THỤ TINH NHÂN TẠO IVF - Ảnh hưởng của môi trường và phương pháp thu nhận đến việc ổn định tế bào sinh dục chuẩn bị cho thụ tinh IVF

Ở sinh vật đa bào, cơ thể được cấu trúc, tổ chức chặt chẽ theo hệ thống: tế bào -mô - cơ quan - cơ thể. Trước đây người ta cho rằng, hầu hết các tế bào chỉ có thể tồn tại và thực hiện chức năng bên trong cơ thể sống hoàn chỉnh. Thế nhưng, công nghệ nuôi cấy tế bào đã mở ra khả năng đặc biệt mà theo đó các tế bào có khả năng tồn tại độc lập bên ngoài cơ thể nhưng vẫn đảm bảo được nhiều chức năng sinh học của chúng. Nuôi cấy tế bào chính là kỹ thuật để tạo, nuôi và giữ nguồn tế bào trong điều kiện nhân tạo. Trên đối tượng động vật bậc cao, các nhà nghiên cứu đã rất thành công khi nuôi cấy và sử dụng các dòng tế bào sinh dưỡng (tế bào da, cơ, thần kinh, gan, thận...) hay các khôi mô, cơ quan cơ thể và sử dụng chúng trong các mục đích y, sinh học, nông nghiệp, bảo tồn. Thành công của kỹ thuật thụ tinh in vitro ở người đã mang đến niềm vui và hạnh phúc cho bao cặp vợ chồng hiếm muộn trên thế giới. Ở vật nuôi, người ta có thể thu nhận nguồn phôi dồi dào phục vụ cho các nghiên cứu khác như nhân bản động vật, tạo động vật chuyển gene, khai thác nguồn tế bào mầm... Hơn thế nữa, khả năng cấy chuyển phôi, chuyển gene, xác định giới tính của phôi trước khi cấy giúp tạo ra vật nuôi theo ý muốn đã không còn là điều mong ước. Các khả năng này giúp cho công tác chọn giống, tạo giống mới nhanh và có hiệu quả hơn. Đối tượng nghiên cứu là heo được giết thịt tại lò mổ. Và tại sao heo được chọn làm đối tượng nghiên cứu?. Heo là loài động vật có sức sinh sản cao trong mỗi lứa đẻ (7-10 con/lứa). Vấn đề nghiên cứu tạo phôi heo trong điều kiện in vitro là việc làm ít có ý nghĩa về mặt kinh tế, tuy nhiên, về mặt khoa học thì nghiên cứu này nhằm thu đượcnhững kết quả bước đầu về khả năng tạo phôi động vật trong điều kiện in vitro. Ngoài ra, một khi đã làm chủ được khả năng tạo phôi in vitro thì vấn đề khai thác nguồn phôi này để ứng dụng vào các nghiên cứu về sau sẽ được chủ động hơn. Đó là lý do em thực hiện đề tài: “ Ảnh hưởng của môi trường và phương pháp thu nhận đến việc ổn định tế bào sinh dục chuẩn bị cho thụ tinh IVF”. Nội dung đề tài: - Thu nhận giao tử đực và cái. - Nuôi và đánh giá trứng trên môi trường KSOM, môi trường M16, môi trường KSOM bổ sung 10% dịch nang trứng. - Thu nhận tinh trùng từ phương pháp Swim – up và phương pháp Simple wash. - Thử nghiệm IVF.

SVTH: NGUYỄN THANH VŨ 1

PHẦN MỞ ĐẦU

Ở sinh vật đa bào, cơ thể được cấu trúc, tổ chức chặt chẽ theo hệ thống: tế bào

-mô - cơ quan - cơ thể Trước đây người ta cho rằng, hầu hết các tế bào chỉ có thể tồn tại và thực hiện chức năng bên trong cơ thể sống hoàn chỉnh Thế nhưng, công nghệ nuôi cấy tế bào đã mở ra khả năng đặc biệt mà theo đó các tế bào có khả năng tồn tại độc lập bên ngoài cơ thể nhưng vẫn đảm bảo được nhiều chức năng sinh học của chúng Nuôi cấy tế bào chính là kỹ thuật để tạo, nuôi và giữ nguồn tế bào trong điều kiện nhân tạo

Trên đối tượng động vật bậc cao, các nhà nghiên cứu đã rất thành công khi nuôi cấy và sử dụng các dòng tế bào sinh dưỡng (tế bào da, cơ, thần kinh, gan, thận ) hay các khôi mô, cơ quan cơ thể và sử dụng chúng trong các mục đích y, sinh học, nông

nghiệp, bảo tồn Thành công của kỹ thuật thụ tinh in vitro ở người đã mang đến niềm

vui và hạnh phúc cho bao cặp vợ chồng hiếm muộn trên thế giới

Ở vật nuôi, người ta có thể thu nhận nguồn phôi dồi dào phục vụ cho các nghiên cứu khác như nhân bản động vật, tạo động vật chuyển gene, khai thác nguồn tế bào mầm Hơn thế nữa, khả năng cấy chuyển phôi, chuyển gene, xác định giới tính của phôi trước khi cấy giúp tạo ra vật nuôi theo ý muốn đã không còn là điều mong ước Các khả năng này giúp cho công tác chọn giống, tạo giống mới nhanh và có hiệu quả hơn

Đối tượng nghiên cứu là heo được giết thịt tại lò mổ Và tại sao heo được chọn làm đối tượng nghiên cứu? Heo là loài động vật có sức sinh sản cao trong mỗi lứa đẻ

(7-10 con/lứa) Vấn đề nghiên cứu tạo phôi heo trong điều kiện in vitro là việc làm ít

có ý nghĩa về mặt kinh tế, tuy nhiên, về mặt khoa học thì nghiên cứu này nhằm thu

đượcnhững kết quả bước đầu về khả năng tạo phôi động vật trong điều kiện in vitro Ngoài ra, một khi đã làm chủ được khả năng tạo phôi in vitro thì vấn đề khai thác

nguồn phôi này để ứng dụng vào các nghiên cứu về sau sẽ được chủ động hơn Đó là

lý do em thực hiện đề tài: “ Ảnh hưởng của môi trường và phương pháp thu nhận đến việc ổn định tế bào sinh dục chuẩn bị cho thụ tinh IVF”

Nội dung đề tài:

- Thu nhận giao tử đực và cái

- Nuôi và đánh giá trứng trên môi trường KSOM, môi trường M16, môi trường KSOM bổ sung 10% dịch nang trứng

- Thu nhận tinh trùng từ phương pháp Swim – up và phương pháp Simple wash

- Thử nghiệm IVF

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về đối tượng nghiên cứu

Lợn nhà hay lợn nuôi là một gia súc được thuần hóa, được chăn nuôi để cung cấp thịt Hầu hết lợn nhà có lớp lông mỏng trên bề mặt da

Hình 1.1 Lợn (Sus scrofa domesticus)

- Phân loài: S s domesticus

1.2 Lịch sử phát triển của thụ tinh trong ống nghiệm[4], [12]

1.2.1 Những thí nghiệm đầu tiên về IVF

IVF được tiến hành lần đầu tiên trên thỏ bởi Dauzier và cộng sự (cs) (1954).Kỹ thuật này được Brackett ứng dụng và phát triển vào chăn nuôi bò sữa từ 1982.Từ đó, IVF được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi ở các nước chăn nuôi phát triển

Thỏ 1954-1959 Dauzier, Thibault Chang Chuột túi má 1963 Yanagimachi và Chang

Bảng 1.1 Những thí nghiệm đầu tiên về thụ tinh IVF ở động vật

1.2.2 Lịch sử nuôi phôi heo Invitro

Heo là động vật được quan tâm đặc biệt vì trong buồng trứng của chúng có chứa

số lượng lớn (hơn 200.000) các nang trứng sơ cấp (primordialfollicles)

Trong những năm đầu thập kỷ 1980, người ta đã thu được các phôi invivo từ các

con heo dạng “động vật cho” và các phôi trên có thể nuôi phát triển từ giai đoạn 4 tế bào đến giai đoạn phôi nang (blastocyst)

Sau đó, những hiểu biết về đặc điểm phát triển của trứng heo đã giúp hình thành

các loại môi trường nuôi trứng chín trong điều kiện in vitro

Năm 1986, Chan và cs đã thành công trong việc tạo phôi heo in vitro.Sau đó, kỹ thuật nuôi phôi thụ tinh invitro giai đoạn 2 tế bào đến giai đoạn blastocyst đạt được thành

công

Đến nay, khả năng tạo được động vật con từ quá trình thụ tinh trong ống nghiệm

của trứng nuôi chín invitro đã thành công.Tuy nhiên, khả năng tạo trứng chín in vitro

phục vụ qui trình tạo phôi vẫn chưa hoàn chỉnh Do đó, mục tiêu chính của thập kỷ qua là

tập trung vào nghiên cứu khả năng tạo được trứng chín in vitro

1.3 Cơ sở khoa học của thụ tinh trong ống nghiệm

Trong sinh sản hữu tính ở động vật bậc cao, thụ tinh là quá trình kết hợp giữa tinh trùng và trứng để tạo ra một tế bào mới gọi là hợp tử, hợp tử sẽ phát triển thành cơ thể mới.Quá trình này xảy ra bên trong cơ thể mẹ

Thụ tinh trong ống nghiệm là quá trình do con người tiến hành kết hợp giữa tinh trùng với trứng để tạo ra hợp tử, được thực hiện bên ngoài cơ thể mẹ Sau đó, hợp tử được chuyển vào tử cung để phát triển thành cơ thể

1.3.1 Hệ sinh dục động vật hữu nhũ [1], [2]

1.3.1.1 Hệ sinh dục cái

Hệ sinh dục cái của một số động vật tuy có khác nhau ở một số chi tiết nhưng chủ yếu gồm những cấu trúc cơ bản sau: buồng trứng, hệ thống ống dẫn, tử cung, âm đạo và các bộ phận sinh dục bên ngoài

 Buồng trứng: dạng cặp nằm hai bên tử cung, dự trữ các nang trứng

 Vòi tử cung: nơi dẫn trứng và diễn ra sự thụ tinh

 Tử cung: cơ quan để hợp tử làm tổ và phát triển

 Âm đạo: cơ quan giao hợp

 Âm hộ: là cơ quan sinh dục nằm ngoài cơ thể nối liền với âm đạo

Buồng trứng động vật hữu nhũ là cơ quan dự trữ các tế bào mầm sinh dục và noãn bào được hình thành trong giai đoạn phôi thai Chức năng đặc biệt của buồng trứng là sử dụng lần lượt các nang trứng dự trữ này đến khi cạn kiệt và điều tiết hormone.Buồng trứng đảm bảo cho các noãn lớn lên đều đặn rồi rụng trứng, đồng thời nó chuẩn bị cho tử cung tiếp nhận những trứng đã được thụ tinh

Số lượng nang trứng dự trữ trong buồng trứng ở các loài có sự khác nhau và phát triển dần trong quá trình lớn lên của cá thể, càng lớn tuổi thì số nang trứng có hiệu quả càng ít Ở bò, có hơn 100.000 nang trứng lúc mới sinh, sau 9 năm giảm còn 2.500 nang

trứng; ở heo, có hơn 200.000 nang trứng sơ cấp ở buồng trứng; ở người, khi sơ sinh có khoảng 30.000 - 300.000 nang trứng nguyên thủy, khi trưởng thành còn 400-500 nang

1.3.1.2 Hệ sinh dục đực

Gồm các cấu trúc cơ bản sau:

 Tinh hoàn: dạng cặp, nằm trong bìu có nhiều ngăn, tiết tinh trùng

 Mào tinh: nối với tinh hoàn, đường dẫn của tinh trùng

 Ống dẫn tinh: nối với mào tinh

 Túi tinh: nơi chứa tinh và tiết dịch trộn với tinh trùng tạo tinh dịch

 Tuyến tiền liệt: tiết dịch có trong thành phần của tinh dịch

 Niệu đạo: nằm trong dương vật, tinh trùng phóng ra ngoài qua niệu đạo Ngay trước thời điểm phóng tinh, tinh trùng di chuyển từ mào tinh vào ống dẫn tinh, ống phóng tinh và niệu đạo để ra ngoài.Trên đường đi, tinh trùng được hòa với các dịch tiết từ các tuyến phụ để tạo thành tinh dịch

1.4 Quá trình sinh giao tử

1.4.1 Quá trình sinh noãn[ 1], [3]

Một noãn bào trưởng thành và sẵn sàng cho sự thụ tinh khi nó được phóng thích từ một nang noãn trưởng thành của buồng trứng Sự trưởng thành của noãn có liên hệ mật thiết với sự trưởng thành của các nang noãn

1.4.1.1 Sự hình thành và phát triển nang noãn

Hình thành nang trứng là quá trình diễn biến nối tiếp của các giai đoạn phát triển khác nhau của nang trứng từ khi ra khỏi nơi dự trữ, phát triển thành tế bào trứng Quá trình diễn ra như sau: từ những nang trứng nguyên thủy (primordial iollicle) trở thành nang quá độ là giai đoạn chuyển tiếp cho sự hình thành nang trứng sơ cấp (preantral follicle) đến nang thứ cấp (antral follicle)

Sự tăng trưởng và thành thục của nang trứng trong buồng trứng thể hiện hàng loạt

sự biến đổi ở mức phân tử các thành phần khác nhau của nang như noãn bào, lớp tế bào hạt và lớp tế bào vỏ Các hiện tượng này được chi phối bởi những nhân tố khác nhau bên trong buồng trứng, bên trong nang và những tín hiệu hormone

Hình 1.2 Cấu trúc một nang noãn trưởng thành trước khi phóng noãn

1.4.1.2 Nội tiết của nang tăng trưởng

Sự tăng trưởng, thành thục, rụng trứng và hoàng thể hóa của nang trưởng thành phụ thuộc vào các yếu tố:

1.4.1.3 Sự hình thành và phát triển của noãn

Sự phát triển của noãn gồm 4 giai đọan:

 Sự di chuyển của các tế bào mầm vào cơ quan sinh dục

 Sự gia tăng số lượng tế bào mầm bằng nguyên phân

 Sự giảm chất liệu di truyền bằng giảm phân

 Sự trưởng thành về cấu trúc và chức năng của noãn

Trong quá trình giảm phân của noãn có 2 giai đoạn noãn ở trạng thái ngừng tăng trưởng (block):

 Block thứ nhất khi noãn bước vào giai đoạn tiền kỳ (prophase) của giảm phân I, cho ra noãn sơ cấp ở giai đoạn túi mầm (germinal vesicle- GV) Các noãn sẽ vượt qua giai đoạn này khi có sự xuất hiện của đỉnh LH tức khi cá thể đến tuổi trưởng thành sinh dục

 Block thứ hai khi ở giai đoạn trung kỳ (metaphase-MI) của giảm phân II (MII), cho ra noãn thứ cấp ở giai đoạn MII Noãn chỉ vượt qua được giai đoạn MII khi có sự thụ tinh của tinh trùng

1.4.1.4 Mối tương quan giữa kích thước nang và sự phát triển của noãn Khả năng một nang noãn sơ cấp tiếp tục phân chia giảm nhiễm để tiến tới giai đoạn trưởng thành (MII) và phóng noãn phụ thuộc mật thiết vào kích thước của nang

chứa noãn đó Các thí nghiệm in vitro và in vivo đều cho thấy noãn sơ cấp không thể tiếp

tục phân chia giảm phân nếu noãn còn trong nang nguyên thủy hay nang sơ cấp Chỉ có những noãn GV được chứa trong nang trước phóng noãn có kích thước bình thường mới

có khả năng tiếp tục phân chia giảm phân để trưởng thành.Những noãn GV chứa trong nang thứ cấp chỉ có thể tiếp tục phân chia giảm phân đến giai đoạn MI, sau đó dừng lại Đây là cơ sở cho việc thu nhận các loại nang trứng đạt kích cở trưởng thành từ buồng

trứng, phục vụ cho việc nuôi cấy in vitro

1.4.2 Sự trưởng thành của noãn

1.4.2.1 Sự trưởng thành của nhân

Ngay sau quá trình giảm phân, noãn GV sẽ đi qua các giai đoạn: tan biến túi mầm (GVBD); metaphasel (MI) và metaphase II (Mll), sau cùng là sự phóng noãn Thời gian noãn trưởng thành qua các giai đoạn này sẽ khác nhau tùy loài, ở người, noãn GV trải qua giai đoạn GVBD 15 giờ, metaphase I (MI) 20 giờ và metaphase II (MII) 35 giờ sau đỉnh LH.Sự phóng noãn xảy ra khoảng 38 giờ sau đỉnh LH.Ở bò, từ giai đoạn GV đến giai đoạn MII mất khoảng 19 giờ.Ở heo, thời gian này mất khoảng 38 giờ

Chính sự khác nhau cơ bản về thời gian trưởng thành của noãn là cơ sở cho việc

giải thích tại sao để nuôi trưởng thành các tế bào trứng trong điều kiện in vitro cần

khoảng 18-20 giờ ở bò và 38-44 giờ ở heo [15]

1.4.2.2 Sự trưởng thành của tế bào chất

Trong quá trình này, các bào quan trong tế bào chất được tổ chức lại chuẩn bị cho quá trình thụ tinh và sự tổng hợp protein cũng được sắp xếp để chuẩn bị cho sự phát triển của phôi.Như vậy, sự trưởng thành về nhân và tế bào chất là tiêu chuẩn cho sự trưởng

thành của trứng trong điều kiện in vivo Đây cũng là cơ sở thu nhận các trứng trưởng thành trong điều kiện in vitro

1.4.2.3 Sự phóng noãn [7]

Sự phóng noãn xảy ra vào cuối kỳ tăng trưởng, ở giai đoạn này, nang trứng trội có khả năng đáp ứng với sự tăng lên mạnh và đột ngột của các kích dục tố bằng sự thay đổi hoàn toàn cấu trúc của nó, dẫn đến hiện tượng rách nang và giải phóng noãn bào Đồng thời, trong noãn bào xảy ra những thay đổi đáng kể tạo ra một noãn bào trưởng thành hoàn toàn sẵn sàng cho sự thụ tinh:

 Noãn tách rời khỏi màng trong, tạo ra khoảng trống quanh noãn hoàng

 Trong nhân của noãn, các nhiễm sắc thể kết thúc giảm phân I, thể cực thứ nhất được phóng thích vào khoảng trống quanh noãn hoàng

 Giảm phân II khởi động rồi dừng lại ở trung kì II

 Giảm phân II chỉ tiếp tục sau khi thụ tinh cùng với sự phóng thích thể cực

thứ hai Noãn không thụ tinh sẽ bị thoái hóa Mỗi trứng rụng được bao xung quanh bởi màng trong suốt và các tế bào quanh noãn Các tế bào quanh noãn sẽ tiếp tục biệt hóa thành tế bào tiết steroid để duy trì sự mang thai nếu trứng được thụ tinh

1.5 Quá trình sinh tinh[1], [2], [5], [7]

Tinh trùng được hình thành từ ống sinh tinh trong tinh hoàn Đây là loại tế bào thích ứng với chức năng vận chuyển và mang bộ gen đơn bội

1.5.1 Cấu tạo tinh trùng

Mặc dù tinh trùng có hình dạng khác nhau tùy từng loài Nhưng tinh trùng có cấu tạo cơ bản gồm: đầu, cổ, thân và đuôi

1.5.1.1 Phần đầu

Ngay sau khi các tiền tinh trùng được hình thành chúng vẫn có những đặc điểm của các tế bào biểu mô nhưng sau đó nhanh chóng tăng chiều dài để hình thành tinh trùng với cấu trúc cơ bản gồm bốn phần: phần đầu, phần cổ, phần thân và phần đuôi

 Thể đỉnh (Acrosome): Hai phần hai mặt ngoài phía trước của đầu tinh trùng được bao bọc bởi một “mũ” dày gọi là acrosome hình thành từ bộ máy Golgi Acrosome chứa các enzyme thủy phân như là hyaluronidase và proteolytic enzyme có khả năng phân giải protein Những enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập của tinh trùng vào trứng

1.5.1.2 Phần cổ

Phần cổ của tinh trùng chủ yếu có các trung tử đầu và trung tử đuôi Rất ngắn, co

lại, gắn vào chỗ lõm ở đáy phía sau của thân, chứa nhiều ti thể để cung cấp năng lượng cho đuôi hoạt động Khớp cổ rất lỏng lẻo, nên khi tinh trùng đã lọt vào trong trứng thì cổ

sẽ tách đầu ra khỏi thân và đuôi dễ dàng

1.5.1.3 Phần thân

Gồm có sợi trực và tế bào chất bao quanh, có tiết diện to hơn phần đuôi Trong đó

ti thể chiếm gần hết tế bào chất và được xếp theo dạng xoắn ốc bao quanh sợi trục Ti thể chứa enzyme oxy hóa và oxyphosphoryl hóa và các chất khác tham gia vào quá trình chuyển hóa và dự trữ năng lượng quan trọng cho tinh trùng

1.5.1.4 Phần đuôi

Cấu tạo chủ yếu là sợi trục gồm đuôi chính và chóp đuôi.Lông roi kéo dài từ đuôi cho đến trung thể của thân Cấu trúc trung tâm gồm 11 vi ống được gọi là trục cấu trúc và được bao phủ bởi một màng mỏng Trung tử hình thành vi ống của đuôi tinh trùng Ti thể quấn chặt lông roi, cung cấp ATP cho đuôi.Đuôi đảm bảo có thể chuyển động Lúc di động liên quan đến sự trượt của vi ống sợi trục, sự di chuyển được thực hiện nhờ chuyển động co duỗi, lượn sóng và đập đuôi

Đuôi của tinh trùng có ba cấu phần chính:

- Cấu trúc xương trung tâm gồm 11 vi ống gọi là axoneme

- Màng tế bào rất mỏng bao bọc axoneme

- Hệ thống ti thể xung quanh axoneme gần phần trước của đuôi (phần giáp cổ tinh trùng)

Vận động của đuôi tinh trùng (theo kiểu vận động của các roi) giúp tinh tùng di chuyển được Việc này do các vi ống ở phía trước và phía sau của axoneme trượt theo chiều dọc Năng lượng cần thiết cho quá trình vận động do các ATP tổng hợp trong ti thể cung cấp Tinh trùng bình thường vận động tiến tới với tốc độ 1 ÷ 4 mm/phút.Với khả năng vận động này tinh trùng có thể di chuyển trong đường sinh dục của nữ giới để tìm gặp trứng

1.5.2 Sự sinh tinh trùng

Sự sinh tinh trùng gồm 4 giai đoạn:

 Sinh sản: tinh nguyên bào ở màng đáy tiến hành phân chia nguyên nhiễm nhiều đợt, tạo ra các dạng tinh nguyên bào A và B Tinh nguyên bào B là tiền thân của các tinh bào

 Sinh trưởng: là giai đoạn của những tinh bào sơ cấp Chúng tăng về kích thước và trong nhân tế bào hình thành từng đôi nhiễm sắc thể

 Phát triển: có 2 kỳ phân chia liên tiếp, tinh bào sơ cấp phân chia thành tinh bào thứ cấp, từ đó phân chia lần 2 thành hai tinh tử Như vậy, 1 tinh nguyên bào phân chia thành 4 tinh tử

 Thành thục: tinh tử trải qua giai đoạn tạo hình tinh trùng và trở thành tinh trùng là thể có chức năng để gặp và kết hợp được với trứng

1.5.2.1 Đặc điểm quá trình sinh tinh

Trong các đợt phân bào, sự phân chia tế bào chất không triệt để Do đó, các tế bào hợp thành thể hợp bào và giữ liên hệ nhau qua các cầu nối tế bào chất Qua đó, các ion và phân tử có thể lưu thông qua tất cả các tế bào giúp tinh trùng trưởng thành đồng bộ

1.5.2.2 Sự trưởng thành của tinh trùng trước khi thụ tinh

Tinh trùng có khả năng thụ tinh phải trải qua quá trình “kiện toàn năng lực thụ tinh” hay “ sự hoạt hóa tinh trùng”, bởi vì sau khi phóng tinh, tinh trùng có thể di động nhưng chưa có khả năng thụ tinh Sự kiện toàn năng lực thụ tinh được thực hiện khi tinh trùng di chuyển trong đường sinh dục cái, thông qua các giai đoạn biến đổi: quá trình khả năng hóa, sự tăng động và phản ứng cực đầu

 Phản ứng khả năng hóa: làm thay đổi chất bên trong và trên bề mặt tế bào

Do đó, làm màng tế bào mất ổn định và có thể thực hiện phản ứng cực đầu (thể đỉnh)

 Phản ứng tăng động: là kết quả của phản ứng khả năng hóa làm tinh trùng thay đổi kiểu di động

 Phản ứng cực đầu: đây là phản ứng kích thích sự gia tăng nồng độ Ca2+ngoại bào liên quan đên việc tái tổ chức lại lớp màng ở phần đầu tinh trùng Sau phản ứng này, các enzyme thủy giải từ đầu tinh trùng được giải phóng, đồng thời để lộ ra các vị trí gắn với màng trong suốt giúp tinh trùng xâm nhập vào trứng

1.6 Sự thụ tinh và phát triển phôi[5], [10]

1.6.1 Sự thụ tinh

Gồm 5 bước:

 Tinh trùng gắn với lớp màng trong suốt của trứng

 Tinh trùng thực hiện phản ứng cực đầu

 Tinh trùng xâm nhập vào bên trong màng trong suốt

 Tinh trùng gắn vào lớp màng bào tương của trứng

 Sự hợp màng giữa trứng và tinh trùng và hình thành tiền nhân

1.6.1.1 Tinh trùng gắn với lớp màng trong suôt của trứng

 Tinh trùng xuyên qua lớp cumulus

Trước khi một tinh trùng xâm nhập được vào tế bào trứng, có rất nhiều (hàng trăm) tinh trùng bám quanh một trứng Chúng tiết ra enzyme hyaluronidase phân hủy lớp tế bào quanh noãn (gồm nhiều vòng tế bào curnulus bao bên ngoài và một vòng rộng các tế bào vành tia - corona radiate)

 Tinh trùng gắn với lớp màng trong suốt

Màng trong suốt là một lớp vỏ ngoại bào bao quanh trứng có thành phần chính là glycoprotein, gồm ZPi (200kD), ZP2 (120kD) và ZP3 (83kD)

Trong quá trình khả năng hóa, màng bào tương của tinh trùng bị mất cholesterol trở nên lỏng lẻo, làm cho các thụ quan (receptor) di chuyển tự do trên bề mặt của màng

và tập trung về phía đỉnh đầu của tinh trùng, nhờ đó chúng dễ dàng gắn với các ligand trên bề mặt màng trong suốt Khi tiếp xúc với màng trong suốt, các receptor này lập tức liên kết với các ligand glycoprotein trên màng trong suốt, cụ thể là với ZP3.Sự gắn giữa các cặp receptor - ligand này mang tính đặc hiệu loài cao.Sau sự gắn kết, đầu tinh trùng được gắn chặt trên bề mặt màng trong suốt và thực hiện các phản ứng cần thiết cho sự xâm nhập của tinh trùng vào bên trong trứng

1.6.1.2 Tinh trùng thực hiện phản ứng cực đầu

Nồng độ ion Ca2+ và phân tử ZP trên màng trong suốt được xác định có vai trò khởi động phản ứng cực đầu.Kết quả của phản ứng làm phơi bày các thụ quan có khả năng gắn với màng trong suốt

1.6.1.3 Tinh trùng xâm nhập vào bên trong màng trong suốt

Có sự thể hiện vai trò của ZP2 trong sự gắn thứ cấp giữa tinh trùng và trứng sau khi lớp màng ở đỉnh đầu tinh trùng bị tách khỏi tinh trùng làm cho sự liên kết giữa tinh trùng và noãn bị gián đoạn Tiếp theo, các enzyme acrosin từ đầu tinh trùng được phóng thích sẽ thủy giải các phân tử glycoprotein trên bề mặt màng trong suốt, làm thay đổi cấu trúc của màng trong suốt, tạo thành một lỗ nhỏ cho tinh trùng chui vào Mặt khác, enzyme acrosin có vai trò phá hủy các vị trí liên kết của tinh trùng trên màng trong suốt.Cơ chế này giúp ngăn cản sự thụ tinh đa tinh trùng

1.6.1.4 Tinh trùng tiếp xúc với màng bào tương

Sau khi qua màng trong suốt, đầu tinh trùng di chuyển vào khoang quanh noãn.Tinh trùng trở nên bất động trước khi hợp màng với trứng.Sự hợp màng xảy ra giữa màng bào tương của tinh trùng với màng bào tương của trứng.Màng trong thể đỉnh được liên kết chặt chẻ với nhân tinh trùng bên trong bào tương trứng, còn đuôi tinh trùng tách khỏi phần đầu và cổ, rồi phân hủy dần bên trong bào tương trứng

1.6.1.5 Sự hình thành tiền nhân

 Sự hình thành tiền nhân

Ngay sau quá trình hoà nhập, vỏ bọc xung quanh nhân tinh trùng tiêu biến do tác động của các yếu tố trong bào tương của noãn Phân bào giảm nhiễm thứ hai được tiếp tục và kết quả giải phóng thể cực thứ hai.Nhiễm sắc thể trong noãn được bao bọc bởi một màng và tiền nhân cái được hình thành Chất nhiễm sắc ở đầu tinh trùng tan ra và cũng được bao bọc bởi một lớp vỏ và tiền nhân đực được hình thành

 Sự di chuyển của tiền nhân

Lúc mới hình thành, các tiền nhân tách riêng nhau: tiền nhân cái nằm ở dưới cực cầu thứ hai và tiền nhân đực nằm ở dưới vỏ chỗ tinh trùng xâm nhập Sau đó, cả 2 tiền nhân di chuyển về phía trung tâm của noãn.Quá trình di chuyển này có sự tham gia của các thoi vô sắc và các sợi actin trong cấu trúc của noãn Sau khoảng 20 giờ thụ tinh (tùy

loài) các tiền nhân đi tới trung tâm và nằm sát vào nhau Sau khoảng vài giờ, màng của các tiền nhân bị vỡ ra và các chất liệu di truyền của 2 giao tử hòa nhập với nhau, đây là

sự hòa hợp nhân

1.6.2 Sự phát triển phôi

1.6.2.1 Sự phân chia tế bào [2], [10]

Quá trình thụ tinh được hoàn tất dẫn đến sự hình thành phôi ở dạng một tế bào.Sau

đó phôi bắt đầu phân chia thành dạng 2, 4, 8, 16 tế bào.Các tế bào này- gọi là các nguyên bào phôi (blastomere) - ngày càng được phân chia nhiều hơn, nhỏ hơn và kết hợp lại thành khối rắn chắc được gọi là phôi dâu (morula).Sau giai đoạn này phôi hình thành dạng phôi nang (blastocyst) có sự tích lũy chất dịch bên trong tạo khôi cầu rỗng.Sau đó, blastocyst tiếp tục qua giai đoạn phôi nang trương nở (expanded blastocyst) và thoát khỏi màng trong suôi ở giai đoạn phôi nang nở (hatching blastocyst) và bắt đầu làm tổ trong tử cung

Nguyên bào phôi không cần các phân tử tín hiệu đặc trưng để khởi động quá trình phân chia Phôi tự điều hoà quá trình phân chia tế bào theo “đồng hồ” nội bào Chu kỳ tế bào sinh dưỡng và tế bào phôi đều giống nhau

1.6.2.2 Sự biểu hiện gene và tổng hợp protein ở phôi

Trước thụ tinh, noãn chín và rụng đã có cấu tạo sinh hóa hoàn chỉnh cho sự tổng hợp protein.Trong quá trình phát triển và trưởng thành trứng chứa đầy ribosome cơ quan nội bào tổng hợp protein, RNA ribosome (rRNA), RNA thông tin (mRNA) và RNA vận chuyển (tRNA).Quá trình phân chia tế bào đầu tiên không phụ thuộc vào sự tổng hợp RNA ở phôi Các thí nghiệm đã chứng minh, trong các chu kỳ phát triển tế bào ở giai đoạn sớm, sự chuyển hoá và tổng hợp protein hoàn toàn dưới sự kiểm soát các thông tin

mà trứng nhận được từ cá thể mẹ, gọi là sự chuyển tiếp thông tin từ mẹ sang hợp tử (material to zygote transition-MZT)

Giai đoạn truyền đạt thông tin di truyền từ mẹ sang phôi có ý nghĩa quan trọng về mặt sinh học và trong nuôi cấy các tế bào phôi Trên thực tế, giai đoạn này xuất hiện đồng thời với giai đoạn phôi ngừng phân chia trong điều kiện nuôi cấy còn thiếu một yếu

tố nào đó Phôi của một số loài chuột bị ức chế ở giai đoạn 2 tế bào, phôi bò bị ức chế ở giai đoạn 8 tế bào và phôi cừu bị ức chế ở giai đoạn 16 tế bào trong điều kiện in vitro Các thay đổi về điều kiện nuôi cấy nói chung làm giảm đi sự ức chế đặc trưng cho từng loài động vật Hiện nay người ta vẫn chưa biết được điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng tới sự truyền đạt thông tin từ mẹ sang phôi như thế nào và có hay không sự tham gia của các phân tử tín hiệu đặc trưng

1.7 Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

Quy trình thụ tinh trong ống nghiệm gồm các giai đoạn cơ bản [4]:

 Thu nhận và chọn lọc giao tử cái

 Thu nhận và chọn lọc giao tử đực

 Dung hợp các giao tử đực và cái

 Nuôi hợp tử phát triển thành phôi

 Chuyển phôi cho con cái nhận nuôi

Hình 1.4 Quy trình cơ bản của kỹ thuật IVF

1.7.1 Thu nhận giao tử cái[ 8]

Trứng có thể thu nhận từ động vật được kích hoạt bằng kích dục tố (KDT) hoặc từ buồng trứng động vật giết mổ Các KDT gây sự rụng trứng gồm cóPregnant-Mare‟s-Serum-Gonadotropin (PMSG) và Human Chorionic Gonadotropin (hCG)

Trứng thu nhận từ động vật được kích hoạt bằng KDT là những trứng thành thục (trứng chín) Trứng thu nhận từ buồng trứng động vật giết mổ là trứng chưa chín, do đó trứng cần nuôi trưởng thành trong môi trường Quá trình này gọi là quá trình nuôi trứng chín trong điều kiện invitro(invitro maturation – IVM)

1.7.2 Thu nhận trứng từ buồng trứng[6], [16]

Ở buồng trứng heo có các loại nang trứng có kích thước khác nhau: từ nhỏ (<3mm), đến trung bình (3-6mm), hay lớn (>6mm) Nhìn chung, tế bào trứng thu từ những nang trứng có kích thước trung bình thường sử dụng cho quá trình IVM Các trứng

từ những nang trứng này đang dừng lại ở metaphase I (M I) của phân bào giảm nhiễm.Khả năng chuyển tiếp M I thành M II có thể đạt được ở những tế bào trứng đã đạt tới kích thước trưởng thành

Tuy nhiên sự không đồng nhất của tế bào trứng thu từ những nang có kích thước khác nhau có thể ảnh hưởng đến quá trình phân bào giảm nhiễm, sự chín bào tương và khả năng phát triển sau đó Vì thế, một thời gian nuôi cấy trước lúc chín là cần thiết để cho phép các trứng từ những nang nhỏ hơn đạt tới giai đoạn có thể so sánh với trứng thu

từ những nang lớn hơn

Hiện nay, theo các quy trình IVF thường quy ở động vật hữu nhũ, các nang trứng

có đường kính 2-8mm hiện diện ở vùng vỏ của buồng trứng được sử dụng cho việc thu nhận các trứng chưa chín (Long và cs, 1993; Miyoshi và cs, 1999)

1.7.3 Phương pháp chọn tế bào trứng cho IVM[4]

Người ta nhận thấy, tế bào trứng thu từ các nang sơ cấp và nuôi ở điều kiện không

có lớp tế bào hạt (cumulus) sẽ tăng trưởng không tốt Ngược lại, khi trứng còn được bao quanh bởi các tế bào hạt thì khả năng tăng trưởng rất tốt Trong điều kiện này, các tế bào hạt còn kết dính với tế bào trứng thông qua các điểm nối mà qua đó trứng có được khả năng tăng trưởng và trở thành hoàn chỉnh để trải qua sự trưởng thành về nhân Vì thế, trong những hệ thống IVM các mối tương tác giữa trứng và tế bào hạt luôn được duy trì

Do đó, sự hiện diện các tế bào hạt là tiêu chuẩn để lựa chọn các tế bào trứng cho quy trình IVM

Trên cơ sở đó, cách phân loại trứng thu nhận từ buồng trứng được dựa trên độ dày, mỏng của tế bào hạt bao quanh trứng Trứng được phân làm 3 loại:

 Loại A: có từ 3-5 lớp tế bào cumulus bao kín quanh tế bào trứng

 Loại B: có ít hơn 3 lớp tế bào cumulus bao quanh một phần tế bào trứng

 Loại C: không có lớp tế bào cumulus bao quanh

Ở nhiều phòng thí nghiệm, trứng được lựa chọn cho quá trình IVM thường có từ

ba hoặc nhiều hơn các lớp tế bào cumulus bao quanh (trứng loại A và B) Ở một mức độ nhất định, mức độ dãn nở của cumulus có thể là một chỉ số của sự nuôi chín thành công nhân và tế bào chất [6]

Hình 1.5 Sự phân loại trứng thu nhận từ buồng trứng

1.7.4 Cơ sở đánh giá sự trưởng thành của trứng[6], [10], [12]

Nhìn chung, quá trình nuôi chín tế bào trứng có thể chia làm hai giai đoạn, đó là giai đoạn chín nhân và chín tế bào chất:

 Chín nhân là thuật ngữ chỉ sự phục hồi quá trình phân bào giảm nhiễm và những chuyển biến đến giai đoạn M II

 Chín bào tương là thuật ngữ liên quan đến các sự kiện khác: sự chuẩn bị cho trứng thụ tinh và phát triển trước làm tổ, định vị lại các tiểu thể của bào

tương, như ty thể và các tế bào hạt vỏ (cortical granules)

Sự chín nhân được xác định bởi sự phát triển của thoi vô sắc giai đoạn M II từ túi mầm.Theo Motlik và Fulkal (1976), đặc điểm hình thái của giai đoạn túi mầm (germinal vesicle stage) được lựa chọn để đánh giá sự chín invitro của trứng Do đó, sự xuất hiện thể cực là một tiêu chuẩn quan trọng cho việc đárih giá giai đoạn phát triển Đồng thời, để xác định sự trưởng thành tế bào chất, cần có những đo lường gián tiếp thông qua hàm lượng Glutathione (GSH) bên trong tế bào.Sự tổng hợp GSH trong khi nuôi chín tế bào trứng là điều kiện tiên quyết cho quá trình làm loãng nhiễm sắc chất ở nhân tinh trùng chuột và sự hình thành tiền nhân đực thành công

1.7.5 Thành phần môi trường nuôi chín trứng in vitro[2] [10] [14] [20]

1.7.5.1 Thành phần chính

- Nước

Nước là thành phần chính cho mọi môi trường Chất lượng của nước rất quan trọng, nước có chất lượng tốt phải qua hệ thống chưng cất, siêu lọc nhằm loại bỏ các chất khoáng và các loại ion tồn tại trong nước

- Nguồn năng lượng

Thực nghiệm cho thấy glucose, lactate, pyruvate là nguồn cơ chất năng lượng ngoại sinh quan trọng nhất cho trứng và phôi.Tuy nhiên, tùy giai đoạn phát triển mà trứng hoặc phôi có nhu cầu năng lượng với từng cơ chất khác nhau

- Nguồn Protein

Vai trò của protein trong môi trường nuôi không chỉ là nguồn đạm có sẵn mà còn

là chất hấp thụ ion kim loại độc

Hai nguồn protein trên cần được lựa chọn phù hợp mục đích sử dụng:

Theo kết quả nghiên cứu của Zhang và Sirard, việc bổ sung BSA trong môi trường nuôi trứng không cung cấp khả năng nở rộng các tế bào cumulus và sự chín của trứng so với khi bổ sung FCS Những kết quả tương tự cũng được ghi nhận trên bò, chuột và thỏ.Qua đó cho thấy, trong FCS hiện diện một số yếu tô có khả năng tái lập lại quá trình

phân bào giảm nhiễm và cung cấp khả năng chín của các tế bào trứng ở điều kiện in vitro

Theo nghiên cứu ở chuột, nếu bổ sung huyết thanh trong môi trường nuôi trứng sẽ ngăn cản màng trong suốt (zona pellucida) khỏi sự cứng hóa (hardening) Ngược lại, trong môi trường có bổ sung BSA, sự cứng hóa màng zona xảy ra và sự xâm nhập tinh trùng bị cản trở Do đó, BSA được sử dụng như biện pháp ngăn cản sự xâm nhập đa tinh

trùng trong các quy trình thụ tinh in vitro

Cơ chế của sự làm cứng màng trong suốt là do sự chuyển dạng của một glycoprotein ở màng từ dạng ZPZ sang dạng ZPZf được điều khiển bởi một protease do các tế bào hạt vỏ giải phóng Chất Fetuin được biết là một glycoprotein chính trong FCS

có khả năng ức chế sự cứng màng trong suốt của trứng chuột do ngăn cản sự chuyển đổi của ZPZ thành ZPZf

Nhìn chung, hầu hết các môi trường IVM heo đều được bổ sung hormone, đặc biệt

là LH/FSH, và các yếu tố sinh trưởng khác Theo Mattioli và cs (1991), tỷ lệ trứng chín tăng lên đáng kể khi có LH (76%) và FSH (86%) so với khi không bổ sung (35%)

Có nhiều báo cáo cho rằng, hormone trong môi trường nuôi chín không chỉ làm dễ dàng cho quá trình phân bào giảm nhiễm mà còn ảnh hưởng đến quá trình chín tế bào

chất của các trứng heo ở điều kiện in vitro.Ngược lại, một số báo cáo cho rằng các tế bào

trứng heo có thể trải qua giai đoạn GVBD trong môi trường không có hormone Vì thế, hormone cần được bổ sung hay không vào môi trường nuôi trứng chín vẫn còn là vấn đề cần tranh luận

Gần đây, Funahashi và cs (1994) đã báo cáo về sự vắng mặt của các hormone (PMSG và estradiol) giữa mốc thời gian 20 giờ và 24 giờ nuôi trứng chín đã có hiệu quả đối với sự phân bào giảm nhiễm và sự chín tế bào chât của các trứng heo in vitro Như

vậy, các trứng heo có thể hoàn tất sự chín in vitro ở điều kiện không có sự bổ sung

hormone vào môi trường nuôi chín

- Dịch nang trứng [19], [18]

Các tác giả, Naito và cs (1988), Yoshida và cs (1992), Funahashi & Day (1993),

Long và cs (1999) đã xác định tác dụng của dịch nang trứng lên khả năng chín in vitro

của các tế bào trứng khi bổ sung vào môi trường nuôi

Kết quả phân tích dịch nang trứng của heo (porcine iollicular fluid -PFF) cho thấy

sự hiện diện của những thành phần có tính acid, có trọng lượng phân tử 10.000 200.000.Các thành phần này được biết có vai trò điều khiển quá trình chín của trứng (Yoshida và cs, 1992), cải thiện tỷ lệ mở rộng các tế bào cumulus, sự chín của nhân, sự thụ tinh và sự phát triển bình thường của phôi Sato và cs (1987, 1990) đã tìm thấy từ dịch nang trứng chất glycosaminoglycan (GAG) có tác dụng ngăn cản sự thoái hóa của các tế bào trứng heo sau hiện tượng tan biến túi mầm

-Westergaard và cs (1984) đã chứng minh trong dịch nang trứng của người có chứa

cơ chất có khả năng cảm ứng quá trình phân bào giảm nhiễm các tế bào mầm phôi chuột

1.7.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả IVM

1.7.6.1 Thời gian thu nhận mẫu buồng trứng

Nhìn chung, buồng trứng của heo trước thành thục về tính dục được thu nhận từ lò

mổ là nguồn tế bào trứng cho các kỹ thuật IVM Nhiệt độ vận chuyển và thời gian từ khi buồng trứng được thu nhận đến khi hút tế bào trứng có thể ảnh hưởng đến chất lượng trứng Vì thế, duy trì khả năng sống của tế bào trứng trong quá trình này là cực kỳ quan trọng để đạt được việc nuôi chín tế bào trứng thành công Thông thường, buồng trứng được giữ ấm (37- 39°C) trong dung dịch sinh lý hay PBS có bổ sung kháng sinh, được chuyển về phòng thí nghiệm trong thời gian nhanh nhất (1-2 giờ)

1.7.6.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng trứng [11]

- Sự trưởng thành của động vật giết mổ

Theo Nottle và cs (1997), các trứng thu nhận và cho thụ tinh từ các con heo cái

trưởng thành có khả năng phát triển trong điều kiện in vitro hơn so với trứng thu từ các

con chưa trưởng thành

- Stress

Các yếu tố gây stress của môi trường như nhiệt độ quá cao có thể ảnh hưởng sự sinh sản của cả heo đực và cái Theo Wetterman và Bazer (1985), nhiệt độ cao có thể thay đổi sự tăng trưởng của nang trứng và điều này làm giảm chất lượng trứng

- Dinh dưỡng cá thể cái

Theo Ashworth và cs (1999), trứng được nuôi chín trong môi trường dịch nang trứng thu nhận từ heo cái cho ăn đầy đủ có tỷ lệ chín nhân cao hơn so với các trứng được nuôi với dịch nang thu từ các heo cái cho ăn hạn chế Điều này cho thấy, dinh dưỡng đã ảnh hưởng lên sự tiết của dịch nang và chất lượng trứng

1.8 Thu nhận giao tử đực[1], [6]

Sự xâm nhập thành công của tinh trùng vào các tế bào trứng đã được thực hiện với tinh tươi hay tinh đông lạnh qua giải đông, ở nhiều phòng thí nghiệm, do khó khăn trong bảo quản lạnh, nên tinh dịch tươi vẫn là một nguồn tinh trùng chính cho các nghiên cứu IVF Tuy nhiên, theo nghiên cứu, trong tinh dịch tươi có một số thành phần không có lợi cho hoạt động của tinh trùng

1.8.1 Cơ sở của quá trình thu nhận tinh trùng

Tinh trùng là những tế bào chuyên hóa cao độ để hoàn thành mục tiêu chính là thụ tinh cho trứng.Trong sự thụ tinh, để tiếp cận được với trứng, tinh trùng phải lưu chuyển qua nhiều môi trường khác nhau Do đó, khả năng hoạt động là cần thiết cho quá trình này Trong đó, khả năng hoạt động tiến thẳng được xem là biểu hiện sự thành thục của tinh trùng về hình thái và trao đổi chất

1.8.2 Các phương pháp thu nhận tinh trùng[13], [9]

1.8.2.1 Giới thiệu

Tinh trùng cần được tách khỏi tinh tương để sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như: (1) thử nghiệm chẩn đoán chức năng của tinh trùng và (2) điều trị vô sinh thông qua các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (ART) Với mục đích thứ nhất, tinh trùng cần phải được tách ra khỏi tinh tương trong vòng 1 giờ sau khi xuất tinh nhằm hạn chế tối đa các tổn hại đến tinh trùng do các sản phẩm của các tế bào lạ (không phải tinh trùng) gây ra

1.8.2.2 Mục đích

Trong giao hợp tự nhiên, tinh tương giúp tinh trùng thâm nhập vào chất nhầy cổ tử cung (Overstreet và cs, 1980) Tuy nhiên, trong điều trị vô sinh bằng các kỹ thuật ART khi rào cản tự nhiên bị phá vỡ thì một số thành phần của tinh tương (như kẽm, prostaglandins) lại gây trở ngại cho việc có thai

Mục đích của việc phân tách tinh trùng người khỏi tinh dịch là thu được mẫu cô đặc, chứa tỷ lệ phần trăm tinh trùng di động và hình dạng bình thường cao, đồng thời loại

bỏ các mảnh vỡ, tế bào lạ và các tinh trùng chết

Đối với những mẫu tinh dịch bình thường chỉ cần pha loãng tinh dịch với môi trường nuôi cấy và ly tâm Tinh trùng chuẩn bị theo phương pháp này thường được dùng trong IUI (Boomsma và cs, 2004) Tuy nhiên, khi mẫu có một hoặc vài thông số bất thường trong tinh dịch đồ thì cần sử dụng phương pháp ly tâm trên thang nồng độ không liên tục hoặc swim-up trực tiếp

1.8.3 Các yêu cầu của quá trình chuẩn bị tinh trùng

Các yêu cầu cần thực hiện trong điều kiện in vitro:

 Trong môi trường hoạt hóa cần có sự hiện diện các thụ quan của cholesterol, có thể là huyết thanh hoặc albumine huyết thanh bò hoặc người (bovine serum albumin -BSA hoặc human serum albumin -HSA), sẽ thực hiện chức năng làm mất ổn định màng tinh trùng Huyết thanh có hiệu quả hơn vì có các lipoprotein có khả năng thu hồi cholesterol tốt hơn albumine

và dịch nang trứng cũng là một thụ quan có hiệu quả cho việc thu nhận cholesterol

1.9 Hệ thống thụ tinh và nuôi phôi invitro

Hình 1.6.Quá trình xâm nhập của tinh trùng vào noãn

- Thời gian thụ tinh [10]

Cơ hội thụ tinh và sự phát triển sẽ tốt nếu tiến hành thụ tinh cho trứng khoảng 4 giờ sau khi hình thành thể cực đầu tiên

- Khả năng duy trì sự thụ tinh của tinh trùng

Các tinh trùng heo được hoạt hóa sẽ có khả năng thụ tinh in vitro cho các trứng

trong vòng 2,5 giờ sau sự xâm nhập của chúng vào các tế bào trứng (theo Nagai và cs, 1993) Có nhiều yếu tố cần thiết giúp chúng có thể duy trì khả năng thụ tinh như tỷ lệ về khả năng xâm nhập vào trứng phải lớn hơn 50% sau 2 giờ được bổ sung vào môi trường

có các tế bào trứng (Mori và cs, 1995)

- Mật độ tinh trùng

Trong số tinh trùng đượckiện toàn năng lực thụ tinh invitro, người ta không xác

định được tỷ lệ tinh trùng thực sự được hoạt hóa Do đó, trong các quá trình thụ tinh, tinh trùng thường được sử dụng với một lượng rất lớn (vài triệu tinh trùng/ml) Điều này gây

ra tỷ lệ thụ tinh đa tinh trùng trong điều kiện invitro cao hơn nhiều lần so với trong điều kiện in vivo.Ngoài ra, quá nhiều tinh trùng sẽ gây ảnh hưởng xấu đối với sự phát triển của

phôi giai đoạn sớm

- Loại tinh trùng chết ra khỏi môi trường sau khi thụ tinh [6]

Các nghiên cứu của Grupen và Nottle (2000) cho thấy sự hiện diện của tinh trùng chết trong môi trường sau thời gian thụ tinh sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển phôi Do đó, cần chuyển tế bào trứng cùng với tinh trùng bám vào màng trong suốt khỏi phần tinh trùng đã chết để tránh tác động oxy hóa của các sản phẩm trao đổi của tinh trùng lên sự phát triển phôi

- Môi trường [6]

Hầu hết các môi trường IVF heo được bổ sung caffein, một chất ức chế phosphodiesterase được biết làm tăng nồng độ cAMP nội bào

Ngoài những thành phần được bổ sung trong IVF, loại môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh đa tinh trùng Martinez-Mardrid và cs (2001) đã sử dụng hai môi trường IVF khác nhau, môi trường đệm Tris cải tiến (mTBM) và môi trường Tyrode cải tiến (mTALP) để so sánh về tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng và tỷ lệ thụ tinh đa tinh trùng.So với mTBM, trong mTLAP cho tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng cao hơn (92-94%

so với 61-77%).Vì thế, lựa chọn môi trường IVF thích hợp cũng là một yếu tố quan trọng

để giảm tối thiểu tỷ lệ đa tinh trùng nhưng đạt tỷ lệ thụ tinh cao

1.9.1.2 Đánh giá sự thụ tinh [10]

Ở các tế bào trứng, 12-20 giờ sau thụ tinh sẽ xuất hiện 2 tiền nhân chứng tỏ hiện tượng thụ tinh đã xảy ra về mặt hình thái và vi thể Tuy nhiên, có hay không có tiền nhân không phải là một bằng chứng chắc chắn.Sự phân chia tế bào cũng là một trong những bằng chứng của sự thụ tinh

1.9.2 Hệ thống nuôi phôi [15]

Việc nuôi phôi có thể sử dụng một số phương thức khác nhau như nuôi cấy in vivo

trong ống dẫn trứng của một con vật thay thế như thỏ, cừu hoặc chuột; nuôi cấy phôi với các tế bào sinh dưỡng bổ sung vào môi trường nuôi; hoặc nuôi trong các môi trường xác định

1.9.2.1 Hệ thống nuôi phôi in vivo[14]

Các phôi heo có thể được nuôi trong bộ phận sinh sản của các loài khác

Các phôi giai đoạn sớm có thể phát triển đến giai đoạn phôi nang khi nuôi trong đoạn thắt ống dẫn trứng của cừu (Prather và cs, 1991) Tỷ lệ thu nhận phôi phát triển trong ống dẫn trứng cừu đạt tỷ lệ cao (83%) Ngược lại, đoạn thắt ống dẫn trứng của thỏ lại không phù hợp cho sự phát triển của phôi heo (Herrmann và Holtz, 1985).Ống dẫn trứng chuột có khả năng sử dụng để nuôi phôi heo trong một khoảng thời gian dài.Nhưng ống dẫn trứng chuột chưa trưởng thành không cung cấp sự phát triển phôi heo vượt qua giai đoạn 4 tế bào (Ebert và Papaioannou, 1989)

1.9.2.2 Hệ thống nuôi phôi trong môi trường xác định [6], [14]

Môi trường nuôi cấy các phôi sau thụ tinh cũng bao gồm những thành phẩn chính như các môi trường nuôi trứng nhưng không bổ sung hormone Trong nuôi phôi, vấn đề bảo đảm áp suất thẩm thấu rất được quan tâm Do đó, các yếu tố bảo vệ áp suất thường được sử dụng như taurine, hypotaurine, sorbitol Ngoài ra, huyết thanh thường sử dụng với hàm lượng cao hơn so với trong môi trường nuôi trứng nhằm kích thích khả năng phân chia của các nguyên bào phôi, đặc biệt trong các giai đoạn phát triển muộn của phôi (từ giai đoạn phôi dâu trở lên)

Nghiên cứu trên các động vật thí nghiệm như chuột và chuột đồng hamster đã làm tiền đề cho các ứng dụng trên phôi heo Kết quả ghi nhận từ nghiên cứu trên

chuột hamster cho thấy glucose và phosphate gây ức chế, thậm chí gây hiện tượng

“block” trong quá trình phát triển in vitro của phôi Kết quả tương tự cũng đượcghi

nhận trên các phôi chuột nhắt (Chatot và cs, 1989), chuột cống (Reed và cs, 1992), bò (Ellington và cs, 1990; Moore và Bondioni, 1993) và heo (Petter và cs, 1990; Misener

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Micropipette NIC – NPX 100 (10-100µl) (Nichiryo, Nhật Bản)

- Hộp đựng đầu côn (Biohit, Nhật Bản)

- Buồng đếm hồng cầu: buồng đếm Neubauer cải tiến, có lamelle

phủ dày (độ dày số 4, 0.44mm)

- Bút bi / Bút chì

- Đĩa 4 giếng

- Pipette nhựa

 Dụng cụ tiêu hao:

- Găng tay dùng 1 lần

- Lọ đựng mẫu tinh dịch: Lọ dùng một lần có miệng rộng và có vạch chia thể tích

- Giấy đo pH

- Lame kính (Sail Brand, Trung Quốc)

- Đầu côn vàng, xanh

- Ống nghiệm nhỏ (15cm)

- Khăn: không có xơ vải

2.2.2 Thiết bị

- Máy ly tâm Rotofix 32 (Hettich Zentrifugen, Đức)

- Kính hiển vi quang học CX21 (Olympus, Nhật Bản)

Sơ đồ 2.1 Quy trình đánh giá chất lượng tinh trùng heo

Pha loãng, xác định mật độ tinh trùng, tổng

số tinh trùng/lần xuất tinh

1st Qtr 2nd Qtr 3rd Qtr 4th Qtr

East West North

15 phút

10 phút

Giải thích quy trình:

Mẫu nên được thu nhận sau khi kiêng xuất tinh tối thiểu là 2 ngày và tối đa là 7 ngày

Tại viện chăn nuôi heo:

 Mẫu sẽ được ghi nhận thời gian xuất tinh và thời gian nhận mẫu

 Mẫu được bảo quản trong tủ mát 20C – 80C để bất hoạt tinh trùng (trạng thái ngủ) Khi đem về phòng thí nghiệm:

 Mẫu sẽ được ủ trong tủ ấm ở 370C để tinh trùng trở về trạng thái bình thường

 Mẫu được đánh giá các chỉ tiêu về chất lượng tinh trùng

Chú ý:

Lọ đựng mẫu phải là lọ tiệt trùng, làm từ chất liệu nhựa không gây độc cho tinh trùng

Quy trình đánh giá chất lượng tinh trùng

Trong 10 phút đầu: Đặt lọ chứa mẫu trong tủ ấm (370C) để ly giải

Giữa 30 phút và 60 phút: Quan sát và đánh giá sự ly giải của tinh dịch

 Đo thể tích tinh dịch

 Đo pH của tinh dịch

 Làm tiêu bản ướt để đánh giá độ di động của tinh trùng và xác định độ pha loãng cần thiết để đánh giá mật độ tinh trùng

 Đánh giá tỷ lệ sống/chết của tinh trùng (nếu tỷ lệ phần trăm của các tinh trùng di động tiến tới thấp)

 Pha loãng tinh dịch để đánh giá mật độ tinh trùng

2.4.1.1 Khảo sát đại thể

+ Tính chất tổng quát:

- Tinh dịch bình thường: có tính đồng nhất, có màu xám hoặc trắng đục

- Tinh dịch ngả màu vàng: do mẫu bị lẫn nước tiểu, nhiễm trùng

- Tinh dịch có màu đỏ nâu hoặc hồng: mẫu có lẫn hồng cầu

- Tinh dịch loãng, trắng trong: thường là thiểu tinh hoặc vô tinh

- Tinh dịch có cặn nhiều: có thể do viêm nhiễm đường tiết niệu

+ Sự ly giải của tinh dịch

Cách đánh giá sự ly giải

Đánh giá sau 15 phút đặt trong tủ ấm 370

C bằng cách lắc nhẹ Nếu chưa ly giải hoàn toàn thì tiếp tục bỏ vào tủ ấm Sau 30 phút tinh dịch chưa ly giải thì kiểm tra tiếp tục

30 phút tiếp theo Nếu tinh dịch vẫn không ly giải hoàn toàn sau 60 phút cần ghi nhận mẫu không ly giải vào phiếu trả kết quả

 Quá trình ly giải cũng có thể quan sát trong khảo sát vi thể khi thấy tinh trùng bất động có thể hồi phục khả năng di động khi tinh dịch ly giải hoàn toàn Do đó, khi thấy có hiện tượng này cần để thêm thời gian để quá trình ly giải diễn ra hoàn toàn

 Ta có thể trộn nhẹ nhàng liên tục hoặc lắc đều mẫu trong lọ trong tủ ấm 370C để thúc đẩy sự ly giải của mẫu

 Nếu quá trình ly giải không xảy ra trong 60 phút Ta có thể chủ động thực hiện các cách sau:

Bổ sung thêm môi trường sinh lý với thể tích tương đương với thể tích tinh dịch rồi dùng pipette hút lên hút xuống nhiều lần

Hút lên, xuống nhẹ nhàng từ 6 ÷ 10 lần bằng kim tiêm 18G (đường kính trong 0,84mm) hoặc 19G (đường kính trong 0,69mm), giúp giảm bớt tình trạng không đồng nhất

 Bình thường: giọt tinh dịch nhỏ thành những giọt rời rạc

 Bất thường: tinh dịch thường dính chặt vào nhau khi cố gắng hút vào pipette, giọt tinh dịch có dạng sợi dài hơn 2cm

+ Thể tích tinh dịch

Thể tích tinh dịch bao gồm dịch tiết từ túi tinh và tuyến tiền liệt, cùng với một lượng nhỏ từ tuyến hành niệu đạo và mào tinh hoàn Việc đo lường chính xác thể tích là cần thiết trong mỗi lần đánh giá tinh dịch, nó cho phép tính tổng số tinh trùng và tổng số

tế bào lạ trong một lần xuất tinh

Bước 1: Cân lọ trước khi lấy mẫu

Bước 2: Cân lọ có chứa mẫu tinh dịch bên trong

Bước 3: Trừ đi cân nặng của lọ chứa

Bước 4: Thể tích mẫu tinh dịch được tính từ trọng lượng mẫu Với tỉ trọng của tinh dịch là 1g/ml (Tỉ trọng của tinh dịch dao động giữa 1.043 và 1.102 g/ml)

+ pH tinh dịch

pH tinh dịch phản ánh sự cân bằng giữa giá trị pH của dịch tiết từ các tuyến sinh dục phụ khác, chủ yếu là dịch tiết từ túi tinh mang tính kiềm và dịch tiết của tuyến tiền liệt có tính acid pH được đo sau khi ly giải ở thời điểm nhất định, thường tốt nhất là sau

30 phút nhưng không được quá 1 giờ sau khi xuất tinh vì pH sẽ bị ảnh hưởng bởi sự mất

CO2 sau khi xuất tinh, ảnh hưởng đến việc đánh giá không chính xác

Ta sử dụng giấy đo pH trong phạm vi từ 6.0 đến 10.0, thực hiện như sau:

 Trộn đều mẫu

 Nhỏ một giọt lên giấy quỳ

 Chờ màu của vùng ngấm không đổi màu (<30s)

 So sánh màu của giấy quỳ với thang đo pH và đọc pH

Bước 5: Cẩn thận tránh hình thành bọt khí giữa lam phủ và lam kính

Bước 6: Đánh giá tiêu bản tươi khi dịch bên trong đã ổn định (không bị trôi, khoảng 60s)

Bước 7: Đánh giá ở nhiệt độ phòng 240C - 260C Có thể sử dụng kính hiển vi có bàn

ấm 370C để đánh giá

Bước 8: Kiểm tra sự phân bố tinh trùng trên hai tiêu bản tươi Nếu sự phân bố này là đều, ta sẽ tiến hành khảo sát vi thể Ngược lại, có sự khác biệt lớn giữa hai tiêu bản thì mẫu nên được trộn đều lại và tạo lại hai tiêu bản tươi mới

 Nếu độ sâu thấp hơn 20µm sẽ làm kiềm hãm sự di động của tinh trùng

 Nếu buồng đếm quá sâu sẽ gây khó khăn trong việc đánh giá dotinh trùng di chuyển ra ngoài phạm vi của tầm kiểm soát

+ Khảo sát vi thể ban đầu:

Khảo sát vi thể ban đầu đòi hỏi đánh giá tổng quát tinh dịch trên tiêu bản tươi Đầu tiên, đánh giá ở độ phóng đại 100X (vật kính 10X với thị kính 10X) Ta sẽ có cái nhìn tổng quan về mẫu, để quan sát:

 Sự hình thành dải nhầy

 Hiện tượng kết đám, kết dính tinh trùng

Hình 2.1 Biểu đồ về sự phân loại kết dính

 Sự hiện diện của các tế bào lạ không phải tinh trùng như: tế bào biểu mô, tế bào tròn (bạch cầu, tinh trùng non chưa trưởng thành), đầu hay đuôi tinh trùng bị tách rời Sau đó, với độ phóng đại 400X (vật kính 40X với thị kính 10X), ta có thể:

 Đánh giá độ di động của tinh trùng

 Xác định độ pha loãng cần thiết để đếm mật độ tinh trùng, đánh giá chính xác

số lượng tinh trùng

+ Độ di động của tinh trùng

Phân loại tinh trùng di động:

Độ di động của tinh trùng được chia thành 3 loại như sau:

 Di động tiến tới (PR- Progressive): tinh trùng di chuyển tích cực, theo một đường thẳng hoặc theo một vòng tròn lớn

 Di động không tiến tới (NP- Non-progressive): tinh trùng di chuyển tại chỗ, bơi trong vòng tròn nhỏ, di chuyển khó khăn hoặc chỉ thấy đuôi cử động

 Không di động (IM- Immotile): tinh trùng bất động

Cách đánh giá độ di động

Bước 1: Trộn đều mẫu

Bước 2: Tạo hai tiêu bản tươi với độ sâu khoảng 20µm

Bước 3: Đợi mẫu ổn định (khoảng 60s)

Bước 4: Xem lam kính với kính hiển vi quang học dưới độ phóng đại X400

Bước 5: Đánh giá tinh trùng ở vùng cách rìa lamelle ít nhất 5mm trở lên để tránh quan sát vùng bị khô của mẫu

Bước 6: Bắt đầu chọn một vi trường ngẫu nhiên, đánh giá nhanh, không đợi tinh trùng bơi vào buồng đếm

Bước 7: Đánh giá độ di động của tất cả tinh trùng trong cùng một vị trí trong vi trường đã xác định

Bước 8: Đếm PR trước tiên, sau đó đếm NP và cuối cùng là IM trong cùng một vùng đã ấn định Khi đã có kinh nghiệm thì có thể đánh giá cả 3 loại tinh trùng cùng một lúc và đánh giá trên một vi trường rộng

Bước 9: Nên thay đổi vi trường thường xuyên, đánh giá theo hệ thống, tránh chọn những vùng có nhiều tinh trùng di động (chọn ngẫu nhiên)

Bước 10: Nên đếm số lượng mỗi loại tinh trùng bằng máy bách phân

Bước 11: Đánh giá ít nhất 200 tinh trùng trong ít nhất 5 vi trường khác nhau ở mỗi tiêu bản để giảm sự sai số, sai số nằm trong khoảng cho phép

Bước 12: Đếm 2 lần trên hai tiêu bản khác nhau, so sánh kết quả của hai tiêu bản Bước 13: Tính phần trăm trung bình giữa hai lần đếm Chọn tỉ lệ trung bình cao nhất trong 3 loại (PR,NP hay IM) Xác định hiệu số giữa hai lần đếm đó

Bước 14: So tỉ lệ trung bình và hiệu số giữa hai lần đếm với độ sai biệt cho phép Bước 15: Nếu độ sai biệt nằm trong giới hạn cho phép thì lấy trung bình kết quả các chỉ số PR, NP, IM (làm tròn đến 0,5%) Đây chính là kết quả cuối cùng và được xác định bằng phần trăm trung bình của mỗi nhóm tinh trùng di động

Bước 16: Nếu sai biệt đó vượt quá phạm vi cho phép, làm lại tiêu bản mới để đánh giá lại

Hình 2.2 Cách đánh giá độ di dộng của tinh trùng

(a) Thị kính có ô kẻ giúp đếm tinh trùng di động và không di động dễ dàng hơn (b) Chọn vi trường đếm tinh trùng, cách mép ít nhất 5mm

Tinh trùng chết: có màng tế bào bị tổn thương sẽ bắt màu với thuốc nhuộm Eosin, khi quan sát ta sẽ thấy hình ảnh đầu tinh trùng bắt màu đỏ hay hồng nhạt

Chuẩn bị thuốc nhuộm :

 Eosin 1% : 1g Eosin và 100ml nước cất

 Nigrosin 10% : 10g Nigrosin và 100ml nước cất

 Đun sôi hỗn hợp, để nguội ở nhiệt độ phòng

 Lọc qua màng lọc, bảo quản trong bình tránh sáng ở nhiệt độ phòng

Quy trình thực hiện :

Bước 1 : Trộn đều mẫu

Bước 2: Dùng micropipette hút 50µl tinh dịch + 50µl Eosin-Nigrosin Trộn đều trong ống nghiệm.Đợi 30s

Bước 3: Trộn đều mẫu và tạo tiêu bản Để khô tự nhiên

Bước 4: Nhỏ 1 giọt dầu lên tiêu bản và quan sát dưới vật kính dầu 100X

Bước 5: Đếm số tinh trùng bắt màu và không bắt màu Eosin bằng máy bách phân Bước 6: Đánh giá 200 tinh trùng để hạn chế sai số

Bước 7: Tính phần trăm tinh trùng sống/chết, tính tỉ lệ trung bình và tỉ lệ khác biệt giữa hai lần đếm

Bước 8: So sánh với tỉ lệ khác biệt cho phép:

 Nếu khác biệt vượt quá giới hạn cho phép: tạo tiêu bản khác, đánh giá lại

 Nếu khác biệt chấp nhận được: lấy trị số trung bình là kết quả

Bảng 2.1.Tỉ lệ khác biệt cho phép giữa tỉ lệ trung bình và hiệu số trung bình giữa

hai lần đếm

Tỷ lệ trung

bình (%)

Khác biệt cho phép

Tỷ lệ trung bình (%)

Khác biệt cho phép

Nếu mật độ tinh trùng nhiều thì đánh giá trên một vùng giới hạn của vi trường, nếu mật độ ít nên đánh giá trên toàn bộ vi trường Nếu đếm hết vi trường mà vẫn chưa đủ 200 tinh trùng thì ta di chuyển sang vi trường khác cách vi trường vừa đếm khoảng 1.5 vi trường

Khi đếm đủ 200 tinh trùng trước khi tất cả các loại di động còn lại trong vi trường chưa được đếm hết thì phải tiếp tục đếm, sau đó tính ra phần trăm các loại di động

Để tránh đếm thừa tinh trùng di động thì ta đảo thứ tự phân tích (NP và IM trước),

sử dụng thị kính có kẻ ô và tránh đậy lamelle xiên

Trong một vài trường hợp đặc biệt, với mẫu không đồng nhất, có sự khác biệt giữa

2 tiêu bản vượt quá giới hạn cho phép mặc dù đã tạo tiêu bản thứ 3.Lúc này, ta tính trung bình các tiêu bản và ghi chú vào kết quả

Bước 3: Trộn tinh dịch và chuẩn bị mẫu pha loãng

Bước 4: Nhỏ mẫu pha loãng vào buồng đếm Neubauer, để yên trong 2 - 4 phút cho tinh trùng ổn định

Bước 5: Đánh giá mẫu trong vòng 10 ÷ 15 phút (nếu để lâu mẫu sẽ bay hơi ảnh hưởng đến vị trí của tinh trùngtrong buồng đếm)

Bước 6: Đếm ít nhất 200 tinh trùng trên mỗi buồng

Bước 7: So sánh kết quả giữa hai lần đếm, nếu sai biệt nằm trong khoảng cho phép: tính mật độ, nếu khác biệt quá lớn: pha loãng mẫu lại

Bước 8: Tính mật độ tinh trùng trong 1ml

Bước 9: Tính tổng số tinh trùng trong mẫu xuất tinh

 Chuẩn bị mẫu pha loãng:

Bảng 2.2.Cách tính độ pha loãng, vùng đếm tinh trùng

Độ pha loãng quy định

Thể tích tinh dịch (µl)

Thể tích dd pha loãng (µl)

Vùng đánh giá (lưới ô vuông)

Giới hạn tối thiểu của mật độ tinh trùng trong mẫu là 15.106/ml

Tổng số tinh trùng = Mật độ tinh trùng/ml × Thể tích mẫu tinh dịch

 Cách tính tổng số tinh trùng tiến thẳng (tỷ/ xuất tinh)

T = (V × C × PR)/100

Trong đó:

- V là thể tích tinh dich (ml)

- C là mật độ tinh trùng (triệu/ml)

- PR là tỷ lệ phần trăm tinh trùng tiến thẳng

Bảng 2.3.1 Đánh giá chất lượng tinh trùng heo

Độ nhớt

Li giải PH Thể

tích (V)

Mật độ (x 106) (C)

Tế bào lạ

Kết dính

Lần 5 - - - -

Bảng 2.3.2 Đánh giá chất lượng tinh trùng heo

trùng tiến thẳng (tỷ/ xuất tinh)

2.4.2 Thu nhận giao tử cái

2.4.2.1 Thu nhận buồng trứng tại lò mổ

Tại lò mổ, thực hiện việc thu nhận trực tiếp các bộ phận sinh dục của heo cái Dùng kéo cắt 2 buồng trứng ở 2 bên nhánh tử cung.Buồng trứng được rửa nhanh bằng alcool 90° Sau đó, rửa buồng trứng 2 lần trong mPBS có bổ sung kháng sinh Chuyển buồng trứng về phòng thí nghiệm trong thời gian nhanh nhất.Mẩu buồng trứng luôn được giữ âm (37 - 39°C) trong quá trình vận chuyển

2.4.2.2 Phương pháp thu trứng từ buồng trứng

Khi về đến PTN, lọ mẫu buồng trứng được lau sạch bằng alcool 70°.Chuyển mẫu

ra khay nhựa, cắt bỏ các phần ống dẫn trứng còn sót lại Rửa buồng trứng 3 - 5 lần trong mPBS có bổ sung kháng sinh Sử dụng kim 5cc có đầu kim 18G để hút dịch nang trứng từ các nang có kích thước 2-8mm Chuyển dịch nang trứng vào các đĩa nhựa (60x15mm) có 10ml môi trường mPBS đã được làm ấm trước đó.Tiếp đó, để lắng và soi trứng dưới kính hiển vi (5X hoặc 10X)

2.4.2.3 Phương pháp tìm và rửa trứng

Các đĩa có dịch nang trứng được chuyển lên kính hiển vi Sử dụng kim hút trứng

để thu trứng Chỉ thu nhận các tế bào trứng có nhiều hơn 3 lớp tế bào cumulus bao quanh Các tế bào trứng này được gọi là các phức hợp tế bào trứng - cumulus (COC).Các COCđược chuyển vào đĩa petri có môi trường mDPBS.Sau đó, rửa trứng lần lượt qua các đĩa petri còn lại cho đến khi không còn mảnh tế bào vỡ

2.4.2.4 Bảng thu nhận trứng loại A và loại B

Bảng 2.4.Tỷ lệ phần trăm trứng loại A và loại B

2.5 Thực nghiệm 2: Nuôi và đánh giá trứng trên các môi trường khác nhau

+ Phương pháp chuyển trứng vào môi trường nuôi

Sử dụng đĩa 4 giếng để nuôi trứng.Hút trứng từ đĩa petri, sau đó chuyển trứng vào đĩa 4 giếng, mỗi giếng 10 trứng.Chuyển trứng vào giếng nuôi thành từng nhóm, tránh phân tán.Nuôi trứng ở điều kiện 370C.Đánh giá trứng qua các mốc thời gian khác nhau

+ Phương pháp thu nhận trứng sau nuôi

Sau thời gian nuôi trứng, sử dụng kim hút trứng để thu trứng ra khỏi môi trường nuôi Chuyển trứng vào đĩa petri có mPBS Dùng kim hút trứng phân tán môi trường nhiều lần nhằm làm bong ra các lớp tế bào cumulus bao quanh trứng Các tế bào trứng sau khi loại đi cumulus gọi là các tế bào trứng trần (denuded oocytes) Chọn các trứng chín , sau đó lần lượt chuyển các trứng này vào môi trường giọt treo để chuẩn bị cho quá trình thụ tinh

+ Phương pháp đánh giá phân loại trứng

Bảng 2.5 Đánh giá phân loại trứng

+ Nội dung và chi tiết thí nghiệm

Bảng 2.6 Nội dung và chi tiết thí nghiệm thực nghiệm 2

Môi trường KSOM (A1), M16 (A2), KSOM bổ sung dịch nang trứng

10% (A3) Mốc thời gian khảo sát 0 giờ (T0), 24 giờ (T1), 36 giờ (T2), 48giờ (T3), 60 giờ(T4) Chỉ tiêu khảo sát Tỷ lệ % trứng xấu, trứng tốt

Kết quả ghi nhận - Xác định tỷ lệ phần trăm trứng xấu, trứng tốt trong

môi trường A1, A2, A3

- Xác định loại môi trường và mốc thời gian tỷ lệ trứng tốt ổn định nhất

Số lần thí nghiệm Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần ở từng loại môi trường

2.5.1 Nuôi và đánh giá trứng trên môi trường KSOM (A1)

Bảng 2.7 Đánh giá trứng (tỷ lệ %) các loại trứng ở môi trường KSOM

2.5.2 Nuôi và đánh giá trứng trên môi trường M16 (A2)

Bảng 2.8 Đánh giá trứng (tỷ lệ %) các loại trứng ở môi trường M16 (A2)

Cách thu dịch nang trứng bổ sung vào môi trường nuôi trứng

 Sử dụng kim 5 cc có gắn với đầu kim 18G để hút dịch nang trứng từ các nang trứng có kích thước 3 - 6mm

 Ly tâm dịch nang trứng ở 4°c, tốc độ 3000vòng/phút trong 10 phút

2.6 Thực nghiệm 3: Thu nhận tinh trùng từ các phương pháp khác nhau

Bảng 2.10 Bảng nội dung và chi tiết thực nghiệm 3

Nội dung Chi tiết thí nghiệm Chỉ tiêu khảo sát Mật độ tinh trùng

Phương pháp thu nhận Simple Wash (M2), Swim – up (M1)

Phương pháp đánh giá Theo phương pháp đếm mật độ tế bào trong buồng

đếm hồng cầu Kết quả ghi nhận - Mật độ tinh trùng trước (K1) và sau thu nhận

Số lần thí nghiệm Mỗi phương pháp được lặp lại 5 lần

2.6.1 Thu nhận tinh trùng từ phương pháp Swim – up (M2)

Nguyên tắc

Tinh trùng được chọn lọc dựa trên khả năng tự bơi ra khỏi tinh dịch để vào

môi trường nuôi cấy.Cách làm này được gọi là kỹ thuật up Kỹ thuật

swim-up trực tiếp được thực hiện bằng cách đặt lớp môi trường nuôi cấy lên trên lớp tinh

dịch hay đặt lớp tinh dịch dưới môi trường nuôi cấy Sau đó, các tinh trùng di động

sẽ tự bơi vào trong lớp môi trường nuôi cấy Không nên pha loãng và ly tâm tinh

dịch trước khi swim-up vì có thể gây hiện tượng peroxide hóa, làm tổn thương

màng tế bào tinh trùng

Phương pháp này cho số lượng tinh trùng thấp hơn phương pháp rửa đơn

giản, nhưng chọn lọc được những tinh trùng di động tốt và thích hợp cho các mẫu

tinh dịch có tỷ lệ phần trăm tinh trùng di động thấp sử dụng cho IVF hoặc ICSI

ly tâm trước, sau đó nhẹ nhàng đặt 1,2 ml môi trường nuôi cấy lên trên.)

Bước 3: Đặt ống nghiệm nghiêng 45oC để tăng bề mặt tiếp xúc giữa lớp tinh dịch

và môi trường nuôi cấy, ủ trong tủ cấy 1 giờ ở 37o

C

Bước 4: Nhẹ nhàng đặt ống ly tâm thẳng đứng trở lại và hút khoảng 1 ml môi trường ở phía trên, chứa nhiều tinh trùng di động

Bước 5: Sau khi hút, chuyển vào 1,5 - 2 ml môi trường mới

Bước 6: Ly tâm 300 - 500 g trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi

Bước 7: Hòa môi trường vào cặn lắng để được 0,3 ml tinh trùng

Bước 8: Đánh giá mật độ, tổng số tinh trùng di động và tinh trùng di động tiến tới

Bước 9: Thu nhận tinh trùng chuẩn bị cho quá trình thụ tinh

Bảng 2.11 Đánh giá kết quả thu nhận tỷ lệ % mật độ tinh trùng từ phương pháp

Swim – up

Tỷ lệ % M2

2.6.2 Thu nhận tinh trùng từ phương pháp Simple Wash (M1)

Nguyên tắc

Phương pháp rửa đơn giản giúp thu được số lượng tinh trùng cao nhất và

thích hợp với những mẫu tinh dịch có chất lượng tốt Phương pháp này thường

được sử dụng để chuẩn bị tinh trùng cho IUI

Bước 6: Hòa cặn với 1 ml môi trường mới

Bước 7: Ly tâm lặp lại ở 300 - 500g trong 3 – 5 phút

Bước 8: Hút bỏ dịch nổi

Bước 9: Hòa cặn với môi trường nuôi cấy để được 0,3 ml

Bước 10: Đánh giá mật độ, tổng số tinh trùng di động và di động tiến tới của mẫu sau lọc rửa

Bước 11: Thu nhận tinh trùng chuẩn bị cho quá trình thụ tinh

Bảng 2.12 Đánh giá kết quả thu nhận tỷ lệ % mật độ tinh trùng từ phương pháp

Swim – up

Tỷ lệ % M1

Bước 3: Phủ paraffin lỏng vào đĩa thụ tinh

Bước 4: Giữ ổn định đĩa thụ tinh 15-30 phút trong 370

C Bước 5: Chuyển trứng đã nuôi chín vào các giọt tinh trùng (15-20 trứng/giọt)

Bước 6: Nuôi ủ ở 370

C trong 6-8 giờ

Bước 7: Sau 6 – 8 giờ chuyển trứng sau thụ tinh vào môi trường nuôi phôi KSOM

Bước 8: Theo dõi sự phân chia phôi 2 tế bào, 4 tế bào, 8 tế bào ở các mốc thời gian khảo sát

Bước 9: Tỷ lệ tạo phôi được ghi nhận trên tổng số trứng chín

2.8 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý theo chương trình phần mềm Statgraphics

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN