Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp chất mang thuốc nanopolymer polyamidoamin (PAMAM) biến tính bằng các tác nhân hướng đích (axit folic, peptit, kháng thể )

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG THUỐC NANO POLYAMIDOAMINE (PAMAM) BIẾN TÍNH CÓ KHẢ NĂNG HƢỚNG ĐÍCH ĐẾN TẾ BÀO UNG THƢ LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC TP HỒ CHÍ MINH NĂM 2016 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG THUỐC NANO POLYAMIDOAMINE (PAMAM) BIẾN TÍNH CÓ KHẢ NĂNG HƢỚNG ĐÍCH ĐẾN TẾ BÀO UNG THƢ Chuyên ngành: Hóa Hữu Mã số chuyên ngành: 62 44 01 14 Phản biện độc lập 1: Phản biện độc lập 2: Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN CỬU KHOA GS.TS NGUYỄN CÔNG HÀO LỜI CAM ĐOAN Công trình đƣợc thực phòng Hóa dƣợc – Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Thành phố Hồ Chí Minh Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu đƣợc hƣớng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa GS.TS Nguyễn Công Hào Các nội dung nghiên cứu, kết luận án trung thực, đƣợc hoàn thành dựa kết nghiên cứu kết chƣa đƣợc dùng cho luận văn cấp Tác giả luận án Nguyễn Thị Bích Trâm i LỜI CÁM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa GS.TS Nguyễn Công Hào định hƣớng khoa học, giúp đỡ tận tình suốt trình thực luận án Xin gởi đến Thầy lời biết ơn chân thành Tôi xin cảm ơn hỗ trợ TS Trần Ngọc Quyển anh chị Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tôi xin cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi Viện Công nghệ Hóa học suốt thời gian thực luận án Sau cùng, xin gởi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp động viên, giúp đỡ cho hoàn thành luận án ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU DENDRIMER .4 1.1.1 Khái niệm dendrimer 1.1.2 Tính chất dendrimer 1.1.3 Các phƣơng pháp tổng hợp .11 1.1.4 Ứng dụng dendrimer PAMAM làm chất mang thuốc chống ung thƣ hƣớng đích .15 1.2 BIẾN TÍNH BỀ MẶT DENDRIMER PAMAM .19 1.2.1 Biến tính bề mặt dendrimer với tác nhân tƣơng hợp sinh học 20 1.2.2 Biến tính bề mặt dendrimer với tác nhân hƣớng đích .20 1.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU TRƢỚC ĐÂY 22 1.3.1 Những nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM với tác nhân alkyl hóa ………………………………………………………………………… 22 1.3.2 Những nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM với tác nhân hƣớng đích – acid folic .25 1.4 PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ CỦA DENDRIMER VÀ DẪN XUẤT .28 1.4.1 Xác định khối lƣợng phân tử dendrimer dẫn xuất dựa vào phổ MALDI- TOF-MS (WtMALD) 28 1.4.2 Xác định khối lƣợng phân tử polymer dựa vào phổ 1H-NMR 30 1.4.3 Một số phƣơng pháp khác định khối lƣợng phân tử dendrimer dẫn xuất .30 CHƢƠNG - NGHIÊN CỨU 32 2.1 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 iii 2.1.1 Nội dung nghiên cứu 32 2.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 2.2 THỰC NGHIỆM .48 2.2.1 Hóa chất 48 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 49 2.2.3 Thực nghiệm .50 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 72 3.1 TỔNG HỢP DENDRIMER PAMAM TỪ THẾ HỆ G-0.5 ĐẾN G3.0 72 3.1.1 Xác định cấu trúc dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-MNR 72 3.1.2 Xác định khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối lƣợng MS .79 3.1.3 Xác định khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR ………………………………………………………………………… 80 3.2 BIẾN TÍNH DENDRIMER PAMAM VỚI TÁC NHÂN ALKYL 84 3.2.1 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride .84 3.2.2 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic 91 3.2.3 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol 95 3.2.4 Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine 99 3.3 BIẾN TÍNH DENDRIMER PAMAM G3.0 VỚI TÁC NHÂN HƢỚNG ĐÍCH – ACID FOLIC 105 3.4.1 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân hƣớng đích - acid folic 105 3.4.2 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với hexanoyl chloride tác nhân hƣớng đích - acid folic .108 3.4 KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO 112 3.5 KẾT QUẢ THÂM NHẬP TẾ BÀO 113 iv 3.6 XÁC ĐỊNH KÍCH THƢỚC NANO CỦA DENDRIMER G3.0 VÀ MỘT SỐ DẪN XUẤT 116 3.7 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG MANG VÀ NHẢ THUỐC 117 3.7.1 Khảo sát khả mang (nang hóa) thuốc chống ung thƣ 5-fluorouracil ………………………………………………………………………….117 3.7.2 Khảo sát khả nhả thuốc 119 KẾT LUẬN 120 KIẾN NGHỊ 122 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 123 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Đánh giá khối lƣợng phân tử PAMAM dẫn xuất dựa vào MALDI-TOF-MS [77] .29 Bảng 1.2: Khối lƣợng phân tử tính toán theo lý thuyết (WtLT) dendrimer PAMAM từ G-0.5 – G3.0 [1, 98] 31 Bảng 2.1: Tỉ lệ proton vị trí (e), (a) phân tử dendrimer (LT)của dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 42 Bảng 2.2: Tỉ lệ proton vị trí (j), (a) phân tử dẫn xuất alkyl-dendrimer PAMAM G3.0 (LT) .44 Bảng 2.3 Một số thông số vật lý hóa chất 48 Bảng 3.1: Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm dendrimer PAMAM từ hệ G-0.5 đến G3.0 .78 Bảng 3.2: Khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 sở khối phổ MS 79 Bảng 3.3: Tỉ lệ diện tích tín hiệu proton vị trí (a), (e) thể phổ 1HMNR (NMR) dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 80 Bảng 3.4: Khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 sở phổ 1H-NMR MS 82 Bảng 3.5: Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm khảo sát biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride theo thời gian 85 Bảng 3.6: Kết khảo sát biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride theo thời gian 87 Bảng 3.7: Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride .89 Bảng 3.8: Kết biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân acyl chloride .90 Bảng 3.9: Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0- acid carboxylic .92 Bảng 3.10: Kết biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic .93 Bảng 3.11 Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol .96 Bảng 3.12: Kết biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcoholhol .97 Bảng 3.13: Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm khảo sát nhiệt độ phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với dodecylamine 100 Bảng 3.14: Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với dodecylamine .101 Bảng 3.15: Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine .103 vi Bảng 3.16: Kết biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine 104 Bảng 3.17: Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm G3.0-FA 106 Bảng 3.18: Dữ liệu phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA 110 vii DANH MỤC CÔNG THỨC Công thức 2.1: Công thức tính khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM dựa phổ 1H-NMR .41 Công thức 2.2: Công thức tính độ chuyển hóa dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 thông qua phổ 1H-NMR 44 viii Phụ lục 12: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C14-EDC P14 Phụ lục 13: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C2-NPC P15 Phụ lục 14: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-NPC P16 Phụ lục 15: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C8-NPC P17 Phụ lục 16: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C12-NPC P18 Phụ lục 17: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C12-poC P19 Phụ lục 18: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C12-60oC P20 Phụ lục 19: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C12-80oC P21 Phụ lục 20: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C4 P22 Phụ lục 21: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C8 P23 Phụ lục 22: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C10 P24 Phụ lục 23: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA P25 Phụ lục 24: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3-C6-FA P26 Phụ lục 25: Xây dựng sơ đồ đƣờng chuẩn 5-FU 5-FU đƣợc pha với nồng độ khác từ 0.00125 -1 (mg/mL), bƣớc sóng 260 nm; tiêm mẫu 5µL; tốc độ dòng 1mL/phút.sau đo HPLC để xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn Bảng P1: Số liệu đƣờng chuẩn STT Nồng độ dung dịch chuẩn C(mg/ml) 0.00125 0.0025 0.005 0.01 0.1 Area[ ] 29.189 51.429 97.886 201.425 1605.171 14 800.000 Từ ta dựng đƣợc đồ thị nhƣ sau: Hình P1: Đồ thị đƣờng chuẩn 5-FU Từ đồ thị ta có phƣơng trình đƣờng chuẩn: y = 14732x + 45.442 (R2 =0.9999) P27 Phụ lục 26: Số liệu nhả thuốc dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA Bảng P2: Số liệu nhả thuốc dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA Thời gian 5-FU (mg) G3.0-C6-FA/5FU (mg) 5-FU % G3.0-C6/5FU % 12 24 1.981 2.111 2.132 2.133 2.163 1.16 1.88 1.93 2.12 2.12 90,046 95,956 96,955 96,954 98,322 73,6 85,6 87,5 96,5 96,5 P28 [...]... factor receptor) và kháng thể Anti-HER-2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor), biotin, thông qua các liên kết hóa học [3, 5-12] Chính vì những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang thuốc nano polyamidoamine (PAMAM) biến tính có khả năng hướng đích đến tế bào ung thư” 1 Mục tiêu của luận án Tổng hợp các thế hệ dendrimer PAMAM và biến tính bề mặt dendrimer... cho thuốc, giúp thuốc tránh khỏi sự đào thải bởi các các cơ chế bảo vệ của cơ thể (chuyển hóa ở gan, thải trừ qua thận, phân huỷ bởi các enzyme trong máu, tấn công của bạch cầu và hệ thống miễn dịch ) Các chất mang còn giúp phân tử thuốc đến đƣợc đích tác dụng mong muốn Tiêu chí quan trọng nhất đối với các chất mang đó là tính tƣơng hợp sinh học Chất mang thuốc có tác dụng nhƣ một tiền dƣợc (prodrug)... Khảo sát khả năng hƣớng đích của hệ chất mang thuốc chống ung thƣ 9 Khảo sát khả năng mang và nhả thuốc của hệ dendrimer PAMAM G3.0 -thuốc 2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy một số kết luận có ý nghĩa khoa học và thực tiễn sau: - Đề tài có giá trị trong việc nghiên cứu các hợp chất mang thuốc chống ung thƣ hƣớng đích, đó là những hợp chất chuyển thuốc chống ung thƣ đến... hoặc các peptide kháng nguyên (antigenic peptides) sẽ làm cho dendrimer có tính kháng nguyên cao, đặc biệt với vaccine hay tá dƣợc [25] 1.1.3 Các phƣơng pháp tổng hợp Dendrimer có thể tổng hợp bằng nhiều phƣơng pháp nhƣ phƣơng pháp tổng hợp từ trong ra ngoài (Divergent), phƣơng pháp tổng hợp từ ngoài vào trong (Convergent), phƣơng pháp tổng hợp từ ngoài vào trong hai bƣớc (Double-stage Convergent), phƣơng... hƣớng có thể là các kháng thể, các peptide, các aptamer, hoặc là các ligand carbohydrate có khả năng liên kết đặc hiệu với các kháng nguyên và thụ thể trên bề mặt tế bào ung thƣ So sánh giữa chất mang có phần tử định hƣớng và chất mang thông thƣờng, các chỉ số dƣợc động học là không có khác biệt, song hiệu quả điều trị đặc biệt đƣợc tăng lên [2, 50] Hình 1.17: Dendrimer mang thuốc đƣợc gắn các tác nhân. .. nhân hƣớng đích đến tế bào ung thƣ [50] Khi đƣợc gắn các tác nhân tƣơng tác đặc hiệu với tế bào ung thƣ, chất mang thuốc sẽ di chuyển đến đúng vị trí tế bào ung thƣ, tại đây có sự tƣơng tác kết hợp giữa tác nhân hƣớng đích của hệ chất mang thuốc và các thụ thể đặc trƣng của tế bào ung thƣ [51] Khi đó, hệ mang thuốc hƣớng đích đƣợc giữ lại trên màng tế bào và bắt đầu tiến hành nhập bào theo các hình thức... bằng các tác nhân alkyl hóa và tác nhân hƣớng đích (acid folic) nhằm mục đích xây dựng hệ chất nano mang thuốc chống ung thƣ có tính tƣơng hợp sinh học và phân phối thuốc đến đúng vị trí tế bào ung thƣ Để đạt đƣợc những mục tiêu trên, luận án đã thực hiện các nội dung sau 1 Tổng hợp dendrimer PAMAM (từ thế hệ G-0.5 đến G3. 0) 2 Xác định thành phần cấu trúc và khối lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM tổng. .. có các thụ thể đặc hiệu liên kết với tác nhân hƣớng đích nên các hệ mang thuốc hƣớng đích không tƣơng tác với màng tế bào Chất mang thuốc sẽ không bị giữ lại trên màng tế bào lành mà di chuyển đến tế bào ung thƣ, nơi có sự hấp dẫn tƣơng tác, tại đây quá trình phóng thích thuốc xảy ra, sau cùng là hệ chất mang này bị đào thải ra khỏi cơ thể [51, 53] 1.2 BIẾN TÍNH BỀ MẶT DENDRIMER PAMAM Với các đặc tính. .. lại tƣơng tác hóa - sinh học với các tế bào trong cơ thể do đó chúng gây độc cho tế bào Nhằm khắc phục những hạn chế trên và để cải thiện một số tính chất hỗ trợ cho việc mang thuốc đúng nơi và hiệu quả thì bề mặt dendrimer đƣợc biến tính bằng một trong các tác nhân tƣơng hợp sinh học nhƣ ankyl, PEG (Polyethylene Glycol), … kết hợp tác nhân hƣớng đích nhƣ acid folic, peptide RGD (Arg-Gly-Asp), Anti-EGFR... điểm của dendrimer PAMAM nhƣ tính tan, tính thấm, tƣơng hợp sinh học, hƣớng đích [1, 2, 25, 54-56] 19 1.2.1 Biến tính bề mặt dendrimer với tác nhân tƣơng hợp sinh học Để tăng tính tƣơng hợp sinh học cũng nhƣ hỗ trợ khả năng mang thuốc của dendrimer nói chung và dendrimer PAMAM nói riêng, các nhà nghiên cứu đã đề ra giải pháp biến tính bề mặt dendrimer PAMAM bằng cách gắn các nhóm thế khác lên bề mặt ... lý tiến hành thực đề tài: Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang thuốc nano polyamidoamine (PAMAM) biến tính có khả hướng đích đến tế bào ung thư” Mục tiêu luận án Tổng hợp hệ dendrimer PAMAM biến tính. .. dịch ) Các chất mang giúp phân tử thuốc đến đƣợc đích tác dụng mong muốn Tiêu chí quan trọng chất mang tính tƣơng hợp sinh học Chất mang thuốc có tác dụng nhƣ tiền dƣợc (prodrug) giúp giảm độc tính. .. hệ chất mang thuốc chống ung thƣ đa chức hƣớng đích đến tế bào ung thƣ Có hai cách mang thuốc hƣớng tới đích: mang thuốc tới đích thụ động mang thuốc tới đích chủ động 1.1.4.1 Dendrimer mang thuốc