KỸ THUẬT REAL time PCR

Realtime PCR là một cải biên của phương pháp PCR dựa trên chức năng 5’3’ polymerase của Taq DNA polymerase do Holland và cộng sự công bố năm 1991. Trong phản ứng realtime PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ...) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX ...). Tác nhân liên kết với mạch đôi DNA. Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của các sản phẩm DNA mạch đôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với DNA mạch đôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa được tạo ra này và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn (so với trạng thái tự do trong dung dịch). Loại tác nhân huỳnh quang này có thể sử dụng được cho mọi trình tự đích nên chi phí sẽ thấp; nhưng độ đặc hiệu của sản phẩm phải được kiểm tra chặt chẽ thông qua một bước phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc – phân tích đường cong nóng chảy (Melting curve analysis).

Trang 1

KỸ THUẬT REAL-TIME PCR

TÓM TẮT

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả nhân bản DNA đích trong ống nghiệm, thành hàng tỷ bản sao, được hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, do đặc điểm này nên người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thao tác sau

đó để phát hiện sản phẩm nhân bản (điện di sản phẩm PCR trên gel agarose hoặc lai với các đoạn dò đặc hiệu trên màng, giếng, …)

KỸ THUẬT REAL-TIME PCR

Real-time PCR là một cải biên của phương pháp PCR dựa trên chức năng 5’-3’ polymerase của Taq DNA polymerase do Holland và cộng sự công bố năm 1991 Trong phản ứng real-time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX )

Tác nhân liên kết với mạch đôi DNA Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của các sản phẩm DNA mạch đôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với DNA mạch đôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa được tạo ra này và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn (so với trạng thái tự do trong dung dịch) Loại tác nhân huỳnh quang này có thể sử dụng được cho mọi trình tự đích nên chi phí sẽ thấp; nhưng độ đặc hiệu của sản phẩm phải được kiểm tra chặt chẽ thông qua một bước phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc – phân tích đường cong nóng chảy (Melting curve analysis)

Hình 1 Phương pháp real-time PCR với tác nhân phát huỳnh quang liên kết với mạch đôi DNA (EvaGreen)

Tác tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu rất đa dạng như FAM, TAMRA, Texas Red, Cy3, Cy5, …, được sử dụng với nhiều loại mẫu dò khác nhau:

(1) Mẫu dò lai (hybridization probe): gồm hai mẫu dò có vị trí bắt cặp gần nhau trên

mạch khuôn và một hoặc hai mồi (primer) Các mồi cho phép nhân bản trình tự đích trong phản ứng PCR Mẫu dò phía đầu có mang nhóm hùynh quang ở đầu 3’ còn mẫu

dò phía đuôi mang nhóm huỳnh quang đầu 5’ Khi 2 mẫu dò bắt cặp trên cùng một

Trang 2

trình tự DNA, nhóm hùynh quang “cho” (donor dye) và nhóm “nhận” (acceptor dye) trên 2 mẫu dò sẽ gây ra hiệu ứng FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Hiệu ứng này được ghi nhận mỗi khi có sự bắt cặp của mẫu dò 5’ và mẫu dò 3’ lên những trình tự mới được tạo thành trong quá trình PCR

Hình 2 Phương pháp real-time PCR với mẫu dò lai

(2) Mẫu dò thủy giải (Hydrolysis probe) với ví dụ thông dụng nhất là TaqMan probe

(còn gọi là kỹ thuật 5’ nuclease) Mẫu dò được đánh dấu đầu 5’ bằng nhóm phát huỳnh quang (reporter dye), và đầu 3’ bằng nhóm dập tắt huỳnh quang (quencher dye) Nhóm “dập” sẽ ngăn sự phát huỳnh quang của nhóm “phát” khi mẫu dò ở trạng thái nguyên vẹn Trong quá trình tổng hợp mạch mới, hoạt tính 5’ exonuclease của Taq polymerase sẽ cắt rời nhóm “phát” khỏi mẫu dò, khiến nó không còn chịu tác động của nhóm “dập” Lúc đó nhóm “phát” sẽ phát tín hiệu huỳnh quang và thiết bị tự động được ghi nhận

Trang 3

Hình 3 Phương pháp real-time PCR với mẫu dò TaqMan

(3) Mẫu dò dạng “kẹp tóc” (hairpin probe) điển hình như “Molecular beacon”: bao

gồm một trình tự bổ sung đặc hiệu với trình tự đích nằm giữa hai trình tự lặp lại đảo ngược Các nhóm “phát” (reporter) và “dập” (quencher) được gắn vào hai đầu mút của mẫu dò Do đó, sự phát huỳnh quang không xảy ra khi mẫu dò ở dạng tự do (cấu hình

“kẹp tóc”) trong dung dịch Khi mẫu dò bắt cặp với trình tự đích, nó sẽ duỗi dài khiến hai nhóm “phát” và “dập” tách xa Lúc đó, tín hiệu huỳnh quang được phát ra và ghi nhận

Hình 4 Phương pháp real-time với mẫu dò “kẹp tóc” (molecular beacon probe)

Trong mọi trường hợp vừa nêu, cường độ tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với hàm lượng sản phẩm đích đang được nhân bản trong phản ứng Các tín hiệu huỳnh quang

Trang 4

phát ra sẽ được các đầu dò của máy luân nhiệt real-time PCR thu nhận và xử lý Khi cường độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu vựơt qua đường tín hiệu huỳnh quang nền (base line) của phản ứng thì mẫu được xem là dương tính và người ta lấy thời điểm vượt qua đó (biểu hiện qua giá trị chu kỳ ngưỡng – Ct, Cycle Threshhold) để so sánh với một đường cong chuẩn (standard curve) đã biết để suy ra nồng độ trình tự DNA đích trong mẫu thử nghiệm ban đầu Đường cong chuẩn được xây dựng từ chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn có chứa sản phẩm đích đã biết trước nồng độ

Định lượng nucleic acid là ứng dụng mạnh nhất của phương pháp này Trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh, kỹ thuật real-time PCR được ứng dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng các tác nhân gây bệnh ở người như virus, vi khuẩn, nấm phục vụ cho chẩn đoán

và theo dõi điều trị Nhiều bộ kit thương mại hóa sử dụng mẫu dò thủy giải (Roche COBAS Taqman HBV test, Artus RealArt HBV PCR), mẫu dò lai (Roche Diagnostics), mẫu dò dạng “kẹp tóc” (molecular beacon) (RealArt kit – Cobett Research), HCV Quantitation ASR (Abbott)

VẤN ĐỀ KỸ THUẬT CƠ BẢN CỦA REAL-TIME PCR

Biểu đồ nhân bản của real-time PCR

Hình 5 Đường biểu diễn nhân bản ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được ánh sang kích thích vào mỗi chu kì nhiệt

Đường nền (baseline): được định nghĩa là số chu kỳ PCR trong đó tín hiệu huỳnh

quang đặc hiệu tích lũy dần nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của thiết bị Theo mặc định, đường nền được xác lập trong khoảng chu kỳ 3 đến 15 và có thể được thay đổi

Trang 5

Ngưỡng (threshold): là một giá trị huỳnh quang được xác lập một cách tùy ý, dựa trên

đường nền Một tín hiệu huỳnh quang phát hiện trên ngưỡng được xem là tín hiệu đặc hiệu, và sẽ được sử dụng để xác định chu kỳ ngưỡng Ngưỡng được thiết lập theo từng thí nghiệm và nó thường cắt tất cả các đường tín hiệu đặc hiệu trong pha nhân bản cấp

số mũ (exponential phase)

Chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct): được định nghĩa là số chu kỳ PCR mà ở đó tín

hiệu huỳnh quang đặc hiệu lớn hơn ngưỡng Nói khác đi, đó là số chu kỳ PCR ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền Đây là nguyên lý cơ bản của real-time PCR và là yếu tố quyết định tính chính xác và lặp lại của kết quả Số trình tự mục tiêu trong mẫu ban đầu càng cao thì số chu kỳ cần để vượt ngưỡng phát hiện càng nhỏ, nghĩa là giá trị

Ct càng thấp

Đường chuẩn của real-time PCR

Một đường chuẩn được xây dựng với các nồng độ (pha loãng 5 đến 10 lần) của một trình tự DNA chứng đã biết và các giá trị Ct tương ứng Để định lượng trình tự mục tiêu ban đầu có trong mẫu, người ta đo giá trị Ct của mẫu; giá trị này lắp vào đường chuẩn sẽ cho được nồng độ trình tự mục tiêu có trong mẫu ban đầu Đây là phương pháp thường được sử dụng để định lượng hàm lượng vật liệu di truyền của tác nhân gây bệnh hiện diện trong bệnh phẩm

Hình 6: Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa số lượng DNA đích và chu kỳ ngưỡng tương ứng Trong biểu đồ trên này, E2, E4, E6, E8 là các ống phản ứng chứa mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ, B4, B5 là ống phản ứng chứa mẫu thử cần xác định nồng độ

Đường chuẩn (standard curve): thể hiện mối quan hệ giữa chu kì ngưỡng với số

lượng DNA đích ban đầu có trong mẫu chuẩn Trên đường chuẩn này, trục tung Y là

Ct, trục hoành X là số lượng DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn Do các mẫu chuẩn thường được pha cách nhau theo hệ số pha loãng 10 nên số lượng bản DNA đích trong các mẫu chuẩn được biểu thị bằng log10 của số lượng này Do vậy, trị số 2,

Trang 6

4, 6, và 8 trên trục X tương ứng với các số lượng bản đích 102, 104, 106, 108 bản sao trong ống phản ứng

Hệ số tương quan (R2): Đánh giá độ chính xác của thao tác hút dung dịch mẫu chuẩn

(pipetting) có đúng thể tích mong muốn hay không Trị số R2 phải đạt ≥ 0.99 có nghĩa

là đường biểu diễn chuẩn phải đạt tuyến tính cao

Hiệu suất phản ứng PCR (E%): Hiệu suất phản ứng PCR có thể ảnh hưởng đến chu

kỳ ngưỡng Một khi PCR đạt hiệu suất lý tưởng, thì cứ sau mỗi chu kì nhiệt, cường độ huỳnh quang trong một ống phản ứng phải tăng gấp đôi, khi đó hiệu suất nhân bản là 100% Hiệu suất PCR thực tế chấp nhận được trong khoảng 90%-110% Một loạt mẫu chuẩn với nồng độ khác nhau được nhân bản dưới điều kiện hiệu suất thấp sẽ tạo ra đường chuẩn với hệ số góc khác với được nhân bản dưới điều kiện hiệu suất cao Trong hình 7, hai mẫu (X và Y) được nhân bản dưới hai điều kiện hiệu suất thấp và cao cho những giá trị Ct khác nhau với những nồng độ mạch khuôn giống nhau Trong

ví dụ này, mặc dù điều kiện hiệu suất cao (đường màu xanh nước biển) cho giá trị Ct trễ hơn ở nồng độ mạch đích cao, nó thể hiện độ nhạy tốt hơn ở những mẫu nồng độ thấp Hiệu suất PCR phụ thuộc vào kĩ thuật thực hiện, loại hóa chất (master mix) được

sử dụng và chất lượng của mẫu sau tách chiết

Hình 7: Biến thiên của giá trị Ct với hiệu suất PCR khác nhau

Đường màu xanh nước biển có hiệu suất 100% (slope -3.3) Đường màu xanh lá có hiệu suất 78% (slope -4)

ỨNG DỤNG CỦA REAL-TIME PCR

Kỹ thuật real-time PCR được ứng dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng các tác nhân gây bệnh ở người như virus, vi khuẩn, nấm phục vụ cho chẩn đoán và theo dõi điều trị

Trang 7

Phương pháp real-time PCR với chất phát huỳnh quang SYBR Green phát hiện TB: Trong bệnh phẩm sử dụng một cặp mồi được thiết kế để nhân bản vùng gene IS6110 IS6110 là những trình tự gắn chèn đặc trưng cho các chủng vi khuẩn lao (Mycobacterium complex) và hiện diện với số lượng lớn trong DNA bộ gene của Mycobacterium và được xem là đối tượng thích hợp nhất để phát hiện vi khuẩn lao Mẫu xét nghiệm được kết luận là dương tính khi kết quả phân tích “đường cong nóng chảy” cho thấy Tm của sản phẩm PCR thu được tương ứng với Tm của vùng gene IS6110 được nhân bản

Kit HBV định lượng được xây dựng dựa trên kỹ thuật real-time PCR, sử dụng mẫu dò Taqman đặc hiệu cho DNA HBV được đánh dấu với tác nhân phát huỳnh quang Primer (mồi) và mẫu dò (probe) Taqman được thiết kế trong vùng gene S của HBV Ở các mẫu HBV dương tính, cường độ tín hiệu huỳnh quang tăng dần trong quá trình nhân bản được ghi nhận theo thời gian và phản ánh số lượng trình tự DNA tạo ra Song song với các mẫu cần định lượng, một phổ nồng độ đã biết của trình tự mục tiêu được dùng để xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn này là cơ sở cho việc định lượng DNA HBV trong mẫu bệnh Kết quả định lượng được đọc trên máy real-time PCR

Real-time PCR còn được dùng trong phát hiện HCV, genotype HCV, phát hiện H.pylori, chẩn đoán sớm HIV ở trẻ em, xác định type của virus sốt xuất huyết Dengue, phát hiện thai nhi nhiễm Rubella… Những năm trở lại đây, kỹ thuật real-time PCR được ứng dụng trong nghiên cứu thủy sản nhiều như định lượng Taura Syndrome Virus (Tang và cộng sự, 2003), phát triển độ đặc hiệu và độ nhạy trong việc xác định Taura Syndrome Virus và Yellow Head Virus (Mouillesseaux và cộng sự, 2003), định tính và định lượng IHHNV và WSSV trên tôm (Dhar và cộng sự, 2001), định lượng Streptococcus agalactiae trên cá (Ke và cộng sự, 2000)…

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Arya M., Shergill I.S., Williamson M., Gommersall L., Arya N., & Patel H.R.H

2005 Basic principles of real-time quantitative PCR Expert Rev Mol Diagn., 5:1-11 [2] Bustin S.A., & Nolan T 2004 Pitfalls of quantitative real-time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Joiurnal of Biomolecular Techniques, 15:155-166

[3] Hunt M Real time PCR Microbiology and Immunology On-line

[4] Schweitzer B., & Kingsmore S 2001 Combining nucleic acid amplification and detection Current Opinion in Biotechnology, 12: 21-27

Realtime PCR hay kỹ thuật Real time PCR là gì?

PCR là phản ứng khuếch đại DNA (polymerase chain reaction) Trong kỹ thuật PCR, sau khi khuếch đại đoạn DNA đích, người làm thí nghiệm phải tiếp tục làm một số bước để đọc kết quả và xác định có sản phẩm khuếch đại mong muốn hay không bằng

kỹ thuật điện di (sử dụng máy điện di), hoặc sử dụng thí nghiệm lai với các mẫu dò đặc hiệu để xem sản phẩm khuếch đại có chứa sản phẩm mong muốn hay không Kỹ thuật PCR mà cần phải có giai đoạn phân tích sau khi khuếch đại còn gọi là kỹ thuật PCR cổ điển bằng việc sử dụng máy PCR, hay còn gọi là máy luân nhiệt

Realtime PCR (Real time PCR) là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR, chính vì vậy mà được gọi là

Trang 8

real-time: thời gian thực, và do đặc điểm này mà với kỹ thuật Realtime PCR, người làm thí nghiệm không cần phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc các sản phẩm khuếch đại Với kỹ thuật real-time PCR sử dụng thiết bị phòng thí nghiệm là máy realtime pcr, sản phẩm cuối cùng của phản ứng được hiển thị ngay sau khi phản ứng khuếch đại hoàn tất Vì vậy có thể nói Realtime PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thì nghiệm có thể thấy được

Các vấn đề kỹ thuật cơ bản của Realtime PCR:

Biểu đồ khuếch đại của Realtime PCR

Bạn cần tìm hiểu về đường nền (baseline), ngưỡng (threshold), chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct) Ngoài ra bạn cần tìm hiểu thêm về đường chuẩn (standard curve) và

hệ số tương quan (R)

Biểu đồ khuếch đại của phản ứng Realtime PCR

Đường nền (baseline): là số chu kỳ của phản ứng PCR mà tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu tích lũy dần nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của thiết bị Mặc định, đường nền được xác lập trong khoảng từ chu kỳ 3 đến chu kỳ 15 và có thể được thay đổi

Ngưỡng (threshold): là một giá trị huỳnh quang được xác lập một cách tùy ý, dựa trên đường nền

Chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct): được định nghĩa là số chu kỳ PCR mà ở đó tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu lớn hơn ngưỡng Nói khác đi, đó là số chu kỳ của phản ứng realtime PCR ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền

Đường chuẩn của phản ứng Realtime PCR

Trang 9

Đường chuẩn của phản ứng realtime pcr

Đường chuẩn được xây dựng với các nồng độ (pha loãng 5 đến 10 lần) của một trình

tự DNA chứng đã biết và các giá trị Ct tương ứng Đường chuẩn (standard curve): thể hiện mối quan hệ giữa chu kì ngưỡng với số lượng DNA đích ban đầu có trong mẫu chuẩn

Hệ số tương quan (R2): Đánh giá độ chính xác của thao tác hút dung dịch mẫu chuẩn (pipetting) có đúng thể tích mong muốn hay không Trị số R2 phải đạt ≥ 0.90 có nghĩa

là đường biểu diễn chuẩn phải đạt tuyến tính cao

Hiệu suất của phản ứng PCR (E%): Hiệu suất phản ứng PCR có thể ảnh hưởng đến chu kỳ ngưỡng

Để cho kết quả chính xác nhất, bạn nên sử dụng máy realtime PCR chất lượng tốt

Định dạng
Số trang	17
Dung lượng	214,85 KB