Bài tiểu luận nhỏ về phương pháp sắc ký cột lỏng HPLC(High Performance Liquid Chromatography).HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM KHOA CNSH-TP-MT TIỂU LUẬN GVHD: ThS Chu Thị Bích Phượng Lớp 14DSH04 Thành viên nhóm: Nguyễn Thanh Hiếu 1411100748 Nguyễn Thị Thu Thủy 1411100788 Trần Minh Nhi 1411100761 Lê Huỳnh Phương Trúc 1411100738 Nguyễn Minh Luân 1411100758 Trương Ngọc Phân 1411100733 Hồ Gia Mẫn 1411100598 Phan Thị Thanh Như 1411100621 Dương Đức Toàn 1411100779 Lê Minh Đức 1411100746 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC) HPLC chữ viết tắt chữ đầu tiếng Anh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography), trước gọi phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Khái niệm - Sắc ký họ kỹ thuật phân tích hóa lý dùng để tách, phân ly chất hổn hợp dựa vào phân bố khác chúng pha động pha tĩnh - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) đời năm 1967-1968 sở phát triển cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC phương pháp chia tách pha động chất lỏng pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn, hay chất mang biến liên kết hóa học với nhóm chức hữu Phương pháp ngày sử dụng rộng rãi phổ biến nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả định lượng tốt, thích hợp tách hợp chất khó bay dễ phân hủy nhiệt - Phạm vi ứng dụng phương pháp HPLC rộng, phân tích hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, chất phụ gia thực phẩm lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường… Phân loại Dựa vào khác chế tách chiết sử dụng HPLC, người ta chia HPLC thành loại: • Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography) • Sắc ký phân bố (partition chromatography) • Sắc ký ion (ion chromatography) • Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography) - Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) ứng dụng nhiều phân tích hợp chất từ không phân cực đến hợp chất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không lớn ( 7), silic mang pha tĩnh bị hòa tan (SiO2 thành silicat), hệ N giảm số nhánh ghép giảm, mũi rộng thời gian lưu giảm Kết phân tích độ xác Một cách khắc phục tượng dùng chất trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH (gọi tượng end-capping) Lúc ta có loại cột tương tác với chất phân tích có tính baz (cột LC-DB hãng SUPELCO) Hình Cấu trúc cột LC-DB Có cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng nhóm –OH mà không cần tương tác với thay nhóm methyl –Si(CH3)2-C18 nhóm lớn isopropyl để nhóm che nhóm –OH, cản trở tương tác nhóm –OH với chất cần phân tích Hình 5: Cấu trúc cột có gốc isopropyl Người ta ghép lên dây C18 số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực dây C18, làm cột có khả tách chọn lọc hợp chất phân cực mạnh (cột EPS – Expended Polar Selectivity) Ngoài sườn silica, thời gian gần người ta có sử dụng đến nhựa polystyren (Polystyren Reversed Phase – PRP) cho phép phân tích môi trường pH từ – 13 Cột dễ sử dụng môi trường acid baz mạnh Pha động sắc ký pha đảo Pha động sắc ký lỏng nói chung phải đạt yêu cầu sau: • Hòa tan mẫu phân tích • Phù hợp với đầu dò • Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh • Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao • Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade) Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý thuyết sử dụng nhiều dung môi kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) tetrahydrofuran (THF) đạt yêu cầu Nước dung môi cho vào dung môi hữu để giảm khả rửa giải Mỗi dung môi đặc trưng số vật lý số khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index), độ rửa giải (eluent strength)… Trong độ phân cực độ rửa giải có tác động lớn lên khả phân tách mũi sắc ký Bảng 1: Tính chất số pha động sắc ký lỏng Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách mũi sắc ký: số đĩa lý thuyết N, hệ số dung lượng K’, độ chọn lọc α Khi thay đổi thành phần pha động không đem lại kết tách mũi theo yêu cầu phải thay đổi chất pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đổi α Đôi phải thay đổi pha tĩnh Trong trình tách SKPĐ, tương tác hợp chất cần phân tích pha động phụ thuộc nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) tính baz (nhận proton) dung môi Thông thường pha động SKPĐ bao gồm hỗn hợp nước dung dịch đệm với nhiều dung môi hữu phân cực tan nước Nước dung môi phân cực nên không tương tác với nhóm alkyl không phân cực pha tĩnh, coi pha động yếu có tốc độ rửa giải chậm tất dung môi động SKPĐ Hỗn hợp nước dung môi hữu thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp suất cột Hình 6: Độ nhớt hỗn hợp nước dung môi hữu 25oC Việc lựa chọn dung môi thành phần dung môi pha động tối ưu hóa cho hợp chất cần phân tích Thông thường, người ta sử dụng hỗn hợp dung môi MeOH/nước trước, ACN/nước hay THF/nước Với hỗn hợp chất phân tích phức tạp có trộn lẫn dung môi hữu với nước Khi lựa chọn phải chọn hỗn hợp MeOH, ACN THF với nước có độ rửa giải tương đồng Thành phần pha động cố định suốt trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) thay đổi theo chương trình định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu tách tốt Một số đại lượng bản phân tích sắc ký 7.1 Hệ số phân bố Cân cấu tử X hệ sắc ký mô tả phương trình sau: Hằng số cân K cho cân gọi tỉ lệ phân bố hay số phân bố (partition coefficient) tính sau: Với CS : nồng độ cấu tử pha tĩnh CM : nồng độ cấu tử pha động Hệ số K tùy thuộc vào chất pha tĩnh, pha động chất phân tích 7.2 Thời gian lưu: tR : thời gian lưu cấu tử từ vào cột đến tách ngồi cột tO : thời gian chất lực với pha tĩnh qua cột; thời gian pha động từ đầu cột đến cuối cột gọi thời gian lưu chết tR' : thời gian lưu thật cấu tử Hình Thời gian lưu cấu tử phân tích 7.3 Hệ số dung lượng k’ k’ định nghĩa theo công thức sau: Với VS : thể tích pha tĩnh VM : thể tích pha động Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất nhanh, cột khả giữ chất lại Nếu k’ lớn (tR lớn): chất cột lâu, thời gian phân tích lâu, mũi có khả bị tù Khoảng k’ lý tưởng 2-5, phân tích hỗn hợp phức tạp, k’ chấp nhận khoảng rộng 1-20 7.4 Hiệu Hiệu hay số đĩa lý thuyết N cột đặc trưng cho khả tách mũi sắc ký cấu tử cột N lớn, hiệu tách cao Số đĩa lý thuyết đo sắc ký đồ Người ta chứng minh được: Hay Với W1/2 chiều rộng mũi sắc ký vị trí ½ chiều cao mũi (phút) W chiều rộng mũi sắc ký vị trí đáy mũi (phút) 7.5 Độ chọn lọc Đặc trưng cho khả tách hai chất cột 7.6 Độ phân giải: Đây đại lượng biểu thị rõ ba khả cột sắc ký: giải hấp, chọn lọc hiệu tách Nó xác định qua phương trình sau: Hay Với N xác định từ phương trình (2.5) (2.6) Ứng dụng sắc ký - Tách chất dẻo hóa - Tách phenol - Tách axit amin - Tách gluxit - Tách phức chất - Ưng dụng sắc ký lỏng cao áp hóa học lâm sàn - Phương pháp tách dựa kích thước hình học phân tử - Tách axit nucleic - Tách dược phẩm - Tách steroit - Tách vitamin - Tách chất bảo vệ thực phẩm - Tách chất bảo vệ thực vật: Hidrocacbon dầu mỏ, chất phụ gia cho nhiên liệu, hợp chất sunfonat hữu Ưu điểm sắc ký - Có thể phân tích đồng thời nhiểu hợp chất - Không cần làm bay mẫu - Độ phân giải cao nhờ trình tách cột - Độ nhạy cao nhờ đầu dò - Thể tích mẫu phân tích nhỏ [...]... hiệu năng tách càng cao Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ Người ta chứng minh được: Hay Với W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi (phút) W là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi (phút) 7.5 Độ chọn lọc Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột 7.6 Độ phân giải: Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn lọc và hiệu quả tách Nó được... chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng lâu, mũi có khả năng bị tù Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’ có thể chấp nhận trong khoảng rộng 1-20 7.4 Hiệu năng Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký của các cấu tử trên cột N càng lớn,... giải tương đồng Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn 7 Một số đại lượng cơ bản trong phân tích sắc ký 7.1 Hệ số phân bố Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình như sau: Hằng số cân bằng K cho cân bằng...Bảng 1: Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách các mũi sắc ký: số đĩa lý thuyết N, hệ số dung lượng K’, độ chọn lọc α Khi sự thay đổi thành phần pha động không đem lại kết quả tách mũi theo yêu cầu thì chúng ta phải thay đổi bản... tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích 7.2 Thời gian lưu: tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử Hình 7 Thời gian lưu của cấu tử phân tích 7.3... hấp, sự chọn lọc và hiệu quả tách Nó được xác định qua phương trình sau: Hay Với N được xác định từ phương trình (2.5) hoặc (2.6) 8 Ứng dụng sắc ký - Tách các chất dẻo hóa - Tách các phenol - Tách các axit amin - Tách gluxit - Tách các phức chất - Ưng dụng sắc ký lỏng cao áp trong hóa học lâm sàn - Phương pháp tách dựa trên kích thước hình học phân tử - Tách các axit nucleic - Tách các dược phẩm - Tách... bảo vệ thực phẩm - Tách các chất bảo vệ thực vật: Hidrocacbon trong dầu mỏ, chất phụ gia cho nhiên liệu, hợp chất sunfonat hữu cơ 9 Ưu điểm sắc ký - Có thể phân tích đồng thời nhiểu hợp chất - Không cần làm bay hơi mẫu - Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột - Độ nhạy cao nhờ đầu dò - Thể tích mẫu phân tích nhỏ ... tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của SKPĐ Hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp suất cột Hình 6: Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25oC Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối ưu hóa cho những hợp chất cần phân tích Thông thường, người ta sử dụng