1. Các loại tế bào vật chủ thu nhận: a. Tế bào nhân sơ: (vi khuẩn) Vật chủ nhân sơ : thường dùng là VK E.coli. +Chọn chúng làm tế bào chủ do chúng có ưu điểm như : sinh sản nhanh, dễ nuôi cấy và nhân giống, dễ chấp nhận nhiều loại vector. +Ngoài ra còn sử dụng 1 số VK: Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces. b. Tế bào nhân chuẩn: Vật chủ nhân chuẩn: Gồm các tế bào nấm men, động vật, thực vật, tảo. Ưu điểm: để nhân giống, có rất nhiều loại tế bào đột biến, vì nó là nhân chuẩn nên dễ dàng biểu hiện đầy đủ các protein của SV nhân chuẩn.
I Ôn tập công nghệ Chương I: V ẬT LI ỆU CHO CÔNG NGH Ệ GENE: Các loại tế bào vật chủ thu nhận: a Tế bào nhân sơ: (vi khuẩn) - Vật chủ nhân sơ : thường dùng VK E.coli +Chọn chúng làm tế bào chủ chúng có ưu điểm : sinh sản nhanh, dễ nuôi cấy nhân giống, dễ chấp nhận nhiều loại vector +Ngoài sử dụng số VK: Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces b Tế bào nhân chuẩn: - Vật chủ nhân chuẩn: Gồm tế bào nấm men, động vật, thực vật, tảo - Ưu điểm: để nhân giống, có nhiều loại tế bào đột biến, nhân chuẩn nên dễ dàng biểu đầy đủ protein SV nhân chuẩn Các hệ thống vector tạo dòng: Các bước Nội dung thực Bước Chọn xử lý vector Bước Xử lý DNA cần cho tạo dòng Bước Tạo vector tái tổ hợp từ thành phần Bước Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ vi khuẩn Bước Chọn lọc dòng vi khuẩn có chứa vector tái tổ hợp cần tìm hay gọi phát diện dòng cần tìm thư viện gen Vector: đoạn DNA, thường có dạng vòng dùng để chuyển đoạn DNA lạ vào tế bào chủ vi khuẩn, nấm men, tế bào động vật, tế bào thực vật….Vector dùng chủ yếu phương pháp chuyển gen hay phương pháp tạo dòng Bốn đặc tính vector: Đặc tính Nội dung Vector phải có khả xâm nhập vào tế bào chủ Vector phải tự chép tích cực bên tế bào chủ Vector phải cho phép chọn lọc dễ dàng dòng vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp Vector phải có khả đặc biệt tiếp nhận tốt gen lạ Thông thường có loại vector: Loại vector Vector plasmid Đặc tính - Thông thường gắn 8-9kb DNA lạ, tế bào vật chủ vi khuẩn Vector phage - Có thể gắn 15-30kb DNA lạ, xâm nhiễm tế bào vi khuẩn cao Vector cosmid (phối hợp plasmid - triển vi khuẩn phage lamda) Vector virus sinh vật nhân chuẩn SV40 động vật, CaMV thực vật - Adenovirus - Retrovirus - Herpesvirus - Vacciniavirus Có thể gắn tới 35-50 kb DNa lạ, phát - Có thể xâm nhiễm vào tế bào động vật, thực vật 5 Vector thể nhiễm sắc nấm men nhân - Có thể xâm nhập vào tế bào nấm men tạo - Đứa gen lạ có kích thước lớn 1501000kb Tùy theo DNA tạo dòng, người ta phân biệt loại thư viện gen: Thư vi ện Đặc tính gen Loại Thư viện - DNA tạo dòng toàn trình tự DNA gen gen - Cho phép nghiên cứu toàn trình tự mã hóa không mã hóa chứa gen Loại Thư viện - DNA tạo dòng tập hợp tất cDNA uất phát từ mRNA loạt tế bào chuyên biệt cDNA - Chỉ cho phép biểu gen mức độ phiên mã tế bào sinh vật a Vector plasmid: - Plasmid phân tử DNA vòng có vi khuẩn Plasmid mang hay nhiều gen thường gen có ích cho vật chủ - Plasmid có nhát DNa có nguồn gốc nhân lên -> nhân lên không phụ thuộc vào NST vi khuẩn - Một vài loại có khả nhân lên cách tự gài vào NST vi khuẩn -> episom - Kích thước plasmid khoảng từ 10-250 kb - Số lượng từ 1-50 - Có loại plasmid chính: + Plasmid F – có khả khởi động chuyển plasmid sang thể khác + Plasmid R – kháng lại kháng sinh + Plasmid col – mã hóa colicin phân tử protein giết vi khuẩn khác + Plasmid thoái hóa – cho phép vi khuẩn làm thoái hóa phân tử chuyển hóa không bình thường nhưu toluene, acid salicylic + Plasmid độc – gây bệnh lý cho vật chủ plasmid Ti sinh bệnh ung thư rễ mầm Các hệ plasmid: Các Các đặc tính quý Ví dụ hệ plasmid pSC101 Góp phân tạo dòng gen Eu pBR322 Kích thước 4363 bp Có gen kháng kháng sinh: - ApR – kháng ampicillin - TcR – kháng tetracylin Có 20 vị trí nhận biết RE Có 11 vị trí đưa gen DNA lạ xem vào số có vị trí nằm gen kháng kháng sinh nên khí gen DNA lạ xen vào làm tính kháng kháng sinh tương ứng Đây plasmid mạnh với đặc tính: - Kích thước nhỏ nên chép nhanh, tạo số lớn - Có mang polylinker, đoạn polynucleotide tổng hợp tương ứng với chuỗi v ị trí nhân biết RE Hiện có nhóm: - Nhóm pUC, 2600bp, mang gen ApR phần gen lacZ để dễ phát mẫu xen vào gen lacZ polylinker cho phép gắn xen vào gen lạ - Nhóm pSP Gemini, 3000bp mang gen ApRp polylinker, có promotor đặc trưng cho RNa polymerase bên polylinker thuận lợi cho phiên mã nhiều RNA để làm mẫu dò nghiên cứu - Nhóm pBluescript kết hợp tất ưu điểm b Vector thực khuẩn thể: - Thực khuẩn thể (phage) virus gây nhiễm vi khuẩn, có số tính chất: Cấu trúc đơn giản phần chủ yếu DNA (đôi RNA) mang nhiều gen, có gen nhân thực khuẩn thể bao bọc lớp áo bảo vệ capsid phân tử protein Quá trình gây nhiễm gồm giai đoạn: + Giai đoạn 1: tiểu phần thực khuẩn thể buộc vào phía bên vi khuẩn tiêm NST vào bên tế bào + Giai đoạn 2: DNA thực khuẩn thể tái sinh + Giai đoạn 3: gen khác thực khuẩn thể trực tiếp tổng hợp thành phần protein Những tiểu phần tập hợp lại giải phóng khỏi vi khuẩn Chỉ có thực khuẩn thể lamda M13 tìm thấy vai trò thực vector chọn dòng Tổ chức gen DNA lamda: + Là loại thực khuẩn điển hình có đầu đuôi DNa chứa cấu trúc đầu polyhedral đuôi -> buộc thực khuẩn thể vào bề mặt vi khuẩn để tiêm DNA vào tế bào + Kích thước 49 kb + Là chuỗi kép DNA có dạng thẳng vòng Tổ chức gen DNA M13: + Là thực khuẩn thể hình sợi, hoàn toàn khác gen lamda Chiều dài gồm 6407 nu DNA chuỗi đơn dạng vòng với vỏ có ba protein 15 protein Chu kỳ gây nhiễm đơn giản gen không gài vào DNA vật chủ M13 phương tiện tách dòng hấp dẫn vì: + Dạng tái DNA chuỗi kép gen M13 giống plasmid có xử lý mục đích thí nghiệm + Những dạng dễ dàng tạo từ nuôi cấy tế bào E.Coli đưa vào gây nhiễm + Những gen tách dòng với vector dựa M13 thu dạng DNA chuỗi đơn + Những chuỗi đơn dễ dàng để phân tích thứ tự dễ dạng gây biến biến dị invitro Các Các đặc ểm Ví dụ hệ vector phage Thế hệ Phage tự nhiên 48502bp lamda Thế hệ Phage EMBL Có polylinker tiếp nhận 15-20 kb DNA thích hợp Thích hợp cho vector thiết lập thư viện gen Thế hệ Lamda GEM Có vùng polylinker 11 12 Có promotor đặc trưng cho RNA polymerase để tổng hợp lượng lớn RNA, đểdò DNA thư viện gen Thế hệ c Lamda 11 Đây vector biểu có mang gen lacZ để 18-23 phát vector tái tổ hợp thư viện gen Các NST nhân tạo động vật có vú: (MAC) có nguồn gốc từ người TEL, CEN… Đưa MAC vào tế vào động vật có vú giữ ổn định tế bào d Các NST nhân tạo nấm men: Nấm men (YAC) cho phép tạo dòng đoạn DNA có kích thước 150- - 1000 kb (trung bình 350 kb) NST nhân tạo kết cấu có trình tự sau nhân đôi phân ly tốt: + TEL: trình tự đầu cuối NST + CEN: trình tự trung tâm NST + ARS: trình tự chép tự chủ e Các vector virus sv nhân thực: Virus phương tiện chọn dòng thể khác Có tiềm đưa vào tế bào động vật lẫn thực vật Hệ thống enzyme: Đặc điểm Nhóm I Nhóm II (phổ Nhóm III biến nhất) Điểm cắt Khả methyl Xa điểm nhận biết Nằm điểm Nằm điểm 1000bp nhận biết nhận biết Có Không Có ATP, Mg++, Mg++ Mg++ Mn++ Mg++, S-AdoMet hóa gốc Adenine Điều kiện để cắt S-AdoMet Cấu trúc Khác Giống Khác enzyme (số chuỗi polypeptide) Polymerase: tham gia tái DNA phiên mã tổng hợp RNA, sử dụng nhiều kỹ thuật di truyền - Gồm nhóm: + DNA polymerase -> xúc tác tổng hợp chuỗi polynucleotide theo chiều 5’-3’ + RNA polymerase -> tham gia tổng h ợp RNA - Taq polymerase: tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus suối nước nóng -> sử dụng PCR RAPD tổng hợp DNA điều kiện có dung dịch đệm, Mg+ primers - DNA polymerase I: có hoạt tính exonuclease 5’-3’ 3’-5’ -> xúc tác phản ứng thay sợi (chức exonclease 5’-3’ phân hủy sợi không làm khuôn polymerase tổng hợp mới) Chức exonuclease 5’-3’ có thểđược loại bỏ cách cắt enzyme để tạo đoạn Klenow Đoạn trì hoạt tính polymerase exonuclease 3’-5’ Đoạn Klenow sử dụng để chép phân tử DNA mạch đơn - Enzyme phiên mã ngược: DNA polymerase phụ thuộc RNA -> sản sinh sợi DNA từ sợi khuôn RNA, hoạt tính exonuclease kèm theo Chủ yếu sử dụng ddeer chép phân tử mRNA chuẩn bị khuôn cDNA để tách dòng, có tác động khuôn DNA - T4 DNA – polymerase: có nguồn gốc từ phage T4 ký sinh tế bào vi khuẩn Có hoạt tính giống đoạn Klenow sử dụng tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao hoạt tính exonuclease 3’-5’ mạnh T4 DNA-polymerase - Terminal transferase: trích ly từ tuyến ức bò, có chức xúc tác phản ứng gắn deoxynucleotide vào đầu 3’OH tự DNA -> dùng thêm đuôi polynucleotide để tạo đầu so le cho DNA kỹ thuật tạo dòng - Enzyme alkaline phosphatase: phân lập từ E.Coli hay ruột bò Có chức loại bỏ nhóm 5’ phosphate DNA, RNA nu tự -> sử dụng để loại bỏ 5’ phosphate DNA RNA trước đánh dấu phóng xạ 32P, sử dụng kỹ thuật tạo dòng - Enzyme T4 polynucleotide kinase: có nguồn gốc từ phage T4 ký sinh E.coli -> chức ngược lại với alkaline phosphatase -> xúc tác thêm vào 5’ phosphate DNA RNA -> sử dụng đểđánh dấu phóng xạ đầu 5’ DNA kỹ thuật xác định trình tự DNA phosphoryl hóa trình tự DNA nhóm phosphate đầu 5’ để chuẩn bị cho phản ứng nối kỹ thuật tạo dòng Enzyme nối DNA-ligase: xúc tác hình thành liên kết nối đoạn DNA RNA Sửa chữa mối liên kết phosphodiester b ị đứt gãy cách ngẫu nhiên tái DNa hay DNa tái tổ hợp -> sử dụng kỹ thuật tạo dòng - E.coli DNA-ligase: tách chiết từ E.coli -> xúc tác cho phản ứng nối trình tự DNa có đầu dính - T4 DNA-ligase: chiết từ phage T4 ký sinh E.coli -> xúc tác cho phản ứng nối trình tự có đầu -> sử dụng nhiều kỹ thuật tạo dòng - T4 RNA-ligase: chiết từ phage T4 ký sinh E.coli -> xúc tác cho phản ứng nối trình tự RNA liên kết phosphodiester -> thường sử dụng đểđánh dấu phóng xạ đầu 3’ RNA kỹ thuật sản xuất mẫu dò Enzyme nuclease: nhóm phân cắt DNA RNA - DNase – I: có khă cắt liên kết sau base pyrimidine DNA mạch đơn hay mạch kép -> sử dụng để loại DNA chế phẩm RNA protein, tạo điểm đứt kỹ thuật đánh dấu mẫu dò - Nuclease S1: tách chiết từ Aspergillus oryzae -> phân giải DNA mạch đơn, mạch kép -> sử dụng phân tích đặc điểm cấu trucsphaan tử lai DNA-RNA, loại bỏ đầu so le để tạo đầu bằng, loại bỏ nút vòng RNA phản ứng phiên mã ngược tạo cDNA - Exonuclease III: chiết từ E.coli -> xúc tác phản ứng phân giải nucleotide từ đầu 3’OH tự cảu DNA theo chiều 3’-5’ tạo nhữngvùng mạch đơn DNA mạch kép -> ứng dụng tạo cấu trúc mạch đơn vùng phân tử DNA - RNase A: có hoạt tính mạnh, chịu nhiệt độ 90oC 60p -> có khả cắt liên kết phosphodiester sau base pyrimidine RNA -> đưuọc sử dụng để loại bỏ RNA chế phẩm DNA protein, loại bỏ đoạn không bắt cặp RNA - RNase H: khả loại bỏ RNA phân tử lai RNA-DNA -> thường sử dụng để loại bỏ RNA sau phản ứng phiên mã ngược để tiếp tục tổng hợp mạch thứ CANA tạo DNA mạch kép Chương II: T Ạ O DÒNG GENE II - Tạo dòng gen kỹ thuật để nhân đoạn DNA - Nó thực phương pháp khác nhau: + Dựa vào tế bào (cell based) + Sử dụng phương pháp PCR - Một vector cần thiết để mang đoạn DNA quan tâm vào tế bào chủ - Kỹ thuật bước hầu hết thí nghiệm công nghệ gen Nguyên lý tạo dòng: - Bước 1: tổng hợp đoạn gen cần chèn - Bước 2: cắt giới hạn - Bước 3: kết nối - Bước biến nạp Quy trình chung: - Bước 1: xác định, phân lập, xử lý đoạn gen DNA cần tạo dòng, chọn xử lý vector - Bước 2: chèn đoạn gen mục tiêu vào vector thích hợp tạo vector tái tổ hợp - Bước 3: chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ thích hợp - Bước 4: chọn lọc tế bào chủ chuyển vector tái tổ hợp Mục đích tạo dòng gen: - Thiết lập ngân hàng gen, - Thiết lập ngân hàng cDNA, - Sản xuất protein, enzyme, - Sản xuất vaccine, - Sản xuất kháng sinh Ưu điểm: - Lưu trữ hệ gene cần giữ - Vừa nhân gen vừa tạo dòng - Có thể nhân gen ta chưa biết rõ trình tự (nhưng PCR không PCR cần phải biết rõ trình tự để tạo mồi đặc hiệu) Nhược điểm: phức tạp, tốn kém, nhiều kỹ thuật, lâu dài Vì cần vector mang gen vào tế bào chủ? Nếu gen đưa vào trực tiếp -> nhận biết lạ => bị tiêu diệt gần hết Nếu không bị tiêu diệt nhân lên hệ thống hỗ trợ => tách dòng Phân lập gen lạ DNA lạ cần tạo dòng: - Cắt DNA lạ tế bào cho enzyme giới hạn - Phân lập đoạn DNa cần tạo dòng - Trong trường hợp tạo dòng gen chưa biết tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo dòng dựa vào dự đoán cấu trúc protein gen mã hóa tổng hợp cDNA từ mRNA - Tạo đầu dính cần thiết Chọn xử lý vector: Nguyên tắc chọn vector: - Dựa vào kích thước chất DNa cần tách dòng làm chọn vector (kích thước đoạn chèn (insert size) -> ngắn (,15kb) -> chọn thoải mái vector, dài -> chọn hệ thống vector khác) - Lưu ý tương đồng v ị trí cắt đặc hiệu enzyme giới hạn đoạn DNa vector tách dòng (tách dòng plasmid v ị trí cắt giới hạn) - Vector tách dòng phải thích hợp với tế bào chủ, có khả tái tế bào chủ, tạo số lượng lớn, không gây ảnh hưởng tới tế bào chủ (đối với vi khuẩn hầu hết plasmid, số nấm men ->plasmid, động vật, thực vật -> chọn hệ thống vector khác) - Gen thị vector tách dòng dễ nhận biết tốt (chọn plasmid có số lượng lớn) (gen ch ỉ thị: kháng kháng sinh, ch ỉ th ị màu… ) - Vector tác dòng phải có hiệu tách dòng cao (tạo tỷ lrrj vector tái tổ hợp cao) Xử lý vector: cắt vector enzyme cắt hạn chế loại với enzyme cắt DNA nói (để tạo vết cắt giống nhau, thuận tiện cho việc nối ghép sau này) Khử nhóm phosphat enzyme alkanline phosphotase để tránh hai đầu vector đóng kín trở lại Chèn đoạn gen mục tiêu vào vector: - Vector insert cần tạo dòng trộn chung theo tỷ lệ định - Việc tạo DNA tái tổ hợp cách ghép DNA lạ vào vector cắt enzyme cắt hạn chế loại II, đó, chúng ghép đôi đầu dính lại với nhờ bắt cặp bổ sung - Một phản ứng ghép nối xảy với có mặt enzyme DNA ligase E Coli phage T4 để hoàn ch ỉnh phân tử lai Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ: - Công đoạn nhằm mục đích sử dụng máy tế bào chủ để chép vector tái tổ hợp thành số lượng lớn Việc chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn tức làm cho vi khuẩn trở thành khả biến, nghĩa có khả thấm vector tái tổ hợp Sự thấm xảy cách tự nhiên cảm ứng Tuy nhiên, phụ thuộc vào loại plasmid sử dụng làm vector phụ thuộc vào định vị vùng cài lắp chứa bên vector mà người nghiên cứu chọn phương pháp biến nạp tải nạp Biến nạp: tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception), không cần tiếp xúc hai tế bào nhân tố trung gian phage virus Biến nạp thực với vector chuyển gen plasmid - Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ thích hợp.( qua thành màng tế bào Trong tự nhiên có DNA vào tế bào vi khuẩn nhiên xác suất thấp => cần có vector cần xử lý tế bào chủ) - Nếu DNA đưa vào DNA virus gọi lây nhiễm - Những tế bào chủ có khả thu nhận DNA qua xử lý lý học hóa học gọi tế vào có lực (khả nạp) Quy trình biến nạp: - Ống nghiệm có sẵn competent xell -> đưa plasmid vào ống - Sốc nhiệt (42oC) -> cấu trúc tế bào bị ảnh hưởng (thời gian ngắn) - Đặt lại 37oC 30p thêm canh thang nuôi vi khuẩn (lúc DNA vào tế bào) - Đổ lên đĩa thạch chuẩn bị sẵn (môi trường phân lập) + chất chọn lọc (kháng sinh,….) -> đưa vào tủ ấm ủ (sau đông thạch khô môi trường Không cần trang ch ỉ cần lắc nhẹ) -> khuẩn lạc mọc sau 16h - Xuất tế bào có chứa plasmid (đa số) -> loại tế bào không chứa plasmid => chọn lọc plasmid mang DNA tái tổ hợp Dùng biến nạp nhân tạo có kiểm soát -> không dễ bị đột biến sốc nhiệt Có nhiều phương pháp biến nạp hóa biến nạp, điện biến nạp, biến nạp tế bào trần, phương pháp bắn gen phương pháp vi tiêm Tải nạp tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception) qua nhân tố trung gian virus Tải nạp thực với vector chuyển gen có nguồn gốc virus phage, cosmid, Phát dòng cần tìm: Công việc kiểm tra diện gen mong muốn Việc chọn lựa chủng ý muốn không đơn giản, cách tiến hành thí nghiệm hỗn hợp không đồng nên dòng vi khuẩn mọc lên theo ba khả - Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp, - Tế bào nhận plasmid gen lạ, - Tế bào vi khuẩn nhận plasmid tái tổ hợp Kiểm tra thu nhận sản phẩm gen tái tổ hợp - Tùy trường hợp cụ thể mà người nghiên cứu đưa phương pháp kiểm tra thu hồi sản phẩm gen tái tổ hợp Nếu mục đích thiết lập ngân hàng cDNA, ta phải tiến hành bước sau: Đầu tiên người ta phải tách plasmid tái tổ hợp khỏi d ịch nuôi cấy, sau đó, cắt plasmid tái tổ hợp enzyme RE loại II thu hai băng DNA, có độ dài khung vector, băng khác có độ dài tương ứng cDNA Cách kiểm tra lại cDNA cắt cách điện di gel agaroza 0,8% kiểm tra lại độ dài băng cDNA thu Những đoạn có kích thước khác di chuyển khoảng cách khác gel - Nếu sản phẩm gen tái tổ hợp protein, enzyme, hormone, vaccine, kháng sinh, người ta thu nhận sản phẩm phương pháp chiết tách lắng lọc ly tâm kết tủa phân đoạn trao đổi ion Một số phương pháp xác định dòng cần tìm: Phương pháp chọn lọc trực tiếp: - Gen đích gen kháng đặc hiệu với loại kháng sinh - Nguyên tắc: sử dụng gen mã hóa cho enzyme tổng hợp khác nhau: phân hủy chất, chủng mang gen mã hóa cho enzyme mà phân hủy chất sống => chọn lọc trực tiếp Phương pháp lai acid nucleid: - Khái niệm đầu dò: mảnh DNA đánh dấu, có khả nhận biết chuỗi DNA RNA đồng đẳng qua lai hóa - Đặc điểm đầu dò: Là đoạn axit nucleic (DNA RNA) sợi đơn Đầu dò phải bổ sung bazơ nitơ, đối song song với đoạn axit nucleic cần nhận biết Đầu dò phải so mốc được, đầu đánh dấu phóng xạ - Các loại đầu dò: cDNA làm đầu dò cực tốt, ra, mRNA oligonucleotide làm đầu dò Nếu chuỗi DNA chưa biết trình tự, người ta phải tinh lượng nhỏ protein tương ứng với DNA nghiên cứu từ tổng hợp đầu dò Còn phần DNA phải so mốc biết công việc dễ dàng để tổng hợp đầu dò - Nguyên tắc: Dựa vào khả biến tính nhiệt độ tăng hồi tính hạ nhiệt độ từ từ DNA Khi tăng nhiệt độ DNA lên nhiệt độ sinh lý (thường khoảng 80 đến 95°C), hai sợi đơn DNA tách rời liên kết hydro bị đứt Khi hạ nhiệt độ từ từ khối DNA biến tính với điều kiện thích hợp khác, mạch đơn bắt cặp trở lại Sự bắt cặp ch ỉ xảy hai trình tự DNA hoàn toàn bổ sung cho Tính đặc hiệu cực lớn phản ứng lai cho phép trình tự mạch đơn tìm gặp mạch bổ sung với nó, chúng nằm hàng triệu trình tự DNA RNA khác Có thể dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu để phát đoạn lai - Cách tiến hành: Chuẩn b ị mẫu (đầu) dò đánh dấu đồng vị phóng xạ hóa chất Biến tính dòng cần tìm dạng sợi, sau hạ nhiệt độ từ từ, sợi đơn tương đồng bắt cặp với Sự bắt cặp xảy DNA DNA, RNA DNA, RNA RNA Phương pháp sử dụng kháng thể: - Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng đặc trưng số protein kháng thể mà nhận biết qua phản ứng đặc trưng phản ứng tạo màu, phản ứng kết tủa - Cách tiến hành: Chọn kháng thể đặc trưng cho protein (thuốc thử cho protein) Tách protein biểu trình tạo dòng Ủ protein với kháng thểđặc trưng Sau tiến hành nhận biết thông qua dấu hiệu phản ứng đặc trưng protein kháng thể - Ứng dụng: Chủ yếu sử dụng y học v ới hai yêu cầu sau: DNA cần nghiên cứu gắn vào vector phải biểu protein tạo dòng đồng thời, vector tạo dòng phải vector biểu (ví dụ vector λgt11) Protein biểu cần phải có kháng thểđặc trưng Phương pháp phát hoạt tính xen đoạn: - Nguyên tắc: Dựa vào khả kháng thuốc vi khuẩn mang vector tái tổ hợp chúng nuôi cấy môi trường kháng sinh - Phạm vi sử dụng: Phương pháp dùng cho vector có từ hai gen kháng thuốc trở lên, ví dụ vector pBR 322 Trong plasmid pBR 322 có hai gen kháng thuốc AmPR TetR Trên gen có điểm nhận biết RE nơi cài đặt DNA lạ Khi gắn DNA lạ vào hai gen nói gen nhận đoạn cài khả kháng thuốc Quan sát khuẩn lạc bị gen kháng thuốc, chứng tỏ khuẩn lạc có chứa gen cần tạo dòng Ưu điểm: tốn so với phương pháp lai Phương pháp phát thay đổi kiểu hình: - Nguyên tắc: Dựa vào thay đổi màu sắc khuẩn lạc, chứng tỏ rằng, khuẩn lạc có chứa gen lạ - Cách tiến hành: Chuẩn b ị hai mẫu thử nghiệm mà plasmid tạo dòng có chứa gen lacZ (ví dụ dãy pUC), mẫu để so sánh mẫu để cài DNA lạ vào gen lacZ Sau đó, nuôi cấy hai mẫu môi trường có chất cảm ứng X-Gal (5 brom-4chloro-3indolyl D-galactopynoside) Chất cảm ứng bị phân hủy enzyme β-galactosidase tạo galactose X (dẫn xuất indol), môi trường, dẫn xuất bị oxy hóa cho màu xanh đậm - Qua quan sát, ta thấy plasmid không chứa gen lạ cho khuẩn lạc màu xanh gen lacZ tổng hợp enzyme β-galactosidase Còn plasmid thứ cho khuẩn lạc màu trắng, điều chứng tỏ chứa DNA lạ cài gen lacZ chọn khuẩn lạc màu trắng Các bước khẳng định gen mục tiêu tạo dòng: - Chọn nuôi cấy tế bào mang plasmid tái tổ hợp - Tách chiết tinh DNA plasmid - Phân tích pp PCR, cắt RE giải trình tự - Điện di sản phẩm PCR phản ứng cắt RE [...]... hệ gene cần giữ - Vừa nhân gen và vừa tạo dòng - Có thể nhân những gen ta chưa biết rõ trình tự (nhưng đối với PCR thì không vì PCR cần phải biết rõ trình tự để có thể tạo mồi đặc hiệu) Nhược điểm: phức tạp, tốn kém, nhiều kỹ thuật, lâu dài Vì sao cần vector mang gen vào tế bào chủ? Nếu gen đưa vào trực tiếp -> nhận biết là lạ => bị tiêu diệt gần hết Nếu không bị tiêu diệt thì cũng sẽ không...Chương II: T Ạ O DÒNG GENE II - Tạo dòng gen là kỹ thuật để nhân những đoạn DNA - Nó có thể được thực hiện bởi 2 phương pháp khác nhau: + Dựa vào tế bào (cell based) + Sử dụng phương pháp PCR - Một vector cần thiết để mang đoạn DNA quan tâm vào tế bào chủ - Kỹ thuật này là bước đầu tiên của hầu hết các thí nghiệm công nghệ gen Nguyên lý tạo dòng: - Bước 1: tổng hợp đoạn gen cần chèn - Bước 2:... cho vector có từ hai gen kháng thuốc trở lên, ví dụ như vector pBR 322 Trong plasmid pBR 322 có hai gen kháng thuốc AmPR và TetR Trên các gen này có những điểm nhận biết của các RE nơi cài đặt DNA lạ Khi gắn DNA lạ vào một trong hai gen nói trên thì gen nhận đoạn cài mất khả năng kháng thuốc Quan sát những khuẩn lạc bị mất gen kháng thuốc, chứng tỏ những khuẩn lạc đó có chứa gen cần tạo dòng Ưu... muốn Việc chọn lựa những chủng như ý muốn là không đơn giản, vì cách tiến hành thí nghiệm trong một hỗn hợp không đồng nhất nên các dòng vi khuẩn có thể mọc lên theo ba khả năng - Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp, - Tế bào nhận plasmid nhưng không có gen lạ, - Tế bào vi khuẩn nhận được plasmid tái tổ hợp Kiểm tra và thu nhận sản phẩm của gen tái tổ hợp - Tùy từng trường hợp cụ thể mà... tiêu diệt thì cũng sẽ không thể nhân lên được vì không có hệ thống hỗ trợ => không thể tách dòng 1 Phân lập các gen lạ hoặc DNA lạ cần tạo dòng: - Cắt DNA lạ của tế bào cho bằng enzyme giới hạn - Phân lập các đoạn DNa cần tạo dòng - Trong trường hợp tạo dòng 1 gen chưa biết có thể tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo dòng dựa vào dự đoán cấu trúc protein do gen mã hóa hoặc tổng hợp cDNA từ mRNA - Tạo đầu... tế bào trần, phương pháp bắn gen và phương pháp vi tiêm Tải nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception) qua nhân tố trung gian là virus Tải nạp được thực hiện với vector chuyển gen có nguồn gốc là virus như phage, cosmid, 5 Phát hiện dòng cần tìm: Công việc tiếp theo là kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn Việc chọn lựa... trường, dẫn xuất này bị oxy hóa cho màu xanh đậm - Qua quan sát, ta thấy plasmid không chứa gen lạ cho khuẩn lạc màu xanh do gen lacZ tổng hợp enzyme β-galactosidase Còn plasmid thứ 2 cho khuẩn lạc màu trắng, điều đó chứng tỏ nó chứa DNA lạ được cài trong gen lacZ và chọn những khuẩn lạc màu trắng 6 Các bước khẳng định gen mục tiêu đã được tạo dòng: - Chọn và nuôi cấy tế bào mang plasmid tái tổ hợp -... nhau trên gel - Nếu sản phẩm của gen tái tổ hợp là protein, enzyme, hormone, vaccine, kháng sinh, người ta có thể thu nhận sản phẩm bằng phương pháp chiết tách lắng lọc ly tâm kết tủa phân đoạn hoặc trao đổi ion Một số phương pháp xác định dòng cần tìm: Phương pháp chọn lọc trực tiếp: - Gen đích là gen kháng đặc hiệu với một loại kháng sinh - Nguyên tắc: sử dụng gen mã hóa cho các enzyme tổng hợp... chung: - Bước 1: xác định, phân lập, xử lý đoạn gen hoặc DNA cần được tạo dòng, chọn và xử lý vector - Bước 2: chèn đoạn gen mục tiêu vào vector thích hợp tạo vector tái tổ hợp - Bước 3: chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ thích hợp - Bước 4: chọn lọc các tế bào chủ đã được chuyển vector tái tổ hợp Mục đích của tạo dòng gen: - Thiết lập ngân hàng bộ gen, - Thiết lập ngân hàng cDNA, - Sản xuất protein,... lập) + chất chọn lọc (kháng sinh,….) -> đưa vào tủ ấm ủ (sau khi đông thạch và khô môi trường Không cần trang ch ỉ cần lắc nhẹ) -> khuẩn lạc sẽ mọc sau 16h - Xuất hiện các tế bào có chứa plasmid (đa số) -> loại được các tế bào không chứa plasmid => chọn lọc được các plasmid mang DNA tái tổ hợp Dùng biến nạp nhân tạo có kiểm soát -> không dễ bị đột biến khi sốc nhiệt Có nhiều phương pháp biến nạp