| BO GIAO DUC VA BAO TAO _ TRUNG TÂM KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ |
CONG NGHE QUOC GIA
VIEN CONG NGHE SINH HOC NGHIÊM NGỌC MINH
Trang 2Cơng trình được hồn thành tại: Viện Công nghệ Sinh học, Trưng tam Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia
Người hướng dẫn khoa học:
1 PGS TS Lé Thị Muội
2 PTS Nguyễn Đức Thành
Phản biện]: PGS PTS Nguyễn Quang Thạch Phan bién 2: GS PTS Vi Van Vu
Phan bién3: GS TS Lé Don Dién
Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp tại: Viện Công nghệ sinh học Trung tâm KHTN á: CNQG
Vào hồi giờ ngay tháng nam 1999
Có thể fìm hiểu luận án tại thư viện:
+ Thư viện quốc gia
+ Viện Công nghệ Sinh học
Trang 3MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đẻ tài
Hàng năm trên thế giới và ở Việt nam, số lượng giống cây trồng bị thoái hoá, giảm năng suất bị thiệt hại do sâu bệnh cũng như sự thay đối bất lợi của điều kiện ngoại cảnh ngày một gia tăng Vì vậy việc cải tạo và nâng cao phẩm chất của cây trồng, đồng thời tạo ra những cây trồng mới có khả năng chống
chịu sâu bệnh bằng công nghệ tế bào thực vật là một việc làm cần thiết và
cấp bách hiện nay
Việc sử dụng công nghệ tế bào thực vật như dung hợp protoplast, chuyển gen đã được nhiều nước trên thế giới cũng như ở Việt nam quan tâm chú ý Tuy nhiên những nghiên cứu này chủ yếu chỉ tập chung vào việc cải tạo các đặc tính đi truyền trong nhân Việc nghiên cứu di truyền tế bào chất mặc dù đã có một số ít phòng thí nghiệm quan tâm tới nhưng số lượng các công bổ còn rất hạn chế và chưa được tập trưng một cách có hệ thống Hơn nữa nhiều đặc điểm có giá trị cả về lý thuyết cũng như thực tiễn như kháng thuốc kháng
sinh kháng độc tố nấm chống chịu sâu bệnh đã được xác định là các đặc
điểm di truyền tế bào chất Do đó việc sử dụng công nghệ tế bào thực vật một cách có hệ thống trong việc cải biến di truyền tế bào chất ở thực vật mang một ý nghĩa quan trọng trong cả hai hướng nghiên cứu cơ bản cũng như ứng dụng Đặc biệt ở Việt nam hướng nghiên cứu này còn ít được quan tâm nên nội dung nghiên cứu của chúng tôi là hoàn toàn cần thiết và phù hợp
2 Mục đích nghiên cứu của luận án
Trang 43 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Một số loài cây thuộc họ ca (Solanaceae) nhu Nicotiana tabacum (N tabacum), Nicotiana plumbaginifolia (N plumbaginifolia), Solanum nigrum (S nigrum) va mét s6 dong N tabacum mang cdc kiểu gen lục lạp khác nhau
đã được chúng tôi sử dụng để nghiên cứu trong luận văn này 4 Điểm mới và ý nghĩa của luận án
- Lần đầu tiên ở Việt nam sử dụng có hệ thống công nghệ tế bào frực vật để biến đổi di truyền tế bào chất (di truyền lue lạp) ở cây thuốc lá Đặc biệt
việc chuyển thành công một đoạn ADN lục lạp (LpADN) ngoại lai tt S nig- ru (thuộc họ phụ Solanotdeae) vào cây thuốc lá N phưnbagimjfolia (thuộc họ phụ Cesoideae) bằng kỹ thuật chuyển gen trực tiếp vào protoplast nhờ xử lý với polyethylen giyeol (PEG) đã góp phần khảng định những thành tựu mới về chuyển gen lục lạp ở Việt nam cũng như trên thế giới
- Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên có hệ thống về sự thay đổi một số
đặc điểm sinh hoá (hàm lượng nicotn chlorophyll, đường khử và protein tổng
số) ở những đòng thuốc lá mang các kiểu gen lục lạp khác nhau 5 Bố cục của luận án
Luận án gồm tổng cộng 120 trang, trong đó bao gồm: Phần mở đầu 3
trang Tổng quan tài liệu 30 trang (gồm l bảng) Nguyên liệu phương pháp l3 trang (gồm 2 hình và 2 bảng) Kết quả và thảo luận 50 trang (gồm 24 hình và § bảng) Kết luận và kiến nghị 2 trang Tài liệu tham khảo 22 trang có 180 tài liệu (gềm 8 tài liệu tiếng Việt nam và Ï72 tài liệu tiếng Anh)
NOI DUNG LUAN AN
Chương 1: Tổng quan tài liệu
1.1 Hệ gen lục lạp
Năm 1909 Bour và Correns đã độc lập công bố những kết quả đầu tiên về quy luật đi truyền khóng theo Menden Đây là những bước đột phá đầu tiên
đặt cơ sở cho việc nghiên cứu hệ gen lục lạp Những hiểu biết đầu tiên về di
Trang 5truyền tế bào chất được bắt đầu từ tảo đơn bào Chlamydomonas Cau tric va sự biểu hiện của LpADN đã được bắt đầu nghiên cứu bởi Sager và cộng sự (1963) Bản đồ lý học đầu tiên của LpADN được thiết lập từ cây ngó vào năm 1976, sau đó tiếp tục được xây dựng ở thuốc lá, cỏ gan gà lúa Hệ gen lục lạp chứa trung bình khoảng 120 kb đủ để mã hoá cho 120 gen Về cơ bản hệ gen lục lạp hoạt động một cách riêng biệt và có chứa ADN Tiêng Các LpADN này mang các thông tin di truyền mã hoá cho việc tổng hợp các protein riêng của mình
Thìn chung các nghiên cứu chỉ tiết về mặt cấu trúc cũng như chức nàng hoạt động và biểu hiện của hệ gen lục lạp (đặc biệt là ở thuốc lá) đã được tìm hiểu khá ti mỉ và cho đến nay đã có nhiều tác giả công bố về thành rựu này
142 Nuôi cấy và dung hop tế bào trần (protoplast)
Protoplast là phản nằm trong thành tế bào có khả năng co nguyên sinh và có thể tách rời khỏi thành tế bào bằng phương pháp cơ học hoặc enzym học (Cooking 1972 1960) Protoplast được bao bọc bởi màng nguyên sinh nó có thể tái tạo lại thành tế bào mới và phân chia Protoplast có thể được tách từ nhiều bộ phận, cơ quan của cây Nhờ có những đặc điểm khá đặc biệt mà protoplast đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu chọn dòng tế bào thực vật, dung hop protoplast, bién nạp di truyền
Bắt đầu từ những nghiên cứu tạo ra cây thuốc lá hoàn chỉnh đầu tiên từ Protolast cla Takebe (1971) cho đến nay nhiều loài thực vật (cả cây một lá mầm và hai lá mầm) đã được tạo ra từ việc tách và nuôi cấy protoplast
Phương pháp dung hợp protoplast thường được sử dụng rộng rãi hiện nay là phương pháp của Kao và Mixchaylux (1974) Nhờ kỹ thuật dung hợp, người ta có thé tao ra những tổ hợp lai xôma cũng như lai tế bào chất bất kỳ theo ý muến Nhiêu cây lai xôma đã được tạo ra ở các cây trồng có ý nghĩa kinh tế như khoai tây, cà chua lúa
Trang 6Chọn lọc đột biến lục lap trong điểu kiện í vo những tính kháng kháng sinh, kháng chất diệt cô ở một số đối tượng thuộc họ cà (Solanaceae)
đã được nhiều tác giả thông báo Điều này có ý nghĩa rất lớn trong biến đổi di truyền lục lạp Hơn nữa nhiều đặc điểm đi truyền có lợi được mã hoá bởi gen
lục lạp, do đó tìm hiểu và nghiên cứu đột biến lục lạp sẽ giúp cho chúng ta sử dụng có hiệu trong nghiên cứu cơ bản cũng như cải tạo giống cây trồng
Trên cơ sở kỹ thuật dung hợp protoplasL nhiều nhà nghiên cứu đã tiến hành chuyển lục lạp nguyên vẹn hoặc chuyển lục lạp bằng tái t6 hop LpADN để tạo ra những cây lai tế bào chất mang các kiểu gen lục lạp khác nhau Đặc biệt việc tạo cây lai tế bào chất mang LpADN tái tổ hợp đã mang một ý nghĩa rất lớn, góp phần khắc phục được tính bất hợp giữa hệ gen nhân và hệ gen lục
lap ở các tổ hợp lai xa về mặt phản loại
Bên cạnh kỹ thuật dung hợp protoplast việc sử dụng một số phương
pháp chuyển gen vào lục lạp để tạo các dòng chuyển gen mang các đoạn gen
ngoại lai trong hệ gen lục lạp của mình cũng đã được một số tác giá thông báo (O” Neill và cộng sự, 1993; Spörlein và cộng sự, 1901 ) Những phương pháp
chuyển gen đã giúp các nhà nghiên cứu có thể áp dụng tạo ra các cây chuyển
gen Tnang các gen ngoại lai quy định một số đặc tinh di truyền tế bào chất có
lợi trong một thời gian ngắn Đồng thời việc tạo ra các cây lai tế bào chất cũng như cây chuyển gen mang các kiểu gen lục lạp mới sẽ góp phần cải biến một
số đặc điểm di truyền lục lạp ở cây trồng
1.4 Phân tích cây dụng hợp và cây chuyển gen lục lap
Cho đến nay sau bước đầu chơn trên môi trường có tác nhân chọn lọc như kháng thuốc kháng sinh người ta đã tiếp tục nghiên cứu phán tích được số phận của các tổ hợp lục lạp cũng như các gen lục lap ngoại lai trong tế bào cây chủ nhờ một số kỹ thuật phân tử như phân tích enzym cắt giới hạn lai Southern hoặc phản ứng chuỗi polymeraza (PCR) Các kỹ thuật này đã giúp cho các nhà nghiên cứu chúng mình được chính xác hơn sự có mặt của các
Trang 7gen ngoại lai, đồng thời ầm hiểu kha năng hợp nhất và hoạt động của chúng trong hệ gen của cây chủ
Tóm lại trên cơ sở những những phân tích của phần tổng quan, chúng tôi đã đặt ra mục tiêu và nội dung nghiên cứu phù hợp để góp phản cải biến di truyền tế bào chất (chủ yếu ở lục lạp) ở thuốc lá (là đại diện điển hình của cây họ cà) nhằm phục vụ cho nghiên cứu và đặt cơ sở áp dụng trong cải tạo cây trồng
Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp 2.1 Nguyên liệu
- Loài Solanum nigrum (S nigrum) mang d6t biến lục lạp kháng cả hai
loại streptomycin vA spectinomycin
- Loai N plumbaginifolia man cam v6i streptomycin va spectinomycin - Dong Pertit havana (PH) (thuộc loài N rabacum) có mầu xanh bình thường mẫn cảm với streptomycin và spectinomycin
- Dong Turkish samsun (thuộc loài N tabacum) bình thường
- Dòng §#A/5 (thuộc loài M /bacum) bị bạch: tang do đột biến lục lap,
chi phát triển ở nơi thiếu ánh sáng trong điều kién in vitro
- Dòng 57 (thuộc loài M /abacwm) bị đột biến lục lạp, mẫn cảm với ánh
sáng chi phát triển trong điều kién in vitro
- Các dòng LS.SalT.2, LS.SalI.3, LS.Sal3.!, là những dòng ! $7 chứa lục
lạp của Salpiglosis sinuata (S sinuata), c6 lá xanh bình thường
- Hai dong LS.tub/ va LS.tub3, 1a hai dong LSJ chita LpADN tai tổ hợp cua LS} va Solanum tuberosum (S tuberosum), cé 14 xanh binh thường
- Plasmid pSSH! mang doan LpADN cta S nigrum chita hai gen khéng streptomycin và spectinomycin và được thiết kế phù hợp cho chuyển gen vào
lục lạp
Trang 8téng hop Dublin II, Ireland Hai mỗi này được sử dụng đặc hiệu cho nghiên cứu hệ gen lục lạp của S nigrum
2.2 Phuong pháp nghiên cứu 2.2.1 Tách protoplast
Protoplast tách từ phiến lá của các cây trong điểu kiện vô trùng theo
Menczel va cong su, 1981
2.2.2 Tao cay lai t& bao chat (TBC) bang dung hop
- Dung hợp protoplast tiến hành theo Kao và Michaylux (1974) được Menczel và cộng sự cải tiến năm 198]
- Tach chọn sản phẩm dung hợp và tái sinh cây được tiến hành tương tự như mô tả của Nguyễn Đức Thành ,1989
- Lục lạp được tách theo Bookjans và cộng sự, 1984, và LpADN được tách làm sạch theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989,
- LpADN duoc phan tích bằng cách sử dụng các enzym cất giới hạn Các doạn LpADN sau khi cắt được phân lập trên điện di bản mỏng (0.5 % agaroza) với dòng điện 80 mA, sau đó nhuộm với ethidium bromide và quan sát, chụp ảnh dưới ánh sáng của tia cực tím
2.2.3 Phương pháp chuyển gen (biến nạp) trực tiếp vào protoplast nhờ xt ly voi polyethylen glycol (PEG)
- Tach va lam sach plasmid pSSH1 theo phuong phdp cia Sambrook và cộng sự, 1989
- Chuyển gen vào protoplast, nuôi cấy và chọn lọc sản phẩm được thực
hiện theo như mô tả của O` Neill và cộng sự, 1993
- Phân tích LpADN của cây chuyển gen bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi
polymeraza (PCR) Sản phẩm PCR được quan sát trên điện di đồ sau khi chạy điện đi trên gel agaroza (1%)
Trang 9Tính kháng kháng sinh của những cây dung hợp và cây chuyển gen được kiểm tra bằng phương pháp thử mảnh lá và thử khả năng nảy mầm của hạt trên moi trường chọn lọc như đã được mô tá bởi Nguyễn Đức Thành (1989)
2.2.6 Phương pháp phần tích nhiễm sắc thể (NST)
Nhiễm sắc thể được quan sất ở giai đoạn trung kỳ trong những tế bào đỉnh sinh trưởng và được đếm và chụp ảnh trên kính hiển vi Olympus (Nhat Bản) với độ phóng đại 1500 lần
2.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng Hicotin
Nicotin được tách từ lá của các dòng có cùng độ tuổi và hàm lượng nico-
tin được xác định theo phương pháp của Willits và cộng sự năm 1950 2.2.8 Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll
Chlorophyll được tách từ lá thứ bốn (tính từ ngọn trở xuống) của các đồng có cùng độ tuổi (45 ngày), được nuôi dưỡng trong điều kiện ánh sáng nhu nhau (2500 lux, 25°C) Ham luong chlorophyll trong mau được xác định theo Lichtenthaler năm 1987
2.2.9 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử
Hàm lượng đường khử trong mẫu lá được tách và xác định theo phương pháp khử và chuẩn độ của Bertran (được mê tả bởi Tret’jacova, 1982)
2.2.10 Phuong pháp xác định hàm lượng protein tổng số
Hàm lượng protein tổng số trong lá được xác địh theo nguyên lý của phương pháp Kjeldhal, tiến hành trên máy Tecator (Thụy Điển) tại phòng phân tích Viện Kinh tế kỹ thuật thuốc lá
Các số liệu thí nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học Sai số của trung binh mau va t - test (simple sample test) được tính toán bằng chương trình WINKSVER.4.I.c trên máy vi tính
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Trang 10Đề tiến hành các thí nghiệm dung hợp protoplast nhằm mục đích chuyển lục lạp giữa các loài cây khác họ phụ, chúng tôi đã sử dụng cây S nigrum (mang đột biến lục lạp kháng streptomycin và spectinomycin) đã bị chiếu xạ giết nhân bằng Co'° để dùng lim cay cho luc lap, cay N tabacum 1 cay nhận luc lap (man cam véi streptomycin va spectinomycin)
Sau 6 đến 7 tuần nuôi sản phẩm dung hợp và chọn lọc trên môi trường có chứa Ig/l spectinomycin, chúng tôi đã nhận được 13 cụm tế bào (colonies) phát triển tốt có màu xanh từ 6,8 x10* cum tế bào dung hợp Các mô này được tiêp tục chọn lọc trên các môi trường có chứa streptomycin và có đồng thời cả hai loaj streptomycin va spectinomycin Kết quả được trình bày trong bảng 1
Bảng 1: Kết quả tạo các cụm té bào kháng thuốc bằng
dung hop protoplast
Tổ hợp dung hợp Số lượng cụm tế bào (colonies)
Protaplast | Protoplast | Tổng sế Kháng Kháng Kháng spectino-
cho nhân ene ho TBC Spectinom | streptomy | mycin và strep- ycin (1 g/l) | cin (ig/l) P repromy | my! tomycin sme 05g | igi
N tabacum | S nigrum | 6,8 x10" 4 6 3 0
Toàn bộ 13 mô xanh đã được chuyển lên môi trường thích hợp để tạo choi và tái sinh cây hoàn chỉnh Sau 5-6 tuần nuôi cấy chỉ có 9 mô tạo chổi va tái sinh thành cây, trong đó có 4 mô tạo ra cây có hình thái lá không bình thường, bị méo mó (gồm 3 mô chỉ kháng với spectinomycim và I mô chỉ kháng với streptomycin), các mô còn lại tái sinh thành cây có hình thái lá bình thường (bảng 2)
3.1.2 Một số đặc điểm hình thái, di truyền và số lượng nhiễm sắc thé (NST) cia cde dong lai tế bào chất
Trang 11lai Như vậy chúng tói đã tái sinh được 9 dòng lai Các dòng lai này đã được
nhân ra trong điều kiện ¡¡ wiro để theo dõi hình thái lá, khả năng phát triển và
tiến hành đếm số lượng nhiễm sắc thể của chúng Một số cây được trồng ra
nhà kính để theo dõi khả nang ra hoa kết quả và thu nhận hạt để kiểm tra tính
kháng kháng sinh của chúng qua 3 thế hệ Ry R,, Ry Kết quả theo đõi về hình
thái lá và số lượng nhiễm sắc thể được trình bày ở bảng 2
Bảng 2: Đặc điểm hình thái lá và số lượng NST ở những dòng “lai TBC giita S nigrum (SNig) và N tabacum (PH) nuôi cáy in vitro Các dòng lai TBRC Hình thái lá Số lượng nhiễm sắc thể Smyw+PH-1.J] Bình thường 2n = 48 Snig + PH-1.2 Bình thường an= 48 Snig + PH-2.1 Bình thường 2n = 48
Snig + PH-2.2 Không bình thường n=72
Snig + PH-4.1 Không bình thường 2n=72
Snig + PH-4.2 Không bình thường 2n=72
Šnig + PH-4.3 Bình thường 2n = 48
Snig + PH-4.4 Khong binh thudng 2n=72
Snig + PH-4.5 Binh thường n= 48
Qua bảng 2 chúng ta thấy có 5 dòng lai hoàn toàn giống với cây N
tabacum binh thường cả về hình thái cũng như số lượng NST (2n=48) Tuy
nhiên có 4 dòng có hình thái lá và số lượng NST không bình thường (2n=72) Theo chúng tôi, hiện tượng này có thể là do ảnh hưởng của quá trình tự đa bội hoá gây ra trong nuôi cấy mô tế bào, Quan sát và theo dõi quá trình sinh trưởng và phát triển cũng như thời gian ra hoa kết quả của 5 đồng lai bình thường ngồi nhà lưới, chúng tơi thấy chúng hoàn toàn tương tự với cây đối chứng (hình 1) Bon dong còn lại mặc dù có phát triển và ra hoa nhưng khả năng tạo hạt rất kém
3.1.3 Nghiên cứu đặc điểm di truyén luc lap kháng spectinomycin va
Trang 12Trong nghiên cứu này, hai phương pháp thử mảnh lá và thử khả năng nảy
mầm của hạt trên mỏi trường chọn lọc đã được chúng tôi sử dụng để kiểm tra
tính kháng kháng sinh của những dòng lai TBC kháng đồng thời với ca hai loai khang sinh (S.nig + PH-1.1, S.nig + PH-2.1 S.nig + PH-45)
Kết quả thử mảnh lá (ở 3 thế hệ Rạ, R,, R;) trên mói trường chọn lọc (có cả hai loại kháng sinh) đã cho thấy rừ những mảnh lá của cây lai TBC xuất hiện những chổi nhỏ có mầu xanh còn các mảnh lá của cây đối chứng không tạo chổi, chuyển màu trắng xám và bị chết
Hình 1: Cây lai TBC giữa
S nigrum và N tabacwm (1) và cây N tabacum bình thường (2)
Kết quả kiểm tra khả năng nảy mầm của hạt (ở 3 thế hé Ro, Rj Ry) trén
môi trường chọn lọc được trình bày ở bảng 3 Kết quả cho thấy hạt ở thế hệ R„ có một số hạt nảy mầm màu xanh một số hạt nảy mám bị bạch tạng Điều này có thể đã có sự phan ly trong quá trình phân chia tế bào Đối với hạt R, và R; hoàn toàn nảy mầm có màu xanh, chứng tỏ đã có sự ổn định nhất định tính
kháng thuốc kháng sinh trong thế sau Để có kết luận chỉ tiết hơn, theo chúng
Trang 13tôi cần phải có những nghiên cứu tiếp theo (đặc biệt là những phân tích về sinh học phân tử) Các hạt khóng nảy mảm có thể là đo bị lép hoặc chưa già
Đảng 3: Khẩ năng nảy mầm của hạt các đồng lai TBC và đổi chứng
trên môi trường chọn lọc
Tên dong Tổng số hạt Hat nay mam | Hat nay mém | Hat khong nay
kiểm tra màu xanh bạch tạng mầm i Hat cua R, PH (đối chứng) 500 0 (0%) 410 (82%) 90 (18%) Snig + PH-4.5 500 317 (63.4%) 48 (9.6%) 135 (27%) Snig + PH-1.] 500 292 (58,4%) 57 (11.4%) |151 (30/25) Snig + PH-2.] 500 279 (55.8%) | 102 (20.4%) | 119 (23.8%) 2 Hat cia R, PH (đốt chứng) 500 0 (0%) 471 (942%) |29 (5,8%) Snig + PH-4.5 500 463 (926%) 0 (0%) 37 (74) Snig + PH-I.] 500 452 (90.4%) 0 (0%) 48 (9,6%) Snig + PH-2.} 500 439 (87.8%) 0 (0%) 61 (12.2%) 3 Hạt của R; PH (đối chứng) 500 0 (0%) 464 (92.8%) | 36 (7.2%) Snig + PH-4.5 500 457 (91.4%) 0 0%) |43 (8.6%) Snig + PH-I.] 500 446 (89,2%) 0 (0%) 34 (10,8%) Snig + PH-2.] 500 443 (88.6% 0 (0%) 357 (114%)
Những kết quả nhận được từ thí nghiệm kiểm tra mảnh lá và khả năng nảy mắm của hạt trên mới trường chọn lọc đã chứng tỏ những cây lai tế bào chất đã mang đặc điểm lục lạp (kháng streptomycin và spectinomycin) ngoai
lai ổn định
3.1.4 Phản tích LDADN ở một số đòng lai TRC bằng enzym cắt giới hạn
Trong thí nghiệm này chúng tôi đã sử dụng 3 loại enzym cắt giới hạn là
Sail, PVull va Smal dé phan tích LDADN của 3 dong lai TBC kháng với cả hai loại kháng sinh và các dòng dùng trong dung hợp
Kết quả so sánh điện đi để LpADN của các dòng lai với điện di đồ LpADN cia S nigrum va N tabacum cho thay c6 su kbéc phau Khi cat với enzym Smal cdc đoạn cắt giới hạn (băng) của các dòng lai giống với các băng của cay N tabacum So sánh mẫu điện di đồ LpADN của các dòng lai với bố
Trang 14mẹ khi cất bằng hai enzym Sall và PVull đều cho thấy ở các cây lai ngoài
những bảng giống với bố mẹ còn xuất hiện thêm những băng mà ở bố mẹ
không có Đây chính là kết quả của hiện tượng tái tổ hợp LpADN giữa $ múg-
rum va N, tabacum
Như vậy bàng kỹ thuật dung hợp protoplast chúng tôi đã nhận được những cây lai TBC (lai lục lạp) có hình thái, số lượng NST, khả năng sinh trướng và ra ra hoa kết quả hoàn toàn bình thường như cây đối chứng, đồng thời các cây lai này đã duy trì được tính kháng kháng sinh ổn định qua 3 thế
bệ Rụ, Rị R; và mang LpADN tái tổ hợp Điều này có ý nghĩa rất lớn trong việc khác phục tính bất hợp giữa hệ gen nhân và hệ gen TBC ở những tổ hợp
lai có khoảng cách xa nhau về mặt phán loại
3.2 Chuyển gen vào lục lạp bằng phương pháp chuyển trực tiếp vào protoplast nhờ xử lý với polyethylen giycol (PEG)
3.2.1 Chuyến gen và chọn lọc các dòng chuyển gen
Để tiến hành chuyển trực tiếp đoạn LpADN của S nigrum mang gen khang streptomycin va spectinomycin vao protoplast cla N plumbaginifolia, chúng tôi đã sử dụng phương pháp chuyển gen lục lạp nhờ xử lý với PEG Qua 3 lần xử lý 7.5 x10” protoplast với ADN plasmid (pSSH1), chúng tôi đã thu được 7 mô phát triển có màu xanh trên môi trường có đồng thời streptomycin và spectinomycin (0.5g/] mỗi loại) Sau hai lần kiếm tra lại tính kháng kháng
sinh trên môi trường chọn lọc, chỉ còn lại 3 dòng mô chuyển gen là ổn định và
được gọi là CT6-3.¡, CT6-3.5, CT6-3.6 Hiệu quả chuyến gen này tương đương với kết quả của một số tác giả đã cóng bố Trong trường hợp đối chứng, không có mồ nào phát triển có màu xanh từ 6,8 x10 protoplast được nuôi trên môi trường chọn lọc
3.2.2 Một số đặc điểm hình thái và xố lượng NST trong cáy chuyển gen Toàn bộ 3 dòng mô chuyển gen được tái sinh thành 11 cây hoàn chỉnh Quan sát hình thái và đếm số lượng NST, chúng tôi nhận thấy chúng hoàn toàn giống với cây M piưmbaginifolia bình thường (2n=20) Tất cả 11 đòng
Trang 15chuyển gen trồng ở nhà lưới déu sinh trưởng, phát triển và ra hoa kết quả bình thường như cây không chuyển gen
3.2.3 Tính ổn định của các đặc điển ái truyền luc lap ngoại lai trong cây chuyển gen
Tính ổn định của các đặc điểm di truyền luc Jap khang khang sinh được
nghiên cứu nhờ phương pháp kiểm tra mảnh lá và khả năng nảy mầm cha hat
trên môi trường có kháng sinh chọn lọc qua 3 thế hệ Rạ, R,, R; Kết quả thử
mảnh lá trên môi trường có kháng sinh đã cho thấy tất cá các mảnh lá của đòng chuyển gen ở cả 3 thế hệ đều xuất hiện chồi màu xanh trong khi ở cây bình thường các mảnh lá không có chổi và bị chết trên môi trường chọn lọc (hình 2) Kết quả kiểm tra khả năng nảy mầm của hạt được trình bày ở bảng 4
Bảng 4: Khả năng nảy mâm của hạt trên môi trường chọn lọc (chứa 0,5 gil streptomyein va 0,5 gil spectinomycin)
Tên dòng Tổng số Số hạt nảy Số hạt nảy | Số hại không :
Trang 16Qua bảng 4, chúng ta thấy hầu hết các hạt của cây chuyển gen nảy mâm có màu xanh, trái lại các hạt của cây không chuyển gen bị bạch tạng hoàn toàn Một số ít hạt không nây mâm có thể do hạt chưa đủ già
Như vậy từ những kết quả này đã cho thấy các đặc tính di truyền lục lạp
cha S nigrum được biểu hiện và duy trì ổn định trong các dòng chuyến gen qua 3 thế hệ Rụ, R, Rp
Hinh 2: Những mảnh lá của
eay N plumbaginifolia chuyển gen
(, 3) và cây không chuyển gen (1)
trên môi trường chọn lọc chứa
streptomycin va spectinomycin (0,5 g/t mỗi loại)
3.2.4 Nghiên cứu LÐADN của những cậy chuyển gen
Dé ching minh su cé mat cba doan LpADN cia S nigrum trong cdc cây N plumbaginifolia chuyén gen (ở thế hệ Rạ, R,, R;), chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymeraza (PCR) với cặp mổi (primer) đặc thù cho 6 n¡grum trong phân tích LpADN của 4 cây chuyển gen (CT6-3.!.7 CT6-3.5.3, CT6-3.5.6, CT6-3.6.2), cây N phuưmbagimjfolia không chuyển gen và cây S nigrum mang gen dét bién khang spectinomycin va streptomycin Sau khi tiến hanh phan ting PCR véi doan méi dac thi cho S nigriwm va phan tich cdc san phẩm PCR trén gel agaroza, chúng tôi nhận thấy trên điện di đỏ xuất hiện duy
nhất một băng khoảng 800 cặp bazơ ở các mẫu LpADN của cây S nigrum va
Trang 17thì không thấy xuất hiện băng này (hình 3) Băng (có chiều dài khoảng 800 cập bazơ) này nằm giữa đầu 3' của gen 12 rps (kháng streptomycin) và đầu 5' của gen 16S rADN (kháng spectinomycin) trong đoạn LpADN cia S nigrum
Như vậy từ những kết quả nhận được về phân tích LpADN kết hợp với
kỹ thuật chọn lọc triệt để những mô chuyển gen ban đầu và kiếm tra tính kháng đồng thời cả streptomycin va spectinomycin ciia cdc cay chuyén gen qua 3 thé hé (Rg, R,, R;), chúng tôi cho rằng những cây Á phưnhbagbdƒfolia chuyển gen nhận được đã thực sự mang đớạn LDADN ngoại lai của S nigrum Đồng thời kết quả này còn kháng định tính hiệu quả của phương pháp chuyển gen vào lục lạp thông qua protoplast nhờ xử lý với PEG, góp phần vào việc cải
biến di truyền TBC và cải tạo giống cây trồng
rt~<‘CSOSOC*dCS i
|
Hình 3: Điện di đề sản phẩm |
PCR của LpADN 6 cfc dong N 2072 bp |
plumbaginifolia chuyển gen ' 1500 bp
trong thé hé R, (2, 3,4 5) N ¡
phưnbagiufolia không chuyển | 00 bp |
gen (6) và cay S nigrum (7), chi '
thị phân tử ADN bậc 100 bp (1) ' 100 bp
3.4 Nghiên cứu xinh hoá các dòng thuốc lá mang những kiểu gen luc lạp khác nhau trong điều kiện nuôi cấy in viro
Trong thí nghiệm của chúng tôi, hàm lượng nicotin, chlorophyll đường khử, protein tổng số đã được tách từ lá của các dòng thuốc lá bình thường,
Trang 18đòng bạch tạng, dòng mẫn cảm với ánh sáng các đồng mang tái tổ hợp lục lạp và các dòng chứa lục lạp ngoại lai để nghiên cứu những ảnh hưởng của các kiểu gen lục lạp khác nhau trong cây thuốc lá đối với sự thay đổi hàm lượng một số chất kế trên
Sự thay đổi hàm lượng nicotin và chlorophyll ở các dòng thuốc lá mang các kiểu gen lục lạp khác nhau được trình bày trong bảng 6
Bảng 6: Ham luong nicotin va chlorophyll 6 cdc dong thuốc lá
mang các kiểu gen lục lạp khác nhau
Tên dòng Hàm lượng Hàm lượng chlorophyll
male, we) (mg/g TL tuct)
Chiorophyl | Chiorophyl Chiorophyll {a) (b) (atb) ; N plumbaginifolia 0,24 + 0,02 0,95 + 0,002 | 0.49 + 0,004 | 1.44 + 0,004 CT6-3.1.] 0,15 + 0,18 0.89 + 0.011 | 0.46 + 0.009 | 1.35 + 0.010 CT6-3.5.3 0,112+0.01 0/75 + 0,002 | 0.39 + 0.003 1.14 + 0.004 ị CT6-3.5.6 0,13 + 0.07 0.86 + 0,008 | 0,46 = 0,007 1,28 + 0.010 ¡ CT6-3.6.2 0,17 + 1,02 0,94 + 0,003 | 0,48 = 0.022 | 1,42 = 0,009 ! N tabacum 3.34 + 0,94 1,07 + 0,008 | 0.50 + 0.007 | 1.574 0.014 SRAIS 0.08 + 0,21 0.01 + 0.001 | 0.01 = 0.003 | 0,02 + 0.003 LS} 0.144011 0.08 + 0,004 | 0.05 + 0.008 | 0,14 + 0,006 LS.Sall 2 2,95 + 0,01 0,30 + 0,003 | 017 + 0,006 | 0,48 + 0,009 LS Sal] 3 3.02 + 1,91 0.37 + 0,005 | 0,29 + 0,004 | 059+ 0.017 LS Sal3f 2.77 + 1,65 0,29 + 0.003 | 0.15 + 0.003 | 0,45 + 0.006 LS.tub] 2,75 + 0,07 0,67 + 0.005 | 0,33 + 0,007 | 1.00= 0.059 | LS.tub3 0,88 + 0,02 0,43 = 0,013 | 0,25 + 0,008 | 0.69 = 0.016 Pp < 0.01 < 0,001 <0.001 | <0.00i r=0.7 p: Mức sai số có ý nghĩa
r: Hệ số tương quan giữa hàm lượng nicotin và chiorophylH
Quan sát số liệu trong bảng 6 ta thấy, hàm lượng nicotin cũng như chlo- rophyll ở trong ca 4 dòng thuốc lá N phưnbagiuifolia được chuyển một đoạn
Trang 19LpADN cta S nigrum déu thap hon cay N plumbaginifolia binh thường, đặc biệt 6 dong CT6-3.5.3 có hàm lượng nicotin thấp nhất Khi so sánh dong LS7 (chứa lục lạp đột biến, mẫn cảm với ánh sáng) với các dòng mang lục lạp của S sinuata (L§.Sall.2 LS.Sall.3, LS.Sal3.!) và các dòng chứa tái tổ hợp lục lap cla N tabacum voi $ tuberosum (LS.1ub], LS.tub3) chúng tôi lại thấy
tăng hàm lượng nicotin va chlorophyll cia các dong này cao hơn đáng kể sơ voi LS/ [tit 2.6 lần (Lsvub3) đến 21.5 lần (L§.Sai7.3)] Điều này chứng tỏ khi
dưa lục lạp ngoại lai hoặc tạo ra tái tổ hợp lục lạp mới trong cây thuốc lá có lục lap đột biến mãn cảm với ánh sáng thì có khả năng khói phục sự lục hoá và làm cho lá có màu xanh trở lại bình thường Nếu chỉ so sánh giữa các dòng chứa luc lap thuốc lá với nhau († sưmsun LSI SÑA15) thì những dòng chứa luc lạp đột biến (157, S&A17%) có hàm lượng mcotin và chỉorophyll thấp hơn
cây bình thường (7 samn) rất nhiều,
Mình 4: Mối liên quan giữa hàm lượng chỉorophvll với nicotin
ở cây N tabacum (Turkish samsun) va céc dong chuyén luc lap
Trang 20El Nictin thiropnv! mmq/g TL tươi ° & CT6-3.1.1 GT6-35.3 fic 762.56 F 76.462 © RE) & § a Ẹ 2 a =
Hình 5: M6i liên quan giữa hàm lượng chiorophyll với nicotin ở các đồng
N plumbaginifolia chuyén gen luc lap và cây đối chứng
Một điều khá lý thú là khi so sánh hàm lượng nicotin với chlorophyll ở những dòng mang các kiểu gen lục lạp khác nhau (bảng 6) chúng tôi thấy ở những dòng có cùng một kiểu gen lục lap thì dòng nào có hàm lượng chloro- phylÏ cao sẽ có hàm lượng nicorin cao (hình 4 5) Tinh toán hệ số tương quan (r) giữa hàm lượng chiorophyli và nicotin ở những dòng có cùng một kiểu gen lục lạp chúng tôi thấy r=0,7 Điều này chứng tỏ hai hàm lượng này có mối tương quan tỷ lệ thuận với nhau
Những kết quả nghiên cứu về hàm lượng đường khử cho thấy hầu hết
hàm lượng đường khử ở các đòng mang các kiểu gen lục lạp biến đổi đều thấp hơn những dòng bình thường Tuy nhiên riêng hai dòng $&A75 (bị đột biến lục lạp bạch tạng hoàn toàn) và dòng LŠ/ (đột biến lục lạp mẫn cảm với ánh sáng) thì hàm lượng đường khử lại có sự thay đối và tăng lên khá cao mặc dù hàm lượng nicotin va chlorophyll rất thấp (bảng 7) Theo chúng tôi, có thể hai dong này do có lục lạp bị đột biến, chỉ tồn tại được trong điều kiện thiếu ánh sáng và sống dị dưỡng hoàn toàn nên có những biến đổi không bình thường
Trang 21Khi nghiên cứu hàm lượng protein tổng số chúng tỏi thấy ở những dòng
tnang các kiểu lục lạp biến đổi cao hơn so với những đồng bình thường (bảng 8), Điều này, theo chúng tôi có thể là do khi các dòng tiếp nhận những tế hợp
lục lạp hoặc những đoạn LpADN ngoại lai thì đã xảy hiện tượng hoạt hoá gen kích thích khả năng tổng hợp protein trong cây Hơn nữa bản thân các dòng chuyển gen hoặc dung hợp là những dòng được chọn lọc trên môi trường có kháng sinh do đó có thể chúng phải tăng cường tích tụ protein để góp phản
bảo vệ cơ thể khỏi điều kiện bất lợi của môi trường
Trang 22Bảng 8: Hàm lượng protein của các dòng mang các kiểu gen lục lạp khác nhau Tên dong Hàm luong protein (mg/g TL khô) N, plumbaginifolia 57,14 + 0,12 CT6-3.1.1 74,16 + 0,05 CT6-3.5.3 77,06 + 0,01 CT6-3.5.6 58,29 + 0.09 CT6-3.6.2 92,19 + 0,03 N tabacum 54,81 + 0.06 (Turkish samsun} LSI 56,53 + 0,20 SRAIS 55,21 > 0,06 LS Sall 2 85,35 + O17 LS Sal3.} 121,63 + 0.09 LS.tub] 98,29 + 0.10 LS.tub3 87,20 + 0,08 p <0,01 p: Mức sai số có ý nghĩa
Tóm lại những kết quả nhận được trong bản luận văn của chúng tôi đã kháng định sự định hướng đúng trong việc sử dụng cóng nghệ tế bào thực vật (dung hợp protoplast, chuyển gen vào lục lạp thông qua protoplast nhờ xử lý với PEG) để cải biến di truyền TBC (chủ yếu ở lục lạp) trong cây thuốc lá nhằm phục vụ cho nghiền cứu và cải tạo giống cây trồng Đồng thời những kết quả này còn đặt cơ sở khoa học cho những hướng nghiên cứu tiếp theo về di truyền TBC ở thực vật bậc cao
Trang 23KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu nhận được trong bản luận văn này chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1 Bằng kỹ thuật dung hop protoplast gitia N tabacum (PH) va S nig- rum, có thể nhận được những dòng thuốc lá lai TBC có hình thái, thời gian ra
hoa kết quả và số lượng nhiễm sắc thể giống với N, ?abacum (2n=48) đông
thời mang những đặc điểm lục lạp ngoại lai (kháng strepfomycin và spectino-
myein) ổn định qua ba thé hé R, R, R,)
2 Thong qua viéc phan tích enzym cắt giới hạn, đã chứng minh được 3 dòng lai TBC mang LpADN tái tổ hợp của cả hai loài W izbacưm Và Š ng- rum Diéu nay góp phần khắc phục tính bất hợp giữa hệ gen nhân và hệ gen TBC trong những tổ hợp lai có khoảng cách xa nhau về mặt phân loại
3, Nhờ kỹ thuật chuyển gen trực tiếp vào protoplast thông qua việc xử lý với PEG, có thể nhận được những dòng thuốc lá A' phưnbaginjfolia chuyển
gen lục lạp có hình thái và số lượng nhiễm sắc thể giống với N phưnbagini- #olia không chuyển gen (2n=20) chúng có khả năng phát triển bình thường và
hữu dục Đồng thời đã duy trì được tính kháng cả hai loại kháng sinh strep- tomycin va spectinomycin (là những đột biến lục lạp cha S nigrum) qua ba thé
hé Ry, Ry, Ry
4 Bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymeraza (PCR) với cập mổi (primer)
đặc hiệu cho § zigrum chúng tôi đã chứng mình được sự có mặt ồn định của một đoạn LpADN (khoảng 800 cập bazơ) của Š zzgrzn trong bốn dòng thuốc lá N plumbagimifolia chuyển gen qua ba thế hệ Rạ, Rị, Rạ
5 Hàm lượng nicotin chiorophbyll có những thay đổi rõ rệt trong các dòng thuốc lá mang hệ gen lục lạp khác nhau Việc chuyển lục lạp ngoại lai vào các đòng thuốc lá mang đột biến lục lạp mẫn cảm với ánh sáng đã khói phục khả năng lục hoá của cây đồng thời làm tăng hàm lượng chlorophyll va
Trang 24nicotin trong cây bị đột biến sắc tố Trong các dòng thuốc lá mang cùng một kiểu gen lục lạp, dòng nào có hàm lượng chlorophyli cao thì hàm lượng mico- tin cũng cao và như vậy giữa hai hàm lượng này có mối tương quan tỷ lệ thuận với nhau (hệ số tương quan r = Ú.7) Hàm lượng đường khử trong các dòng thuếc lá mang các kiểu gen lục lạp khác nhau thấp hơn các dòng đối chứng
Ngược lại hàm lượng protein tổng số trong các dòng có sự biến đổi lục lạp lại
cao hơn ở những dòng đối chứng
KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục sử dụng kỹ thuật dưng hợp protoplast dé tạo những cây lai TRC giữa các tổ hợp lai có khoảng cách xa nhau trong hệ phân loại (đặc biệt cần quan tâm đến các giống cây trồng)
- Phân lập các gen tế bào chất có ý nghĩa thực tiễn và chuyển những gen
đó vào cây trồng bằng những phương pháp chuyển gen phù hợp
Trang 25NHUNG CONG TRINH DA CONG BO LIEN QUAN DEN LUẬN ÁN
1 Nguyen Due Thanh Nghiem Ngoc Minh, and Peter Medgyesy
Chloroplast gene transfer by recombination and transformation in Nicotiana Proceedings của hội nghị quốc tế lần thứ 4 về Cóng nghệ Sinh học khu vực Thái bình dương (Pacific Rim Biotechnology Conference), Tổ chức từ ngày 6 - 9, thang 2, nam 1995, tại Melbourne Australia Trang: 179
2 Nghiệm Ngọc Minh Nguyễn Đức Thành Lê Thị Muội Sự thay đối
hàm lyong nicotin, chlorophyll và đường khử ở các dòng thuốc lá có genom
luc lap khác nhau nuôi cấy trong điều kiện ¿n vitro Ky yéu Vién Cong nghé Sinh học (Annual Report) 1996 Nhà xuất bản KHKT (1997) Trang: 35 - 4]
3 Nguyen Duc Thanh, Nghiem Ngọc Minh, Peter Medgyesy Tony Kavanagh, Philip J Dix and Le Thi Muoi Direct chloroplast gene transfer into protoplast of Nicotiana plumbaginifolia Tém tat bao cdo tai hội nghi quốc tế lần thit 5 về Sinh học phân tử thực vật Tổ chức từ ngày 2l - 27 tháng 9, năm 1997 ở Singapore Số abstracts: 1211 ,
4 Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Đức Thành, Lê Thị Muội và Medgvesy
Peter Những kết quả bước đâu về việc tạo cây lai tế bào chất giữa Nicotiana tabacum va Solanum nigrum bang dung hop protoplast Ky yéu Vién Cong nghé Sinh hoe (Annual Report) 1997 Nha xudt ban KHKT (1998) Trang: 246 - 252
5 Nguyễn Đức Thành, Nghiêm Ngoc Minh, Lê Thị Muội Chuyển gen
luc lap cha Solanum nigrum vao cay thuốc 14 Nicotiana plumbaginifolia Ky yếu Viện Công nghệ Sinh học (Annual Report) 1997 Nha xuat ban KHKT
(1998) Trang: 239- 245
Trang 26transformed plants Proccessding of the NCNST of Vietnam, Vol 10, No 2 (1998) pp 1-5
7, Nghiém Ngoc Minh, Nguyén Đức Thành, Lê Thị Muội (1999) Sự duy
trì và biểu hiện ổn định của các gien lục lạp ngoại lại trong cây thuốc lá
Nicotiana plumbaginifolia bién nap qua cdc thé hé R, Rj D4 gui dang 6 tap
chi Sinh hoc
§ Nghiêm Ngoc Minh, Nguyễn Đức Thành Lê Thị Muội (1999) Gen kháng kháng sinh của Nicotiana tabacum được chuyển nạp vào Solanum migrum thông qua tái tổ hợp ADN lục lạp Đã gửi đăng ở tạp chí Khoa học và công nghệ