sản lượng đậu nành Việt Nam) Diện tích trồng đậu nành năm 2015

nước ta giảm khoảng 70 nghìn ha so với năm 2010 và sản lượng đạt ở mức 192,4 nghìn tấn Theo số liệu thống kê chính thức, đậu nành đang được trồng tại 25 trong

số 63 tỉnh thành cả nước, với khoảng 65% tại các khu vực phía Bắc và 35% tại các khu vực phía Nam Theo số liệu dự báo của USDA, diện tích đất quy hoạch khoảng 100 nghìn ha, tận dụng tăng vụ trên đất lúa để năm 2020 diện tích gieo trồng khoảng 350 nghìn ha, sản lượng 700 nghìn tấn; vùng sản xuất chính là đồng bằng sông Hồng, trung du miền núi phía Bắc, Tây Nguyên

Bảng 2.2: Sản lượng đậu nành Việt Nam Năm Diện tích (nghìn ha) Năng suất (tấn/ha) Sản lượng (nghìn tấn)

nhà nghiên cứu quan tâm (Akkaya et al., 1992; Narvel et al., 2000; Chen and

Nelson, 2005) Phát hiện, hiểu biết và kiểm soát của virus khảm đậu tương

(SMV) (Xiaoyan Cui et al., 2011) Xác định và phân phối các chủng phân lập của virus khảm đậu tương ở miền Nam Trung Quốc (K Li et al., 2010)

Ở Việt Nam, nghiên cứu các giống đậu tương kháng khảm lá bằng chỉ thị phân tử DNA ở Việt Nam đã được nghiên cứu bởi: Lò Thị Mai Thu và cộng sự (2013, 2014) Đặc điểm của đoạn gen mã hóa coat protein phân lập từ SMV (Lò Thị Mai Thu và cộng sự, 2014) Triệu Thị Thịnh và cộng sự, (2010) phân tích đa dạng di truyền của đậu tương bằng chỉ thị SSR; Nguyễn Thị Lang và cs., (2007) nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu nành bằng chỉ thị phân tử RAPD và SSR… Cho đến nay đã có 31 giống đậu tương được công nhận chính thức và tạm thời, những giống được giới thiệu ở miền Bắc qua công tác nghiên cứu của nhiều Viện, Trường trong thời gian gần đây như ĐVN 5, DT 2001, ĐT

2006, AK 05 và các giống đậu tương đột biến như DT 96, ĐT 84, ĐT 10, ĐT 26,

ĐT 27 không những cho năng suất cao mà còn có khả năng chịu hạn, đã phát huy tốt trong sản xuất (Nguyễn Văn Chương và cs., 2010)

Hiện nay, chính phủ đang có nhưng ưu tiên để nghiên cứu phát triển cây

trồng này thông qua nhiều chủ trương như: Chiến lược quốc gia sau thu hoạch lúa gạo, ngô, đậu nành và lạc đến năm 2020 (Quyết định 20/2007/QĐ-BNN); đề

án tái cơ cấu ngành nông nghiệp theo hướng nâng cao giá trị gia tăng và phát triển bền vững (Quyết định 899/QĐ-TTg) Theo đó, Bộ Nông nghiệp và PTNT

đã ban hành Quyết định 986/QĐ-BN-KHCN về việc thúc đẩy nghiên cứu và ứng dụng phục vụ tái cơ cấu ngành nông nghiệp và gần đây nhất là Quyết định 3367/QĐ-BNN-TT phê duyệt Quy hoạch chuyển đổi cơ cấu cây trồng trên đất lúa giai đoạn 2014 - 2020

2.3 BỆNH TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG

Cây đậu tương có thể mắc một số bệnh do vi khuẩn, nấm hoặc virus, như

bệnh khảm do SMV hoặc BYMV, bệnh gỉ sắt hại đậu tương do nấm Phakopsora

pachyrhizi , bệnh Sương mai (đốm phấn) do nấm Peronospora manshurica, bệnh

lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani hoặc Fusarium solani fsp Phaseoly, bệnh

đốm lá vi khuẩn hại đậu tương và một số bệnh hại khác Thống kê trên thế giới cho thấy có hơn 100 loại virus gây hại trên cây đậu tương Bệnh virus đậu tương phân bố rộng khắp và gây thiệt hại lớn đến năng suất và chất lượng sản phẩm Tại những nơi bị nhiễm bệnh nặng, năng suất có thể bị giảm đến 50% ở ngoài đồng, mức giảm có thể lên đến 93% - 95% trong điều kiện lây nhiễm trong thí nghiệm (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999) Một số nước có tỷ lệ thiệt hại lớn

do bệnh virus ở đậu tương, như vùng Georgia ở Mỹ (37%), Australia và Thái lan (60%), New Zealand và khu vực Bắc Mỹ (40- 50%) (Afanasiev and

Morris,1952); Hartman et al., 1999)

Hình 2.2: Các bệnh hại phổ biến trên cây đậu tương

A: Bệnh gỉ sắt (Nguồn: www.apsnet.org) B: Bệnh sương mai (Nguồn: www.nnptntvinhphuc.gov.vn) C: Bệnh thối thân (Nguồn: www.plantmanagementnetwork.org)

(Xiaoyan Cui et al., 2011) Tác hại của bệnh tùy thuộc vào giống và khí hậu Ở

nhiệt độ cao, bệnh không biểu hiện triệu chứng bệnh Năng suất có thể giảm trên

85% khi cây không được sử dụng các biện pháp bảo vệ (Silva et al., 2003) Bệnh được ghi nhận đầu tiên ở Mỹ vào những năm đầu của thập niên 1900 (Hartman et

al., 1999) Bệnh hiện diện ở khắp các vùng trồng đậu tương trên thế giới, và khi bệnh xuất hiện sớm sẽ dẫn đến thất thu nặng Việt Nam cũng đã công bố phát hiện loại virus này từ năm 1994, chủ yếu tập trung ở những vùng trồng đậu tương lớn, như khu vực trung du, miền núi Bắc bộ, khu vực Đồng Bằng Sông Hồng và Tây Nguyên (Ngô Thế Dân và cs., 1999; Vũ Triệu Mân, 2003) Bệnh có thể xuất hiện khá sớm và gây thiệt hại nặng ở những ruộng không được trị bệnh kịp lúc

Dấu hiệu và triệu chứng bệnh: Những cây đậu tương bị nhiễm SMV thường sinh trưởng phát triển chậm, hình thái thân, lá, quả bị biến dạng (Hill, 1999) Lá bị mất màu, loang lổ, lá nhỏ lại, phát triển không đều, bìa lá cong xuống làm lá biến dạng Phiến lá bị xếp nếp nhăn nhúm, có màu loang lổ xanh nhạt và xanh đậm và thường dày hơn lá bình thường Dọc gân lá, mô tế bào nổi rộp lên những mụn màu xanh đậm Cây lùn xuống do các lóng thân phát triển kém Quả và hạt phát triển chậm lại, nhất là các quả ở phần trên của cây Quả chín chậm, hạt nhỏ, vỏ hạt bị đổi thành màu nâu nhạt và đậm không đều Triệu chứng bệnh bệnh được biểu hiện rõ ở 18,50C Trên 29,50C triệu chứng bệnh sẽ ở

dạng tiềm ẩn (Hill et al., 1987)

Hình 2.3: Lá cây đậu tương bị khảm vàng

(Nguồn: http://ssnavi.public.iastate.edu/soybeanmosaicviruspics.html)

Tác nhân gây bệnh: Bệnh khảm lá đậu tương do virus Soybean mosaic

virus (SMV) gây ra SMV thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae gây bệnh khảm lá

đậu tương Chúng có dạng hình sợi mềm với đường kính khoảng 11-15nm, chiều dài khoảng 750nm Axit nucleic là RNA dạng sợi đơn, phân tử lượng 3,25x106 KDa, tổng kích thước bộ gen khoảng 10,4Kb Thành phần bộ gen bao gồm 24,3% G; 29,9% A; 14,9% C và 30,9% U

SMV có thể tồn tại và lan truyền qua hạt giống Trong hạt giống virus có thể tồn tại được hai năm Ngoài ra, virus có thể lan truyền qua nhiều loài rệp

muội như: Aphis gossypii, A cracivora, A citricola, Rhopalosiphum maydis theo

kiểu không bền vững

Hình 2.5: Rệp muội Aphis gossypii

(Nguồn: http://aphid.aphidnet.org/)

SMV có phạm vi ký chủ rộng và gây hại trên 30 loài cây trồng đặc biệt là những cây họ đậu Bệnh phát triển mạnh trên những cây đậu tương trồng vào vụ đông vào giai đoạn cây ra hoa và hình thành quả Bệnh gây hại nặng ở những ruộng đậu tương chăm sóc kém, bón nhiều đạm hoặc bón phân không cân đối

Phòng trừ bệnh khảm vàng: Chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống Trồng cách ly ruộng làm giống với ruộng đậu thương phẩm Vệ sinh đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng Nhổ bỏ những cây bị bệnh trên ruộng, tránh lây lan từ cây bênh sang cây khỏe Diệt trừ côn trùng truyền bệnh (rệp, bọ trĩ) bằng các loại thuốc hoá học Bệnh do virus gây ra nên chưa có thuốc trị

Tuy nhiên, các biện pháp nêu trên không mang lại hiệu quả cao trong việc phòng trừ đối với bệnh mà lại tốn nhiều thời gian, công sức Vì thế, hướng giải quyết tốt nhất để phòng và trừ bệnh là tạo ra những giống cây đậu tương kháng lại loại virus này

2.5 NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG KHÁNG BỆNH VIRUS KHẢM

LÁ ĐẬU TƯƠNG

2.5.1 Các gen kháng bệnh khảm lá đậu tương

Hiện nay trên thế giới sử dụng giống đậu tương kháng SMV được xem là cách hiệu quả nhất để kiểm soát bệnh Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm hơn đến vấn đề “chọn giống nhờ chỉ thị phân tử”, sử dụng các chỉ thị phân tử phát hiện ra nguồn gen kháng khảm

lá đậu tương Các nhà khoa học đã tìm được vị trí các gen được định vị trên từng nhiễm sắc thể, cũng như các chỉ thị phân tử DNA liên kết với các gen đó, tạo ra các bản đồ di truyền liên kết gen Dựa vào các chỉ thị này, chúng ta có thể phát hiện được sự có mặt của một gen bất kỳ, nếu biết được một hoặc nhiều chỉ thị

liên kết chặt với gen đó Cho đến nay, 3 gen Rsv đã được xác định và lập bản đồ (Shi A et al., 2008) Trong nghiên cứu các giống đậu tương kháng bệnh khảm lá

trên thế giới đang được quan tâm nhiều nhất là ở các nước như: Mỹ, Trung Quốc, Nhật Bản, Iran Ở Trung Quốc có hai giống cây trồng: “J05” và “V94-5152” đó

là giống có mang gen kháng Rsv1, Rsv3, Rsv4, đã được chọn là giống kháng bệnh khảm lá trong nhân giống đậu tương ở nước này (Shi A et al., 2009)

Sàng lọc rộng rãi cho đậu tương kháng SMV đã xác định với ba gen kháng

độc lập, 3 gen kháng bệnh khảm lá đó là: gen Rsv1 (Kiihl và Hartwig., 1979; Yu

et al , 1994) kháng các chủng G1-G4, gen Rsv3 (Buss et al.,1999) kháng các

chủng G5-G7, gen Rsv4 (Ma et al.,1995) kháng các chủng G1-G7 Các gen

kháng bệnh khảm lá đậu tương kháng lại virus SMV theo cơ chế câm gen

(RNAi) Đến nay, nhiều chỉ thị liên kết với gen Rsv1 và gen Rsv3 đã được phát

triển, trong đó Sat_154 và Satt560 là chỉ thị tốt nhất cho phép phát hiện dễ dàng

các cây mang gen kháng Rsv1 và gen Rsv3 (Shi A et al., 2009) tạo thuận lợi lớn

cho công tác chọn tạo giống kháng

Gen Rsv1 nằm trên nhiễm sắc thể số 13 kháng được cá chủng từ G1-G4, và được chia thành chín alen nhỏ là: Rsv1 (Kiihl và Hartwig, 1979), Rsv1-h (Lim, 1985; Chen et al., 2002), Rsv1-k (Buss et al., 1989; Chen et al., 1991), Rsv1-m (Buss et al., 1989; Chen et al., 1991), Rsv1-n (Ma et al., 2003), Rsv1-r (Chen et al., 2001), Rsv1-s (Chen et al., 1993), Rsv1-t (Kiihl and Hartwig 1979; Chen et al., 1991), Rsv1-y (Roane et al., 1983 ; Chen et al., 1991) Gene Rsv3 (Buss et al., 1999) nằm trên nhiễm sắc thể số 14 kháng các chủng G5-G7 Gene Rsv4 (Ma et al., 1995; Buss et

al., 1997) nằm trên nhiễm sắc thể số 2 kháng các chủng G1-G7

Gen Rsv1 và Rsv3 là hai gen kháng khảm lá quan trọng, có tính kháng cao, kháng được các chủng đặc hiệu Gen Rsv1 và Rsv3 đã được sử dụng rộng rãi nhất trong tạo các giống đậu tương chống chịu Soybean mosaic virus khoảng hai thập

kỷ và nó vẫn đang được sử dụng và phát triển trong nhiều lĩnh vực của đậu tương

(Shi A et al., 2008) Gen Rsv1 được xác định nằm ở nhiễm sắc thể số 13, nằm

giữa marker Sat_154 và Satt510 trong nhóm liên kết phân tử F của bản đồ gen

đậu tương; độ liên kết với Sat_154 là 0,5cM (Shi A et al., 2008) Gen Rsv3 được

xác định nằm ở nhiễm sắc thể số 14, Sat_424 và Satt560 trong nhóm liên kết phân tử B2 của bản đồ gen đậu tương; độ liên kết với Satt560 là 0,7cM

Marker Sat_154 đã được sử dụng để phát hiện gen Rsv1 với kích thước sản phẩm là 310bp, marker Satt560 đã được sử dụng để phát hiện gen Rsv3 với

kích thước sản phẩm là 300bp

2.5.2 Các loại chỉ thị phân tử DNA

Đánh giá sự đa dạng di truyền có vai trò quan trọng trong cung cấp thông tin cho quản lý và sử dụng hiệu quả nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn tạo giống Chỉ thị phân tử DNA là chỉ thị phân tích đa dạng di truyền hiệu quả và không bị ảnh hưởng nhiều từ các yếu tố môi trường Trong các loại chỉ thị phân tử RFLP, AFLP, RAPD, SSR, chỉ thị SSR là chỉ thị đồng trội biểu thị tính đa hình cao,

được coi là chỉ thị hữu ích để phát hiện sự đa dạng di truyền đậu tương (Akkaya

et al , 1992; Abe et al., 2003; Hwang et al., 2008; Wang and Takahata, 2007)

Việc sử dụng chỉ thị phân tử DNA đã cung cấp một cơ hội mới không chỉ đối với việc nghiên cứu hệ gen mà cả trong việc nghiên cứu đa dạng cùng nguồn gốc phát sinh của các loài sinh vật Bởi lẽ sự đa dạng của acid nucleic là hết sức phong phú Một số phương pháp sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền:

di truyền của tập đoàn giống Với kỹ thuật RAPD và RFLP, Lambrides C.J và

cộng sự đã thành lập được bản đồ gen của đậu xanh (Lambrides et al., 2004)

Nguyên lý: Kỹ thuật RAPD có cơ sở là kỹ thuật PCR, nhưng sử dụng mồi ngắn ngẫu nhiên để nhân bản những đoạn DNA hoàn toàn ngẫu nhiên trong hệ gen

Thành phần phản ứng: cũng tương tự phản ứng PCR, các yếu tố cần thiết

để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm:

- DNA khuôn (DNA template) là vật liệu khởi đầu cho phản ứng RAPD, được tách từ các mẫu virus, vi khuẩn, tế bào thực vật, động vật…DNA có độ tinh sạch, có thể là sợi đôi, mạch vòng hoặc mạch thẳng DNA khuôn được khuyếch đại dưới dạng thẳng có hiệu quả hơn dạng vòng (Phạm Thành Hổ, 2006)

- Đoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi đó là một oligonucleoticle có trật

tự nucleoticle ngẫu nhiên và có chiều dài từ 8-10 nucleoticle (thường sử dụng mồi dài 10 nucleoticle) Nhiệt độ gắn mồi trong phản ứng (phù hợp với lượng DNA cần tổng hợp) tạo nên lượng sản phẩm cần thiết Nồng độ mồi thích hợp để tiến hành phản ứng thường là 0,1–0,5µM

- Taq-polymerase: là một enzym tổng hợp DNA, có vai trò quyết định đến phản ứng PCR Đây là loại enzym chịu được nhiệt độ cao Taq-polymerase được tách chiết từ những vi khuẩn sống ở suối nước nóng Thermus aquaticus không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ biến tính (92- 95oC) Taq-polymerase có hoạt tính ở dải nhiệt độ cao, tồn tại ở nhiệt độ ủ 95oC kéo dài Enzym này có

hoạt tính cao ở 72- 80oC làm cho phản ứng xảy ra nhanh, hiệu quả và chính xác (Khuất Hữu Thanh, 2006)

- dNTP: là các nucleoticle tự do được sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng RAPD, gồm 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP Nồng độ dNTP mỗi loại thường dùng trong các phản ứng RAPD khoảng 50-200µM

Dung dịch đệm: là một trong những yếu tố quan trọng làm ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả của phản ứng Thành phần của dung dịch đệm của phản ứng bao gồm: Tris HCl 100mM (PH= 8,3 ở nhiệt độ phòng), KCl 50mM, MgCl21,5mM khi ủ ở nhiệt độ phòng Nồng độ MgCl2 có thể từ 0,5-5mM

Chu kỳ phản ứng: được tiến hành qua các giai đoạn sau:

- Giai đoạn biến tính DNA: ở nhiệt độ 95oC trong 30-60 giây làm cho các liên kết hydro giữa các mạch bị đứt khi đó DNA sợi đôi tách thành hai sợi đơn tạo điều kiện cho sự bắt cặp mồi

- Giai đoạn tiếp hợp mồi: Nhiệt độ hạ xuống 32–40oC mồi bám vào đầu 3’OH của mạch khuôn DNA và bắt đầu quá trình tổng hợp sợi mới

- Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được nâng lên 72oC thì các đoạn mồi đã bắt cặp với các mạch đơn sẽ được kéo dài với sự tham gia của Taqpolymerase

Một chu kỳ trên xảy ra, một đoạn DNA được nhân lên thành hai, các đoạn DNA được nhân tiếp tục được coi là các mạch khuôn để tổng hợp cho chu kỳ sau Như vậy sau n chu kỳ sẽ tạo ra 2n-2 các đoạn DNA giống hệt đoạn DNA khuôn ban đầu Phản ứng RAPD có thể thực hiện 40-45 chu kỳ

2.5.2.2 Kỹ thuật AFLP

AFLP (Amplified Fragment Length Plymorphism – đa hình chiều dài các đoạn DNA được nhân bản chọn lọc) là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR, kỹ thuật này cho phép phát hiện một cách có chọn lọc các đoạn DNA hệ gen đã ñược cắt bởi enzym giới hạn và gắn với đoạn tiếp hợp

Về nguyên tắc kỹ thuật AFLP: DNA genome được cắt đồng thời với hai loại enzyme khác nhau thành các đoạn có kích thước không giống nhau, trong số

đó sẽ có một số đoạn mang một số phân đoạn có các đầu mút giống nhau Nếu ta

sử dụng một số đoạn nối (adaptor) như nhau có gắn thêm một hoặc một số oligonucleotide được chọn lọc trước để định hướng cho việc gắn các cặp mồi PCR thì tất cả các đầu mút giống nhau sẽ được nhân bản Khi thay đổi số lượng

và trình tự các oligonuceotide được chọn lọc ở các đầu nối ta có thể nhận lại

được những đoạn DNA được nhân bản khác nhau

Kỹ thuật AFLP có ưu điểm là phân tích đa hình di truyền trong thời gian ngắn, lượng DNA dài hơi ít nhưng sự đa hình cao Kỹ thuật này được đánh giá là nhanh chóng và hiệu quả trong việc xác định tính đa dạng và di truyền trong cây trồng như: lúa, lạc, đậu,

SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống cây trồng,

do khả năng phát hiện tính đa hình rất cao Song chỉ thị này có nhược điểm là phức tạp trong thiết kế mồi và giá thành thiết kế mồi cao Trong thực tế chỉ thị này được sử dụng để nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất, bệnh hại, xác định giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lập bản đồ

gen…(Singh et al., 2000) Lần đầu tiên sự thể hiện của SSR về những biến đổi

ở mức độ alen và tính di truyền được tìm thấy ở một loài thực vật là đậu tương

và đây là một trong những chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật PCR thành công nhất hiện nay Akaya và cs (1992) đã phân tích đa dạng di truyền trên 43 giống đậu tương ở Bắc và Nam Mỹ Kết quả cho thấy SSR có sự đa hình cao và đa dạng alen cho từng locus với trình tự AT và ATT Rongwen và cs (1995) đã công bố về những biến đổi alen của SSR, có 28 alen SSR được nhắc lại trong nhóm 96 kiểu gen đậu tương Có 18 trong 29 nhóm liên kết chứa ít nhất một locus SSR được phân bố khá ngẫu nhiên trong hệ gen đậu tương Maughan (1995) nghiên cứu trên 94 giống đậu tương đã xác định được 79 alen trên 5 locus Diwan và Cregan (1997) đã xác định được trung bình là 10 alen trên mỗi locus với 20 chỉ thị SSR

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Các nội dung nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng- Khoa Công nghệ sinh học, Trung tâm Bảo tồn và Phát triển nguồn gen cây trồng - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

- Từ tháng 1 năm 2015 đến tháng 12 năm 2015

- Gieo trồng vụ Xuân, ngày gieo 28/02/2015

3.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Gồm tập đoàn 150 mẫu giống đậu tương cung cấp bởi Trung tâm Bảo tồn và Phát triển nguồn gen cây trồng đã thu thập

- Giống đối chứng DT 96 được trồng phổ biến ở miền Bắc Việt Nam

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Đánh giá đặc điểm nông sinh học (hình thái, đặc điểm sinh trưởng và phát triển ), năng suất, chất lượng của đậu tương

- Dùng chỉ thị phân tử DNA phát hiện 2 gen kháng Rsv1, Rsv3

- Đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống đậu tương bằng chỉ thị SSR

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp khảo sát tập đoàn

- Bố trí thí nghiệm: Theo phương pháp khảo sát tập đoàn tuần tự không

nhắc lại

- Khoảng cách, mật độ gieo trồng:

Khoảng cách giữa cây x cây 20cm, hàng x hàng 40cm, luống x luống 30cm, bề mặt luống ruộng khoảng 80cm, rãnh sâu khoảng 20cm Mỗi giống 5m2, mật độ 30 cây/ m2

- Phân bón:

+ Lượng phân bón cho 1 ha: 30kg N + 60kg P205 + 60kg K20

+ Cách bón: 1/2 lượng đạm, 1/2 lượng kali và toàn bộ phân lân được trộn đều và bón vào hàng đã rạch sẵn Sau khi bón phân, lấp một lớp đất nhẹ phủ kín

phân rồi mới gieo hạt để tránh hạt tiếp xúc với phân làm giảm sức nảy mầm Bón thúc 1 lần khi cây có 2-3 lá thật: 1/2 lượng đạm + 1/2 lượng kali

- Phòng trừ sâu bệnh: Phun một lần thuốc trừ sâu khi ra hoa, đậu quả

Đánh giá các đặc điểm nông sinh học

Chọn cây theo dõi: 10 cây, lấy 5 cây liên tiếp ở 2 hàng giữa luống, trừ 5

cây đầu hàng

Các đặc điểm theo dõi: (theo QCVN 01-58:2011/BNNPTNT)

- Thời gian mọc (ngày): Quan sát khi có khoảng 50% số hạt/ô mọc 2 lá mầm

- Màu sắc cánh hoa: Quan sát khi ra hoa (màu tím hoặc trắng)

- Màu sắc lá: Quan sát trước khi ra hoa (xanh nhạt, xanh đậm)

- Hình dạng lá: Quan sát lá khi ra hoa (hình trứng, trái xoan, hình thoi)

- Thời gian ra hoa (ngày): Quan sát khi có khoảng 50% số cây/ô có ít nhất

1 hoa nở

- Thời gian sinh trưởng (ngày): Số ngày từ gieo đến khi có hoảng 95% số quả trên ô có vỏ quả chuyển màu nâu hoặc đen

- Chiều cao cây (cm): Đo từ mặt đất đến đỉnh cao nhất của thân chính của

10 cây mẫu/ô, đo khi thu hoạch

- Màu sắc vỏ hạt (trừ rốn hạt): Quan sát khi hạt khô (vàng, xanh, nâu, đen)

- Màu sắc rốn hạt: Quan sát khi hạt khô (trắng, xám, nâu, đen, đen không hoàn toàn)

Năng suất, các yếu tố cấu thành năng suất

Theo QCVN 01-58 : 2011/BNNPTNT

- Số quả/cây (quả): Đếm tổng số quả trên 10 cây mẫu/ô Tính trung bình 1 cây

- Số quả chắc/cây (quả): Là quả có ít nhất 1 hạt chắc đếm trên 10 cây mỗi giống Tính trung bình 1 cây

- Tỷ lệ quả chắc/cây (%) = (Số quả chắc/cây / Số quả/cây) x 100

- Số hạt trung bình/quả (hạt): Đếm số hạt và quả trên 10 cây mẫu/ô

- Khối lượng 1000 hạt (g): Xác định khối lượng 1000 hạt ở độ ẩm khoảng 12% Cân 3 mẫu, mỗi mẫu 100 hạt đại diện để lấy tỷ lệ tương ứng cho khối lượng 1000 hạt ở độ ẩm khoảng 12% (lấy 1 chữ số sau dấu phẩy)

- Năng suất hạt khô (tạ/ha): Thu riêng hạt khô sạch của từng ô, tính năng suất toàn ô (gồm cả khối lượng hạt của 10 cây mẫu) ở độ ẩm 12% và quy ra năng suất trên 1 ha, lấy 2 chữ số sau dấu phẩy

Năng suất lý thuyết (NSLT) (tạ/ha):

NSLT = Quả chắc/cây x hạt chắc/quả x P1000 hạt x số cây/m2

- Hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl

Protein được định lượng bằng cách xác định nitơ tổng số và kết quả nhân với 6,25, nghĩa là coi protein luôn chứa 16% là nitơ (vì trong phân tử protein thì hàm lượng nitơ tương đối cao và khá ổn định khoảng 30– 40%)

Quá trình được thực hiện qua các bước:

Bước 1: vô cơ hóa mẫu: hạt đậu tương được sấy khô tuyệt đối (105oC, trong 30 phút) Sau đó nghiền thành dạng bột, cân 0,1-0,3g mẫu (không tro) cuộn tròn cho mẫu cẩn thận vào tận đáy bình Kjeldahl, thêm vào vài giọt nước cất khử trùng để thấm ướt bột Tiếp tục cho 0,5g hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 (hoặc selen, hay H2O2 30%, hay HClO4 70%) và 10ml H2SO4 đặc Để bình Kjeldahl trên bếp điện đặt trong tủ hotte và đun cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt

và có màu xanh da trời nhạt là được Lấy ra để nguội Chuyển sang bình định mức 100ml, tráng bình Kjeldahl nhiều lần bằng nước cât khử trùng và định mức

Bước 2: Chưng cất cất đạm:

+ Lắp ráp bộ cất đạm và rửa sạch bộ cất đạm

+ Cho vào bình tam giác và 5 giọt chỉ thị Tashiro, dung dịch có màu xám (chỉ thị Tashiro có màu xanh lục nếu pH>5,5, màutím nếu pH<5,5 và màu xám

+ Mở nước vào ống sinh hàn

+ Tiến hành cất kéo hơi nước 15 - 30 phút

+ Nâng đầu ống sinh hàn lên khỏi mặt dung dịch trong bình tam giác, dùngbình tia rửa đầu ống sinh hàn, tiếp tục cất thêm 2 phút nữa Kiểm tranướcchảy ra ở đầu ống sinh hàn không làm đổi màu giấy quỳ là được

Bước 3: Chuẩn độ: Lượng H2SO4 còn dư trong bình hứng được chuẩn

độ bằng NaOH 0,01N Qúa trình chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ đỏ sang màu nhạt Ghi thể tích dung dịch NaOH 0,01N tiêu tốn

Tính toán kết quả: Hàm lượng nitơ toàn phần được tính theo công thức:

Nito (%) = (V0 – V1)x a x 0,0014 x 100

10 x m Trong đó: Nito: % khối lượng nitơ trong mẫu

a: tỉ số thể tích H2SO4 0,01N và thể tích NaOH tiêu tốn khi chuẩn độ

V0: số ml H2SO4 đem hấp thụ NH3

V1: số ml NaOH 0,01N tiêu toán khi khi chuẩn độ H2SO4 thừa

m: khối lượng mẫu đem vô cơ hóa

0,0014: lượng gram nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N

Sau đó lấy kết quả nhân với 6,25 để định lượng Protein trong hạt đậu tương

Protein(%) = X(%) x 6,25

- Hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxlet (sắc ký)

Dựa trên khả năng hòa tan của lipid trong dung môi hữu cơ không phân cực, dùng dung môi hữu cơ để trích lipid ra khỏi nguyên liệu đã được nghiền nhỏ Trong quá trình trích, các hợp chất tan được trong chất béo như các sắc tố, các vitamin tan trong chất béo cũng bị tách ra khỏi nguyên liệu Do có lẫn các tạp chất khác, nên thành phần trích ly được gọi là lipid tổng số hay lipid thô

Tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Minh Chơn và cs (2005): + Sấy khô nguyên liệu đã được nghiền nhuyển đến khối lượng không đổi Cân chính xác khoảng 5 gam nguyên liệu (sử dụng cân phân tích), cho vào túi giấy lọc đã được sấy khô và biết khối lượng (túi giấy phải có đường kính nhỏ hơn đường kính trụ chiết và chiều dài ngắn hơn chiều cao của ông chảy tràn)

+ Đặt túi giấy có chứa mẫu vào trụ chiết

+ Lắp trụ chiết vào bình cầu (đã được sấy khô và xác định khối lượng) và lắp ống sinh hàn

+ Cho dung môi vào trụ chiết sao cho một lượng dung môi chảy xuống khoảng ½ bình cầu và còn một lượng trên phểu chiết còn đủ ngập mẫu

+ Mở nước vào ống sinh hàn

+ Đặt hệ thống Soxhlet lên bếp cách thủy và điều chỉnh nhiệt độ sao cho chu kỳ hoàn lưu của dung môi đạt từ 5 đến 8 lần trong một giờ Chiết trong 8 –12 giờ cho đến khi trích ly hoàn toàn chất béo Thử thời điểm kết thúc quá trình trích bằng cách lấy vài giọt ether từ đầu cuối trụ chiết cho lên đĩa kính đồng hồ sạch Sau khi dung môi bay hơi hết, trên mặt kính đồng hồ không để lại vết dầu loang thì xem như lipid đã được chiết hoàn toàn

+ Sau khi chiết xong, lấy bình cầu và túi đựng mẫu ra, lắp ống sinh hàn vào bình cầu mới và cất thu hồi ether

Tính toán kết quả: Sấy bình cầu có chứa lipid đến khối lượng không đổi, cân xác định khối lượng Nếu chiết bằng ether ethylic thì sấy khô ở nhiệt độ 60-

70oC trong 30 phút, nếu chiết bằng ether dầu hỏa thì sấy ở nhiệt độ 80- 90oC trong 45-50 phút Hàm lượng lipid có trong 100 gram nguyên liệu được tính theo công thức sau: X(%) = (a-b) x 100

m Trong đó: X(%): Hàm lượng lipid tính theo %

a: Khối lượng bình có chứa chất béo (g) b: Khối lượng bình cầu ban đầu (g) m: Khối lượng mẫu khan nước ban đầu (g)

Hình 3.1: Bộ chưng cất đạm Kjeldahl và Soxhlet

(A: Bộ chưng cất đạm Kjeldahl; B: Hệ thống Soxhle)

3.5.2 Đánh giá tính kháng bệnh và ứng dụng chỉ thị phân tử DNA xác định gen kháng

Đánh giá mức độ nhiễm bệnh khảm lá ngoài đồng ruộng:

- Đánh giá theo QCVN 01-58:2011 của Bộ NN&PTNT

- Triệu chứng bệnh: Khi bị bệnh lá cây có những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ, cây chậm phát triển Lá non ở ngọn khảm lá mạnh và biến dạng Quả thường lép Cây bị bệnh đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chùn lại, phát triển chậm, quả ít và biến dạng, sần sùi, có vị đắng

- Cấp độ nhiễm bệnh: Đánh giá cả thời gian sinh trưởng và phát triển theo các cấp bệnh: Cấp 1: Rất nhẹ, <1% diện tích lá bị bệnh; Cấp 3: Nhẹ, 1- 5% diện tích lá bị bệnh; Cấp 5: Trung bình, 6- 25% diện tích lá bị bệnh; Cấp 7: Nặng,

>25- 50% diện tích lá bị bệnh; Cấp 9: Rất nặng, >50% diện tích lá bị bệnh

Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện gen kháng Rsv1 và Rsv3:

Sử dụng cặp mồi Sat_154 (Song et al., 2004) có nhiệt độ gắn mồi là TaoC

= 54oC để phát hiện gen Rsv1 và cặp mồi Satt560 (Song et al., 2004) có nhiệt độ

gắn mồi là TaoC = 47oC để phát hiện gen Rsv3

Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu:

Sat_154 F: 5’-GCG GAC GCA TTT CCT ATT GAT CAA G-3’ Sat_154 R: 5’-GCG TCA GGG TCA AGT CAT CTA ACA-3’ Satt560 F: 5’-GCG GTG GAC TTC GCC TCA AAT AAT-3’ Satt560 R: 5’-GCG ATC GTG CAA GAA AAT A-3’

Chiết tách DNA: DNA được chiết xuất theo phương pháp CTAB (Doyle, 1987) Các bước tiến hành như sau:

Nghiền mẫu lá (100mg) với 700 µl đệm chiết CTAB (20 mM EDTA, 0,1

M Tris-HCl pH 8,0, 1,4 M NaCl, 2% CTAB, 0,4% B-mercaptoethanol), sau đó ủ ở 65°C trong 30 phút, nhằm phá hủy màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA

Kết tủa protein bằng 700 µl dung dịch phenol/chloroform/isoamyl (25:24:1) Sau đó ly tâm 13000 vòng/ phút trong 5 phút ở nhiệt độ 4oC, sẽ được dung dịch phía trên là DNA hòa tan

Tủa DNA bằng cách dùng isopropanol (tỷ lệ 1:1), các DNA trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa, rửa kết tủa vài lần trong ethanol 70% để loại

bỏ muối hoặc isopropanol còn lại Thu được DNA

DNA được làm khô và hòa tan trong 50µl đệm TE (10 mM Tris-HCl, 1

mM EDTA, pH 8,0) Sau đó bảo quản ở -4oC

Thành phần phản ứng PCR gồm 20 µl trong đó:10 µl PCR master mix, 1

µl primer F, 1 µl primer R, 7 µl H20, 1 µl DNA nguyên liệu

Chu kỳ nhiệt: 950C/2 phút; 35 chu kỳ gồm 950C/30 giây, Ta0C/30 giây,

720C/1 phút; Cuối cùng 720C/5 phút, bảo quản 40C cho đến khi phân tích

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agrose 1,5% ở 90V trong 25 phút Gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide với nồng độ 0,5 mg/ml trong

5 phút

Chụp ảnh bản gel: Nếu giống nào xuất hiện vệt băng sáng có kích thước

310bp thì kết luận giống đó có chứa gen kháng Rsv1, xuất hiện vệt băng sáng có kích thước 300bp thì kết luận giống đó có chứa gen kháng Rsv3

3.5.3 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR

Xác định đa dạng di truyền 30 mẫu giống đậu tương từ các tập đoàn khảo sát như bảng 3.1 Sử dụng 5 chỉ thị SSR (của hãng Invitrogen), trình tự cặp mồi như bảng 3.2

Bảng 3.1: Danh sách các mẫu giống đậu tương đánh giá đa dạng di truyền

Kích thước alen

PCR với các mồi SSR được thực hiện theo phương pháp của Sambrook và Russell (2001) với tổng thể tích là 25µl/mẫu, thành phần phản ứng gồm: 13,8µl

dH2O, 2,5µl Buffer 10x, 2,5µl dNTP (25mM), 2µl Mg2+(2,5mM), 0,2µl Enzyme Taq polymerase (5Ui/µl), 2µl DNA tổng số (50ng/µl), mồi xuôi (10pM) 1µl, mồi ngược (10pM) 1µl

Trộn đều các thành phần của hỗn hợp rồi chuyển vào máy PCR sau đó chạy theo chương trình: Lặp lại 35 chu kỳ với các chu kỳ nhiệt: 94oC trong 3 phút, 94oC trong 45 giây, Ta trong 45 giây, nhiệt độ kéo dài 72oC trong 45 giây Cuối cùng 72oC trong 10 phút Giữ nhiệt độ 4oC trong 30 phút

Điện di DNA trên gel agarose được tiến hành theo phương pháp của Sambrook và Russell Gel được sử dụng trong kỹ thuật này là gel agarose 1,5% 100V, trong khoảng 30 phút Sau điện di, ngâm bản gel vào dung dịch Ethidium bromde có nồng độ 0,5 µl/ml Lấy bản gel ra sau 10 phút và rửa trong nước sạch

Quan sát và chụp ảnh trên máy Bio-rad

Xử lý kết quả phân tích SSR theo Nei (1987) Dựa vào ảnh điện di sản phẩm PCR và sự xuất hiện các băng SSR của các giống đậu tương đối với các mồi để làm cơ sở cho việc phân tích số liệu

Các số liệu này được nhập vào phần mềm Excel theo từng mồi

Hệ số đa dạng di truyền H cho mỗi chỉ thị phân tử được tính theo công thức:

H = 1 - ∑ Pi2 Trong đó: Pi là tần suất lặp alen thứ i của mỗi chỉ thị phân tử

Lập cây phân loại: Số liệu được đưa vào phần mềm chuyên dụng NTSYS pc version 2.0 để tìm ra sự sai khác giữa các giống đậu tương thông qua biểu đồ cây

ở hệ số tương đồng Jaccard Phân tích và đánh giá hệ số tương quan kiểu hình theo phương pháp phân nhóm UPGMA Sau đó sử dụng phần mềm NTYSYS 2.1x để lập biểu đồ phân nhóm 2 chiều dựa trên phân tích PCA (principal Coordinate analysis) qua đó sẽ lập thêm phân nhóm dựa trên khoảng cách di truyền giữa các dòng, giống đậu tương nghiên cứu

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1.1 Đặc điểm nông sinh học các mẫu giống đậu tương

Các đặc điểm nông sinh học là các đặc điểm bên ngoài quan sát được của mỗi giống đậu tương, giúp chúng ta nhận biết giống đồng thời qua đó phản ánh đặc điểm sinh trưởng phát triển của giống

4.1.1.1 Các đặc trưng hình thái

Đặc điểm hình thái của cây trồng là những đặc điểm dùng để nhận dạng, phân biệt giữa các cây trồng Đặc điểm hình thái là một trong những chỉ tiêu quan trọng có ý nghĩa trong công tác chọn tạo giống Đây là chỉ tiêu để nhận biết, đánh giá được sự sai khác giữa các mẫu giống khác nhau Đặc điểm về dạng thân, cành, lá và kiểu sinh trưởng giúp bố trí mật độ sao cho hợp lý với từng mẫu giống, giống có số cành nhiều thì việc bố trí khoảng cách giữa các cây phải xa hơn, giống không có nhánh thì mật độ bố trí cây dày hơn, các mẫu giống ở đây đều là cây có dạng đứng nên các mẫu giống sẽ đỡ tốn diện tích trồng bằng giống thân ngang

Kết quả đánh giá các đặc trưng hình thái của các giống đậu tương được thể hiện ở bảng sau:

Bảng 4.1 Một số đặc điểm hình thái các mẫu giống đậu tương

hoa

Hình dạng lá

Màu sắc

lá

Màu vỏ hạt

Màu rốn hạt Nhóm ngắn ngày

TT Tên giống Màu sắc

hoa

Hình dạng lá

Màu sắc

lá

Màu vỏ hạt

Màu rốn hạt

TT Tên giống Màu sắc

hoa

Hình dạng lá

Màu sắc

lá

Màu vỏ hạt

Màu rốn hạt

TT Tên giống Màu sắc

hoa

Hình dạng lá

Màu sắc

lá

Màu vỏ hạt

Màu rốn hạt

TT Tên giống Màu sắc

hoa

Hình dạng lá

Màu sắc

lá

Màu vỏ hạt

Màu rốn hạt

Hình dạng lá: Lá đậu tương có nhiều hình dạng khác nhau như: hình thoi, hình thoi mác, hình trái xoan, hình trứng Theo kết qủa nghiên cứu của các nhà chọn tạo giống đậu tương thì giống có lá to hình trứng thì khả năng vận chuyển chất dinh dưỡng tốt còn giống có dạng lá tam giác, dài là những giống có khả năng chịu hạn Qua bảng 4.1 ta nhận thấy, ở vụ Xuân hình dạng lá các giống thí nghiệm chủ yếu là hình trứng bản lá to có 115 mẫu giống tương đương giống đối chứng DT96-ĐC như: ĐTTQ 02, PI 157437, PI 86449, PI 88447, PI 89471, PI

171434, FC 31921, PI 80471, PI 423740, PI 88447, PI 157437, PI 86449, Ngoài ra còn có dạng lá hình thoi có 15 mẫu giống, 19 mẫu giống hình trái xoan