seminar xúc tác enzyme(final)

Một coenzyme khi kết hợp với các apoenzyme khác nhau phần protein thì xúc tác cho quá trình chuyển hóa các chất khác nhau nhưng chúng giống nhau về kiểu phản ứng.. Cơ chế hoạt động của e

TP Hồ Chí Minh, 7/2012

Báo Cáo Seminar Môn Học Hoá Xúc Tác

Ứng Dụng Của Xúc Tác Enzyme

Enzyme Pectinase và Ứng Dụng Trong Chế Biến Nước Quả

Sinh Viên: Ung Thái Lê Anh

MSSV: 0914013 Lớp 09HOH

Giáo Viên Hướng Dẫn: Cổ Thanh Thiện

I Tổng Quan Về Enzyme Xúc Tác

I.1 Enzyme là gì?

Enzyme là protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học Enzyme có trong nhiều đối tượng sinh học như thực vật, động vật và môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Một số enzyme cấu tạo gồm toàn những phân tử L amino acid liên kết với nhau tạo thành, gọi

là enzyme một thành phần

Đa số enzyme là những protein phức tạp gọi là enzyme hai thành phần Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại hay coenzyme Một coenzyme khi kết hợp với các apoenzyme khác nhau (phần protein) thì xúc tác cho quá trình chuyển hóa các chất khác nhau nhưng chúng giống nhau về kiểu phản ứng

Một số enzyme cần ion kim loại cho hoạt động như:

Fe2+ hoặc Fe3+ Cytochrome oxidase, catalase, peroxidase

Mg2+ Hexokinase, glucose 6-phosphatase, pyruvate kinase

Một số coenzyme và chức năng vận chuyển nhóm tương ứng của chúng như sau:

5’- Deoxyadenosylcobalamin (coenzyme B12) Nguyên tử H và nhóm alkyl

I.2 Cơ chế hoạt động của enzyme

Những quan điểm hiện nay nhằm giải thích cơ chế tác dụng của enzyme đều cho rằng khi enzyme (E) tương tác với cơ chất (S) sẽ làm giảm năng lựợng hoạt hóa các phản ứng hóa sinh

Nhìn chung ta có thể hình dung cơ chế tác dụng của enzyme lên cơ chất tạo sản phẩm bằng phương trình tổng quát như sau:

E + S  E - S  P + E Giai đoạn 1: E kết hợp với S để tạo thành E-S Giai đoạn này xảy ra rất nhanh, nhờ các liên kết không bền như liên kết hydro, tương tác tĩnh điện, tương tác Van der Waals… Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước

Giai đoạn 2: Sau khi tạo phức, cơ chất có những biến đổi nhất định về mật độ điện

tử, cấu hình làm cơ chất trở nên hoạt động hơn, phản ứng được dễ dàng để tạo thành sản phẩm P

Trong nhiều phản ứng do enzyme xúc tác có 2 hay nhiều lọai cơ chất, ví dụ hexokinase xúc tác phản ứng:

Cơ chế enzyme xúc tác cho phản ứng 2 cơ chất có thể như sau:

ATP + glucose hexokinase ADP + glucose 6 phosphate

a/ Cơ chế tạo phức 3 thành phần

S 2

b/ Cơ chế không tạo phức 3 thành phần

Đây là trường hợp cơ chất thứ 2(S2) chỉ kết hợp vào enzyme ( ở trạng thái E’) sau khi P1 được tạo thành

Trung tâm hoạt động của enzyme:

- Là bộ phận dùng để liên kết với cơ chất

- Chỉ chiếm tỉ lệ rất bé so với thể tích toàn bộ của enzyme

- Gồm các nhóm chức của amino acid ngoài ra có thể có cả các ion kim loại và các nhóm chức của các coenzyme

Theo Fisher trung tâm hoạt động có cấu trúc cố định, khi kết hợp với cơ chất để

tạo phức E-S ta có thể hình dung giống như chìa khóa và ổ khóa Ngày

nay người ta đã chứng minh được rằng: trung tâm hoạt động của enzyme chỉ có cấu tạo hoàn chỉnh khi có sự tương tác với cơ chất (thuyết tiếp xúc cảm ứng của

Koshland)

I.3 Các yếu tố ảnh hưởng khả năng xúc tác của enzyme

I.3.1 Tính đặc hiệu của enzyme

Đa số các enzym có tính chọn lọc đối tượng tác động một cách rõ rệt, mỗi một enzym chỉ tác động lên một cơ chất, một kiểu phản ứng hoặc một loại phản ứng, có nghĩa là tác dụng của enzym có tính đặc hiệu

Có các kiểu đặc hiệu của enzym:

- Đặc hiệu cơ chất bao gồm đặc hiệu tuyệt đối và đặc hiệu tương đối

+ Đặc hiệu tuyệt đối: Mỗi enzym chỉ xúc tác phản ứng cho một loại cơ chất nhất

định Ví dụ: Enzym urease chỉ phân hoá urea chứ không ảnh hưởng tới metylurea

+Đặc hiệu tương đối: Enzym loại này xúc tác phân hóa một kiểu liên kết, không chịu ảnh hưởng của chất tạo ra liên kết đó Ví dụ: Nhóm esterase có lipase cắt mạch este giữa acid béo và rượu (acid béo có thể dài ngắn khác nhau, rượu có thể glycerin hoặc rượu vòng ) Tuy vậy tốc độ phản ứng có thay đổi

- Đặc hiệu theo kiểu phản ứng: Enzym loại này chỉ tác động lên một kiểu phản ứng nhất định Ví dụ: amino acid có khả năng xảy ra phản ứng khử carboxyl, phản ứng khử amin bằng cách oxy hóa và phản ứng vận chuyển nhóm amin, vì vậy mỗi phản

ứng ấy cần có một enzyme đặc hiệu tương ứng xúc tác theo thứ tự là decarboxylase,

aminoacid oxydase và aminotransferase

- Đặc hiệu theo kiểu hình học không gian: Enzym loại này chỉ tác động chọn lọc lên một kiểu của cơ chất, nếu cơ chất này có nhiều đồng phân không gian Ví dụ: L- arginin bị phân hoá bồi L- arginase thành omitin và urea, còn D- arginin enzym này không phân hóa Hoặc enzym lactat-dehydrogenase của bắp thịt chỉ xúc tác chuyển acid lactic kiểu L (+) thành acid pyruvic nhưng không tác động lên kiểu D (-)

I.3.2 Các yếu tố ảnh hướng đến hoạt tính enzyme:

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>>[E]

thì tốc độ phản ứng phụ thuộc vào [E], v= K[E] có dạng y = ax Nhờ đó người ta đã đo [E] bằng cách đo vận tốc phản ứng do enzyme đó xúc tác Có nhiều trường hợp trong môi trường

có chứa chất kìm hãm hay hoạt hoá thì vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [S]: Khi tăng [S] thì v phản ứng tăng, tăng [S] đến một giá

trị nào đó thì v đạt đến giá trị Vmax và sẽ không tăng nữa nếu ta vẫn tiếp tục tăng [S]

Ảnh hưởng của chất kìm hãm (inhibitor): Là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm

enzyme không còn khả năng xúc tác biến cơ chất thành sản phẩm Kìm hãm enzyme có thể thực hiện bằng nhiều cách khác nhau (thuận nghịch hay không thuận nghịch)

Ảnh hưởng của chất hoạt hóa (activator): Là chất làm tăng khả năng xúc tác nhằm chuyển

hóa cơ chất thành sản phẩm Thông thường là những cation kim loại hay những hợp chất hữu

cơ như các vitamin tan trong nước

Ảnh hưởng của nhiệt độ: Ta có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng

nhiệt độ môi trường, hiện tượng này tuân theo quy luật Vant’-Hoff Đối với phản ứng do enzyme xúc tác cũng có thể áp dụng được quy luật này nhưng chỉ trong một phạm vi nhất định,vì bản chất enzyme là protein Khi ta tăng nhiệt độ lên trên 40-500C xảy ra quá trình phá huỷ chất xúc tác Sau nhiệt độ tối ưu tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác sẽ giảm Nhờ tồn tại nhiệt độ tối ưu người ta phân biệt phản ứng hoá sinh với các phản ứng vô cơ thông thường

Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối ưu khác nhau, phần lớn phụ thuộc nguồn cung cấp enzyme, thông thường ở trong khoảng từ 40-600C, cũng có enzyme có nhiệt độ tối ưu rất cao như các enzyme của những chủng ưa nhiệt Các chủng vi sinh vật ưa nhiệt, đăc biệt các vi khuẩn chịu nhiệt có chứa enzyme chịu nhiệt cao

Ảnh hưởng của pH: Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác

nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết với cơ chất và tính chất hoạt động của phân tử enzyme Điều này dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH

Các yếu tố khác: ánh sáng, sự chiếu điện, sóng siêu âm,…

II Ứng Dụng Của Xúc Tác Enzyme

II.1 Tổng quan

Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triễn mạnh mẽ trên qui

mô công nghiệp Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng Các chế phẩm enzyme phổ biến như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase…

Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học, trong công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm,…

Trong thực phẩm: Ứng dụng của enzym trong ngành công nghiệp thực phẩm dựa

trên ba khía cạnh cơ bản:

-Kiểm soát chất lượng thực phẩm,

-Điều chỉnh thuộc tính của một số phụ gia thực phẩm và chính loại thực phẩm đó, -Sản xuất các enzyme để sử dụng làm chất phụ gia thực phẩm

*Trong trường hợp đầu tiên, sự hiện diện hay vắng mặt của một số enzyme hoạt động có tác động rất lớn đối với chất lượng cuối cùng của các sản phẩm Ví dụ như: Alkaline -phosphatase dùng để đánh giá hiệu quả của quá trình thanh trùng sữa; catalase là một chỉ

số về độ nhiễm vi sinh vật trong các loại thực phẩm nhất định, hoạt hóa pectinesterase đúng chỗ sẽ cho phép thu được trái cây và rau quả cứng hơn với nhiều thuộc tính cảm quan hấp dẫn người tiêu dùng

*Khía cạnh thứ hai đề cập đến việc sử dụng các enzyme để thay đổi các tính chất lý-hóa học của các loại thực phẩm, chẳng hạn như amylases, lipases và pectinaza

Ví dụ: dứa , cà chua khi đưa vào sản xuất có độ chín khác nhua, phải qua giai đoạn ủ chín

để chuyển hóa protopectin ( 1 hợp chất pectin có cấu tạo phức tạp, ngoài các chuỗi polygalacturonic còn có các thành phần khác như axit axectic, xenluloza, galactoza,rhamnoza > tạo nên cấu trúc cứng của các loại quả) về dạng pectin hòa tan nhờ enzyme pectinaza Hoặc sau khi chà sẽ đưa enzyme pectinaza vào để phá vỡ màng tế bào thực vật giúp tạo ra các vết nứt trên quả tạo thành rãnh thoát dịch chiết ra ngoài > làm tăng hiệu suất chiết dịch quả

*Những khía cạnh mới nhất, liên quan đến quá trình sản xuất của các enzym, trong đó có ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm Các quá trình bao gồm chiết xuất enzym từ công-nông nghiệp và chất thải từ cá, mô thực vật và động vật và các nguồn vi sinh vật Việc sản xuất gần đây đang dần trở thành một trong những hệ thống sản xuất quan trọng nhất trong ngành công nghiệp thực phẩm, do thực tế các enzym thu được trong thời gian

ngắn mà không sinh ra các hợp chất hóa học có nguy cơ tiềm tàng như ô nhiễm môi trường

và sức khỏe, các enzyme thu được còn có đặc tính đồng nhất cao

Trong các nhà máy chế biến thực phẩm thì enzyme được sử dụng như một công cụ của toàn bộ quá trình chuyển hóa hoặc là toàn bộ quá trình chuyển hóa trong dây chuyền chế biến Nếu thiếu sự có mặt của nó thì quá trình chế biến không thành công

Ví dụ: trong sản xuất bia, quá trình chế biến dịch đường có mục tiêu là tìm điều kiện tối ưu chuyển nhiều nhất có thể các chất có trong nguyên liệu đi vào dịch trở thành chất chiết của dịch đường Để đạt được mục đích này thì ngoài quá trình khuyếch tán đơn giản của các thành phần mà chủ yếu là quá trình chuyển hóa các hợp chất cao phân tử không hòa tan thành các chất thấp phân tử hoà tan dưới tác dụng của nhiều hệ enzyme khác nhau

* tinh bột + alpha-amliza, beta-amilaza

> dextrin : tạo độ sánh và giữ bọt cho bia

> maltoza, glucoza: cung cấp đường cho quá tình lên men

* protein + proteaza

> peptit phân tử lượng thấp: tăng khả năng giữ bọt do chứa nhóm chức tích điện , liên kết với CO2

> axit amin:

- đảm bảo độ bền sinh học do ngăn chặn sự tạo thành kết tủa tạo cặn của protein trong quá trình thanh trùng ở nhiệt độ cao (sẽ làm thay đổi hằng số điện môi)

- nguồn cung cấp N đảm bảo quá trình lên men và chống thoái hóa giống

- tăng giá trị dinh dưỡng cho bia

* Hợp chất chứa P + sitaza, photphataza

> giải phóng P:

- hợp chất quang trọng trong chu trình Kreb

- hợp chất vi lượng cần cho hoạt động sống của nấm men

- cân bằng pH trong môi trường lên men

III Enzyme pectinase và ứng dụng trong thực phẩm

III.1 Giới thiệu:

-Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của các acid galacturonic qua các liên kết α-1,4 glucoside

-Pectin hoà tan trong nước, ammoniac, dung dịch kiềm, carbonate natri và trong glycerine nóng Độ hoàtan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hoá trong phân tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm

-Các pectin tự nhiên định vị trong thành phần của tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polyssacharide vàprotein để tạo thành các protopectin không tan

->Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự thủy phân pectin (polysaccharide dị thể)

->Pectinase được sản xuất chủ yếu bởi nấm mốc Aspergillus sp., Botrytis cinerea,

Fusariummoniliforme, Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp., Neurospora crassa…

->Enzyme pectinase thường được dùng trong cơng nghiệp thực phẩm và dược phẩm đặc

biệt trong cơng nghệ sản xuất các loại nước quả và rượu vang Người ta sử dụng enzyme pectinase để khử pectin, tránh hiện tượng bị đục và lắng cặn trong quá trình sản xuất và bảo quản

III.2 Phân loại:

Enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng

Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester.

Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị không bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol

Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau Nếu thu từ nguồn VSV thì PH tối ưu từ 4,5-5,5, còn nếu từ nguồn thực vật thì có pH tối

ưu từ 5,0-8,5 Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30-40oC và bị vô hoạt ở 55-62oC Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion Ca2+ và Møg2+

Polygalacturonase (PG) còn có tên gọi là poly

α-1,4-galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết α–1,4-glycoside, là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất

Các exo-PG (exo-poly 1,4-α-D-galacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ các đầu không khử, và endo-PG (endo-poly1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất

The matrix of endo-PG

Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhưng có chủ yếu ở một số nấm mốc và

vi khuẩn

Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị

ester hoá Cả hai enzyme exo-PEL và endo-PEL đều tồn tại Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzyme này

Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động

Pectate lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm Các enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá

trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật

III.3 Cơ chế tác động và ứng dụng trong chế biến nước hoa quả:

Trong chế biến nước quả, người ta sử dụng các chế phẩm enzym nhằm hai mục đích

cơ bản

- Phá vỡ thành tế bào thức vật nhằm nâng cao hiệu suất thu nước quả

- Làm trong và ổn định chất lượng nước

Phá vỡ thành tế bào Tế bào thực vật được cấu tạo bằng vỏ tế bào (thành tế bào) Vỏ tế bào như một lớp thành bảo vệ rất hữu hiệu và tạo hình cho tế bào Ở vỏ tế bào thực vật có nhiều chất pectin, các chất pectin được xem như chất ciment gắn các tế bào với nhau Phá

vỡ sự gắn kết này sẽ tạo điều kiện cho các vật chất trong tế bào thoát ra khỏi tế bào Các chế phẩm enzym có chứa không chỉ pectinase mà còn chứa các enzym trong nhóm

cellulase Các loại enzym này sẽ làm phá vỡ thành tế bào và giúp quá trình sản xuất dịch tế bào tốt hơn

Làm trong nước quả Nước quả sau khi được tách khỏi tế bào thường chứa nhiều chất khác nhau Trong đó chất pectin chiếm lượng đáng kể và pectin thường gây hiện tượng độ nhớt cao và gây đục nước quả

Các chất protein có trong bào tương, màng tế bào và gian bào Pectin chứa

polygalacturonic acid, araban và galactan Trong đó lượng polygalacturonic acid chiếm tới 40-60% Khi bị thủy phân, pectin tách thành hai phần:

- Phần trung tính – phức chất galactanoraban

- Phần acid – acid pectic

Trong bào tương, pectin nằm ở dạng hòa tan Trong màng tế bào và gian bào, chúng nằm ở dạng không hòa tan gọi là protopectin Protopectin ở màng gian bào có chứa lượng kim loại khá lớn và một lượng nhóm metocyl đủ để làm protopectin bền vững Còn protopectin

ở màng tế bào chứa một lượng kim loại không nhiều, có độ metocyl hóa cao Vì thế, tế bào