Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp vật liệu ceo2 có cấu trúc nano nhằm ứng dụng trong cảm biến ADN (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU CeO2 CÓ CẤU TRÚC NANO NHẰM ỨNG DỤNG TRONG CẢM BIẾN ADN Ngành: Khoa học vật liệu Mã số: 9440122 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU Hà Nội – 2020 Cơng trình hoàn thành tại: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phương Đình Tâm GS.TS Trần Trung Phản biện 1: GS TS Trần Đại Lâm Phản biện 2: GS TS Lê Anh Tuấn Phản biện 3: PGS TS Phạm Đức Thắng Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi …… giờ, ngày … tháng … năm ……… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội Thư viện Quốc gia Việt Nam A MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ngày nay, bệnh dịch vi sinh vật gây mối hiểm hoạ lường trước Trong năm qua có hàng chục nghìn người chết loài vi sinh vật gây bệnh như: vi rút H5N1, SARS, vi khuẩn gây bệnh tả, vi rút viêm não Nhật Bản gây Trong số đó, bệnh thương hàn chủng vi khuẩn Salmonella gây khiến hàng chục triệu người mắc bệnh với số người chết lên tới hàng triệu người Theo thống kê Bộ y tế [1] Việt Nam tỷ lệ mắc thương hàn tính 100.000 dân năm: 2010 64,4; 2011 56,8, tỷ lệ tử vong 0,02/100.000 dân; tới năm 2016 0,58 Tính riêng cho đối tượng trẻ em số ca mắc thương hàn khuẩn Salmonella theo năm 2012, 2013, 2014, 2015 2016 là: 613, 706, 469, 492, 374 với số trẻ chết ghi nhận vào năm 2014 trẻ Do đó, việc nghiên cứu phương pháp phát vi sinh vật gây bệnh yêu cầu cấp thiết đặt cho nhà khoa học hãng cơng nghiệp Hiện nay, phương pháp phân tích nhanh vi sinh vật thường sử dụng PCR, ELISA, nuôi cấy tế bào phương pháp phân tích truyền thống cơng nghệ sinh học Trong đó, xét nghiệm miễn dịch ELISA phát Salmonella giới hạn 104 đến 105 CFU/mL, với thời gian làm giàu mẫu khoảng 16 h đến 24 h giới hạn cải thiện phương pháp phản ứng chuỗi PCR xuống tới CFU/mL [2] Việc lấy mẫu xét nghiệm đòi hỏi quy trình khắt khe, thí nghiệm phải thực phịng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn tổ chức Y tế giới, trang thiết bị đắt tiền Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển phương pháp bổ sung cho phương pháp việc cần thiết Trong đó, sử dụng cảm biến sinh học cho phương pháp hiệu quả, bổ sung cho phương pháp truyền thống cảm biến sinh học có độ nhạy, độ chọn lọc cao, dễ dàng sử dụng, thời gian phân tích nhanh cho kết tin cậy [2],[3] Cảm biến sinh học thiết bị phân tích sở kết hợp phần tử sinh học phận chuyển đổi tín hiệu để chuyển đổi tín hiệu sinh hố thành tín hiệu dễ dàng cho người quan sát Do phân tử sinh học tự gắn lên bề mặt cảm biến, cần có lớp vật liệu trung gian để cố định chuyển đổi phân tử sinh học Lớp vật liệu không gắn kết thành phần sinh học bề mặt cảm biến mà cịn đóng vai trị chuyển điện tích từ dung dịch đến bề mặt cảm biến Hiện nay, giới có nhiều loại vật liệu sử dụng để gắn kết phân tử sinh học lên bề mặt cảm biến ống nano cacbon [4][5], polyme dẫn [6], vật liệu xít kim loại bán dẫn [7], hạt nano kim loại [8], vật liệu xít kim loại đất [9] v.v CeO2 cấu trúc nano vật liệu hứa hẹn đói với cảm biến sinh học điện hóa đặc tính hấp dẫn tính bền hóa học, tương thích sinh học, khơng độc, bề mặt riêng cao, dẫn điện đặc tính vận chuyển electron cao CeO2 có lượng vùng cấm rộng, Eg = 3,4 eV điểm đẳng điện cao IEP = 9,2 Điều thích hợp cho việc hấp phụ phân tử có điểm đẳng điện thấp mà khơng cần xử lý hóa học [10] Tuy nhiên, cơng trình cơng bố chủ yếu sử dụng điện cực dạng màng cấu trúc đơn pha bao gồm hạt oxit kim loại để phát triển cảm biến sinh học có tượng giảm diện tích bề mặt riêng co cụm biên giới hạt, dẫn đến làm giảm khả hấp phụ tác nhân Để tránh tượng nêu trên, thường tạo lớp hấp phụ phân tử tác nhân bề mặt hạt, đồng thời nâng cao hiệu suất cảm biến: tăng độ nhạy, giảm giới hạn phát giới hạn định lượng, tác giả lựa chọn cách bao phủ nano CeO2 (vật liệu nghiên cứu) lớp màng mỏng poly pyrol (Ppy) để tạo vật liệu lai hóa Ppy@CeO2 cấu trúc lõi-vỏ Điều thú vị Ppy với giá trị hàm công (chênh lệch lượng mức Fermi lượng chân không) khoảng 5,0 eV [11] CeO2 có giá trị hàm công 5,34 eV [12] tiếp xúc electron lẻ Ppy dễ dàng chuyển sang orbital trống Ce với cấu hình 3d94f0 CeO2, tạo điều kiện thuận lợi cho việc hình thành liên kết cộng hóa trị “Salmonella ssADN dị” vỏ PPy Khi cấu trúc lõi-vỏ đảm bảo độ xốp, khoảng trống không gian chứa dung dịch có tác nhân phân tích để tạo cảm biến ADN vi khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu chẩy cấp người “Nghiên cứu tổng hợp vật liệu CeO có cấu trúc nano nhằm ứng dụng cảm biến ADN” đề tài mà nghiên cứu sinh hướng tới Theo việc tập trung nghiên cứu tổng hợp vật liệu CeO2 có cấu trúc dạng nano (CeO2 NRs) có kích thước phù hợp bề mặt che phủ lớp PPy tạo thành cấu trúc lõi-vỏ với lớp hấp phụ “Salmonella ssADN dò”, tạo thành cảm biến sinh học phát khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu chẩy người Mục tiêu nội dung nghiên cứu Mục tiêu chung đề tài phát triển cảm biến sinh học ADN sở vật liệu CeO2 có cấu trúc nano nhằm xác định vi khuẩn gây bệnh tiêu chẩy cấp Mục tiêu cụ thể:  Tổng hợp vật liệu nano chiều CeO2, vật liệu nano composits CeO2/Ppy có cấu trúc lõi vỏ  Phát triển cảm biến cảm biến ADN hiệu suất cao sở vật liệu nano chế tạo Nội dung nghiên cứu luận án - Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano CeO2 vật liệu CeO2@Ppy có cấu trúc lõi vỏ - Nghiên cứu cố định chuỗi ADN lên bề mặt cảm biến - Phát triển cảm biến ADN sở vật liệu chế tạo nhằm xác vi khuẩn gây bệnh tiêu chẩy cấp Phương pháp nghiên cứu - Trong trình thực luận án này, tác giả sử dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, bao gồm: - Vật liệu nano CeO2 tổng hợp phương pháp thuỷ nhiệt, vật liệu có cấu trúc lõi vỏ CeO2@Ppy tổng hợp phương pháp trùng hợp hoá học - Đặc trưng hình thái, cấu trúc vật liệu nghiên cứu phương pháp như: Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FESEM- JEOL/JSM-7600F); phổ tán xạ lượng tia X (EDS); phương pháp phân tích giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD); phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (FTIR), phương pháp phân tích nhiệt (TGA) thực thiết bị Labsys TG/DSC (SETARAM – Pháp) - Đặc trưng cảm biến nghiên cứu phương pháp quét tuần hoàn (CV) phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa (EIS) thực thiết bị IM6-Thales Viện AIST trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Trong bối cảnh ngày có nhiều loại dịch bệnh lồi vi sinh vật gây ra, đời công cụ phát sớm vi sinh vật cảm biến ADN quan trọng Trong nghiên cứu này, cảm biến sinh học phát triển sở vật liệu CeO2 có cấu trúc dạng nano vật liệu lai CeO2 polyme dẫn Cơ chế phát cảm biến giải thích rõ ràng sở tương tác chuỗi ssADN dị với ssADN đích Cảm biến ADN sau phát triển góp phần vào phát triển phương pháp phát vi sinh vật gây bệnh, ứng dụng lĩnh vực y sinh học mơi trường Những đóng góp luận án Những nghiên cứu luận án mang lại đóng góp bao gồm: - Đã tổng hợp vật liệu nano CeO2 có kích thước chiều dài ~ 200 nm đường kính ~20 nm phương pháp thủy nhiệt đơn giản với tiền chất ban đầu Ce(NO3)3.6H2O chất khống hóa Na3PO4, thời gian thủy nhiệt ngắn (24 h) nhiệt độ 200 ℃ Đã chế tạo vật liệu nano composit có cấu trúc lõi vỏ CeO2/Ppy phương pháp hóa học với chế độ tổng hợp tối ưu tỷ lệ tiền chất CeO2/Py = 1/10, thời gian tổng hợp h dung dịch chứa FeCl3.6H2O - Đã phát triển cảm biến ADN điện hóa sở vật liệu nano CeO2 nhằm xác định chuỗi ADN vi khuẩn Salmonella với giới hạn phát độ nhạy cảm biến ADN tương ứng 0,01 µM 3362,1 ΩµM-1cm-2 Khoảng phát tuyến tính 0,01 µM đến µM - Đã phát triển cảm biến sinh học ADN dựa vật liệu nano composit cấu trúc lõi-vỏ CeO2-NR@Ppy nhằm phát vi khuẩn Salmonella với khoảng tuyến tính 0,01-0,4 nM với độ nhạy 593,7 ΩnM-1cm-2 Giới hạn phát giới hạn định lượng cảm biến ADN thấp tương ứng 0,084 0,28 nM Cấu trúc luận án Bản luận án trình bày theo bố cục sau: MỞ ĐẦU Chương 1: Trình bày tổng quan “Cảm biến sinh học điện hóa” Chương 2: Trình bày kết “Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano CeO2 nano composit CeO2@Ppy” Chương 3: Trình bày kết nghiên cứu “Phát triển cảm biến ADN sở nano CeO2” Chương 4: Trình bày kết nghiên cứu “Cảm biến sinh học ADN sở vật liệu nano composit CeO2@Ppy” KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chuỗi ADN ADN có tên gọi đầy đủ axit deoxyribo nucleic cấu tạo chuỗi polyme sinh học poly nucleotit liên kết với hình thành cấu trúc xoắn kép xung quanh trục tưởng tượng Khi đun nóng vượt nhiệt độ sinh lý (khoảng 80÷90 ℃) chuỗi ssADN dsADN xoắn kép tách tạo thành hai chuỗi đơn Do A liên kết với T liên kết hydro nên liên kết AT bị đứt trước G liên kết với C liên kết hydro bền vững nên bị đứt sau khoảng nhiệt độ lớn 90 ℃ Hiện tượng gọi tượng biến tính ADN Nhiệt độ mà chuỗi ssADN chuỗi dsADN cấu trúc xoắn kép tách gọi điểm chảy (melting point)-Tm ADN Giá trị T m đặc trưng cho chuỗi dsADN phụ thuộc vào số liên kết A-T G-C có chuỗi dsADN 1.2 Cơ sở lý thuyết phương pháp điện hóa sử dụng nghiên cứu cảm biến ADN Các phương pháp điện hóa sử dụng nghiên cứu cảm biến ADN hoạt động dựa sở bình điện hóa điện cực bao gồm: điện cực làm việc (WE), điện cực đối hay điện cực tham chiếu (CE), thường sử dụng điện cực Pt C graphit, điện cực so sánh (RE) có điện điện cực khơng đổi, thường dùng điện cực Ag/AgCl Để thực phép đo điện hóa, điện cực kết nối với hệ đo điện hố có phần mềm điều khiển máy tính 1.2.1 Phương pháp qt vịng 1.2.2 Phương pháp quét xung vi phân 1.2.3 Phương pháp quét sóng vng 1.2.4 Phương pháp phổ tổng trở điện hóa 1.3 Các phương pháp cố định chuỗi ssADN 1.3.1 Hấp phụ vật lý 1.3.2 Cố định liên kết cộng hóa trị 1.3.3 Cố định thơng qua tương tác Avidin/Streptavidin-Biotin 1.3.4 Cố định phương pháp điện hóa 1.4 Phương pháp phát lai hóa ADN 1.4.1 Phương pháp đánh dấu 1.4.2 Phương pháp không đánh dấu 1.5 Ứng dụng cảm biến sinh học Chương 2: NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU THANH NANO CeO2 & NANO COMPOSIT CeO2@Ppy 2.1 Đặt vấn đề 2.2 Thực nghiệm 2.2.1 Hóa chất, thiết bị 2.2.2 Tổng hợp vật liệu nano CeO2 CeO2 tổng hợp từ Ce(NO3)3.6H2O với có mặt chất tạo mầm Na3PO4 bình thủy nhiệt nhiệt độ từ 170 đến 220 ℃, thời gian từ 20 đến 28 h Nồng độ tiền chất khảo sát từ 0,1 M đến 0,5 M nồng độ chất tạo mầm khảo sát từ 1% đến 6% Quy trình tổng hợp nano CeO2 mơ tả Hình 2.1: Hình 2.1: Quy trình tổng hợp vật liệu nano CeO2 phương pháp thủy nhiệt 2.2.3 Tổng hợp vật liệu nano composit CeO2@Ppy Ppy mọc trực tiếp lên nano CeO2 cách trùng hợp hóa học từ monome pyrol với có mặt chất oxy hóa FeCl3 dung dịch có sẵn nano CeO2 tổng hợp chế độ tối ưu phần 2.2.2 Quy trình tổng hợp vật liệu CeO2@Ppy mơ tả Hình 2.2: Hình 2.2: Quy trình tổng hợp CeO2@Ppy 2.3 Kết thảo luận 2.3.1 Kết tổng hợp vật liệu nano CeO2 a) Ảnh hưởng nồng độ chất tạo mầm Na3PO4 Khi chất tạo mầm % % cho thấy, nano CeO2 có kích thước đồng đều, với chiều dài xấp xỉ 200 nm đường kính khoảng 20 nm (Hình 2.3) Hình 2.3: Ảnh FESEM CeO2 NRs phụ thuộc nồng độ chất tạo mầm Na3PO4 (a)– 1%; (b)– 2%; (c)– 3%; (d)– 4%; (e)– 5%; (f)– 6% Giản đồ nhiễu xạ tia X (Hình 2.4) cho thấy với nồng độ chất tạo mầm 4% nano CeO2 thu lẫn tạp chất nên nồng độ chất tạo mầm tối ưu lựa chọn % Hình 2.4: Phổ nhiễu xạ tia X CeO2 nồng độ chất tạo mầm là: (a)-4 %; (b)-5 % b) Ảnh hưởng nồng độ Ce3+ Nồng độ tiền chất Ce3+ thay đổi 0,1 M; 0,2 M; 0,3 M; 0,4 M; 0,5 M Các kết nghiên cứu biểu diễn Hình 2.5: a) Ảnh hưởng tỷ lệ CeO2 – pyrol tham gia phản ứng Hình 2.13: Ảnh hưởng tỷ lệ CeO2/Py đến hình thái nano composit CeO2- Ppy đặc trưng FESEM: (a) – 1/5; (b) – 1/10; (c) – 1/20 Tỷ lệ CeO2/Py khảo sát tỷ lệ sau: 1/5; 1/10 1/20 mô tả Hình 2.13 Tỷ lệ CeO2/ Py định đến tương quan tỷ lệ CeO2 Ppy tạo thành Tỷ lệ CeO2/Py = 1/10 lựa chọn giá trị tối ưu cho trình tổng hợp vật liệu nano composit b) Ảnh hưởng thời gian polyme hóa Hình 2.14: Ảnh hưởng thời gian polyme hóa đến hình thái bề mặt nano composit CeO2-Ppy đặc trưng FESEM: (a) – h; (b) – h; (c) – h; (d) – h; (e) – h; (f) – 10 h 12 Q trình polyme hóa thực khoảng thời gian khác nhau: h, h, h, h, h 10 h Kết Hình 2.14 Cấu trúc lõi vỏ thu rõ thời gian polyme hóa h Sản phẩm quan sát kỹ thơng qua ảnh FESEM TEM Hình 2.15 Hình 2.15: Hình thái cấu trúc nano composit cấu trúc lõi-vỏ CeO2 NR@Ppy đặc trưng bởi: (a)- FESEM (b) –TEM Quan sát ảnh ta thấy, vật liệu thu có cấu trúc lõi vỏ với vật liệu lõi nano CeO2 nằm bao bọc lớp vỏ vật liệu poly pyrol Độ tinh khiết vật liệu tạo thành khảo sát thông qua phổ EDS (Hình 2.16) cho thấy vật liệu tạo thành có lượng nhỏ P (5,8 % nguyên tử) cho thấy sản phẩm thu có độ tinh khiết cao Hình 2.16: Phổ EDS nano composit cấu trúc lõi-vỏ CeO2 NR@Ppy c) Giản đồ nhiễu xạ tia X phổ FTIR vật liệu Thành phần cấu tạo cấu trúc vật liệu đặc trưng giản đồ nhiễu xạ tia X phổ hồng ngoại FTIR (Hình 2.17): 13 Hình 2.17: (A)- Giản đồ nhiễu xạ tia X (B)- phổ FT-IR mẫu vật liệu Các đỉnh nhiễu xạ CeO2 NRs góc 2 28,6, 33,1, 47,6, 56,5 tương ứng với mặt (111), (200), (220), (311) cấu trúc lập phương flourit [Hình 2.17 (A)] Các đỉnh tương ứng với mẫu nhiễu xạ CeO2 thẻ JCP2.CAT: 04-0593 Các dải hấp thụ đặc trưng cho liên kết CeO2, Ppy CeO2@Ppy xuất phổ FTIR [Hình 2.17 (B)] Kết luận chương Chế độ tối ưu để tổng hợp nano CeO2 sau: nồng độ tiền chất Ce(NO3)3.6H2O 0,4 M, nồng độ chất tạo mầm Na3PO4 %, nhiệt độ thủy nhiệt 200 ℃, thời gian thủy nhiệt 24 h Chế độ tối ưu để tổng hợp vật liệu nano composit có cấu trúc lõi vỏ CeO2@Ppy sau: tỷ lệ CeO2/Py = 1/10, thời gian polyme hoá h Chương 3: PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN ADN TRÊN CƠ SỞ CÁC THANH NANO CeO2 3.1 Đặt vấn đề Cảm biến sinh học sở vật liệu chức nano CeO2 composit với Ppy chưa nghiên cứu dừng lại cảm biến enzym, cảm biến miễn dịch Khơng có nhiều báo cáo cảm biến ADN sử dụng vật liệu nano CeO2 để phát vi sinh vật gây bệnh Trong phạm vi luận án, tác giả nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa ADN sở 14 nano CeO2 để phát vi khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu chẩy cấp người Thực nghiệm 3.2.1 Hóa chất Các hóa chất sử dụng mua từ hãng Sigma Aldrich Các chuỗi nucleotid tổng hợp mua từ Invitrogen Co., Ltd (Bảng 3.1): Bảng 3.1: Các chuỗi nucleotit tổng hợp dùng nghiên cứu Thơng tin chuỗi ssADN Tên ssADN dị 5’-GGC TGG TAC CAC CTC TTC TAC CAT GG-3’ ssADN đích 3’-CCG ACC ATG GTG GAG AAG ATG GTA CC-5’ Herpes vi rút 5’-TTG CTG GCC AAG CTG ACG GAC A-3’ E.coli O157:H7 5’-AACGC CGATA CCATT ACTTA TACCG CGACG-3’ 3.2.2 Cố định ssADN Các chuỗi ssADN cố định lên bề mặt cảm biến thơng qua liên kết cộng hóa trị 3.2.3 Các phép đo điện hóa Phần mềm phổ tổng trở IM6 với thiết bị IM6 – THALES sử dụng để phát lai hóa ADN dị ADN đích 3.3 Kết thảo luận 3.3.1 Kết cố định chuỗi ssADN Dải hấp thụ đặc trưng liên kết có mẫu vật liệu CeO2, chuỗi ssADN ssADN/CeO2 xuất phổ FTIR mẫu vật liệu Hình 3.3: 15 Hình 3.3: Phổ FTIR của: a) CeO2; b) chuỗi ADN c) ssADN/CeO2 Phổ UV-Vis (Hình 3.4) ảnh huỳnh quang (Hình 3.5) điện cực biến tính CeO2 CeO2/ssADN sử dụng để khảo sát cố định chuỗi ssADN lên điện cực: Hình 3.4: Phổ UV-vis (a)- ssADN (b)- ssADN/CeO2 Hình 3.5: Ảnh huỳnh quang cảm biến sở CeO2 NRs (a)- Chưa cố định ssADN; (b)- Đã cố định ssADN 3.3.2 Đặc trưng cảm biến ADN Đặc trưng cảm biến nghiên cứu thông qua phổ tổng trở điện hóa đo dung dịch đệm phốt phát, pH = có chứa 20 mM K3Fe(CN6) chất dị oxy hóa khử (Hình 3.6) Kết ra, sau bước xử lý bề mặt điện cực cảm biến: phủ CeO2, cố định chuỗi ssADN dị lai hóa chuỗi ssADN dị với ssADN đích điện trở chuyển điện tích Ret có giá trị đường kính phần bán nguyệt giản đồ Nyquist, điện cực lại tăng lên Đây kết cản trở trao đổi chuyển điện tích đầu dị oxy hóa khử với bề mặt điện cực lớp màng vật liệu khác 16 Hình 3.6: Giản đồ Nyquist đo dung dịch đệm pH = (a)- Au; (b)- Au/ CeO2; (c)- Au/CeO2/ssADN; (d)- Au /CeO2/dsADN Hình 3.7 mơ tả phụ thuộc giá trị điện trở chuyển điện tích Ret với nồng độ ssADN đích Hình 3.7: Tín hiệu cảm biến ADN phụ thuộc vào [dsADN] Giá trị Ret tăng tuyến tính nồng độ ADN đích tăng từ 0,01 µM đến µM Giới hạn phát cảm biến 0,01 µM độ nhạy cảm biến 3362,1 Ω µM-1cm-2 3.3.3 Tối ưu hóa điều kiện thực nghiệm a) Ảnh hưởng pH b) Ảnh hưởng nồng độ ion dung dịch đệm c) Ảnh hưởng nồng độ ssADN dị d) Ảnh hưởng thời gian lai hóa Kết tối ưu hóa điều kiện thực nghiệm Hình 3.8 đến Hình 3.11 cho thấy, điều kiện làm việc tối ưu cảm biến pH = 7; [Na+] = 120 mM; [ssADN dò] = 30 µM; thời gian lai hóa 40 phút 17 Hình 3.8: Ảnh hưởng pH đến tín hiệu cảm biến Hình 3.9: Ảnh hưởng nồng độ ion đến tín hiệu cảm biến Hình 3.10: Ảnh hưởng nồng độ ssADN dị đến tín hiệu cảm biến Hình 3.11: Ảnh hưởng thời gian lai hóa đến tín hiệu cảm biến 3.3.4 Độ lặp lại, độ ổn định, tính chọn lọc khả tái sử dụng Cảm biến cho thấy độ lặp lại, độ ổn định, tính chọn lọc khả tái sử dụng tốt thể thông qua sơ đồ Hình 3.12 Kết cho thấy độ lệch chuẩn tương đối phép đo điều kiện thí nghiệm cho 10 cảm biến 3,5%, điều khẳng định cảm biến ADN có độ lặp lại tốt [Hình 3.12- (a)] Hình 3.12- (b) thấy, tín hiệu cảm biến khơng thay đổi vịng 30 ngày Sau đó, tín hiệu đáp ứng cảm biến ADN giảm xấp xỉ 2,24%; 8,62% 10,34% tương ứng với 40, 50 60 ngày cho thấy cảm biến có độ ổn định tốt Cảm biến cho tín hiệu thay đổi tiếp xúc với chuỗi ssADN khuẩn Salmonella cho thấy cảm biến có độ chọn lọc cao Ngồi cảm biến sau đo biến tính tiếp tục sử dụng để lai hóa với chuỗi ssADN đích Tín hiệu tạo giảm xấp xỉ 3,5 % so với ban đầu cho thấy cảm biến thu có khả tái sử dụng 18 Hình 3.12: Các đặc trưng cảm biến sở CeO2 NRs (a) Độ lặp lại; (b) Độ ổn định; (c) Tính chọn lọc; (d) Khả tái sử dụng Kết luận chương Cảm biến điện hóa ADN sở nano CeO2 ứng dụng cho việc phát lai hóa chuỗi ssADN vi khuẩn Salmonella chế tạo thành công Giới hạn phát độ nhạy cảm biến ADN 0,01 µM 3362,1 Ω µM-1cm-2 Khoảng tuyến tính cảm biến từ 0,01 µM đến µM Thời gian lưu giữ cảm biến cho tín hiệu giảm không 3% 40 ngày Chương 4: CẢM BIẾN SINH HỌC ADN TRÊN CƠ SỞ VẬT LIỆU NANO COMPOSIT CeO2@Ppy 4.1 Đặt vấn đề Các vật liệu cấu trúc lõi vỏ CeO2@CPs cho ứng dụng cảm biến sinh học điện hóa cơng bố nhiều nhóm nghiên cứu Tuy nhiên, vật liệu cấu trúc lõi-vỏ với lõi nano CeO2 vỏ Ppy chưa nghiên cứu ứng dụng cảm biến sinh học ADN nhằm phát vi khuẩn, vi rút gây bệnh người Đó lý tác giả nghiên cứu ứng dụng vật liệu cấu trúc lõi vỏ CeO2 NR@Ppy tổng hợp cho cảm biến sinh học ADN nhằm phát chuỗi ssADN khuẩn Salmonella 4.2 Thí nghiệm 4.2.1 Hóa chất 4.2.2 Cố định chuỗi ssADN dị lên bề mặt điện cực Các chuỗi ssADN dò cố định phương pháp liên kết cộng hóa trị lên bề mặt điện cực 19 4.2.3 Phân tích điện hóa Thiết bị phân tích phổ tổng trở với phần mềm IM6-THALES sử dụng để phát lai hóa dung dịch đệm có chứa 20 mM [Fe(CN)6]3-/4- làm chất dị oxy hóa khử 4.3 Kết thảo luận 4.3.1 Kết cố định ssADN Ảnh huỳnh quang (Hình 4.1) cho thấy điện cực cố định chuỗi ssADN cho ảnh có chấm sáng màu xanh chứng tỏ ssADN cố định thành công lên điện cực Hình 4.1: Ảnh huỳnh quang cảm biến sở CeO NR@Ppy (a)- Chưa cố định ssADN dò; (b)- Đã cố định chuỗi ssADN dò 4.3.2 Đặc trưng điện hóa cảm biến sinh học ADN Phổ tổng trở EIS điện cực Au; Au/CeO2 NR@Ppy; Au/CeO2 NR@Ppy/ssADN; Au/CeO2 NR@Ppy/dsADN mẫu trống Hình 4.3 cho thấy: điện trở chuyển điện tích tăng điện cực phủ thêm lớp vật liệu khác Hình 4.3: Đường cong CV- (A) đồ thị Nyquist cảm biến- (B) Độ nhạy cảm biến sinh học ADN nghiên cứu cách kiểm tra đáp ứng cảm biến thay đổi nồng độ chuỗi ssADN đích (Hình 4.4): 20 Hình 4.4: Giản đồ Nyquist (a) đồ thị ∆Ret (b) phụ thuộc [ssADN đích] Cảm biến cho độ nhạy tốt 593,7 Ω.nM-1.cm-2, giá trị LOD LOQ đạt tương ứng 0,084 0,28 nM 4.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng số thơng số đến tín hiệu cảm biến a) Ảnh hưởng nhiệt độ lai hóa b) Ảnh hưởng thời gian cố định c) Ảnh hưởng thời gian lai hoá Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu cảm biến thể thơng qua sơ đồ Hình 4.5 Kết nhiệt độ lai hóa tối ưu 50 ℃, thời gian cố định thời gian lai hóa tối ưu 60 phút Hình 4.5: Tối ưu điều kiện thực nghiệm 4.3.4 Độ chọn lọc, độ lặp lại độ ổn định cảm biến sinh học ADN Để nghiên cứu độ chọn lọc cảm biến, thực cách so sánh tín hiệu lai hóa chuỗi đột biến với chuỗi bổ sung đầy đủ Tín hiệu cảm biến không thay đổi mẫu đối chứng âm Tuy nhiên, sau lai hóa với chuỗi bị đột 21 biến gen, giá trị ∆Ret 18 Ω, tăng 5,86% so với giá trị ∆Ret điện cực đo dung dịch đệm [Hình 4.6- A(c)] Khi chuỗi ssADN dị lai hóa với chuỗi bổ sung đầy đủ, ∆Ret tiếp tục tăng đạt tới 33 Ω, tương ứng với 10,74% [Hình 4.6- A(d)] Những kết cho thấy cảm biến sinh học ADN có tính chọn lọc chấp nhận Để đánh giá độ lặp lại cảm biến ADN, 10 cảm biến ADN sử dụng để phát 0,2 nM chuỗi ssADN đích Như Hình 4.6- (C), độ lệch chuẩn tương đối phép đo 10 cảm biến sinh học xấp xỉ 2,0%, điều khẳng định độ lặp lại cảm biến ADN chấp nhận Hình 4.6: Các đặc trưng riêng cảm biến Để nghiên cứu độ ổn định, điện cực cố định chuỗi ssADN dò bảo quản tủ lạnh ℃ thời gian tháng, sau sử dụng để đánh giá độ ổn định thơng qua phép đo phổ tổng trở điện hóa EIS Như Hình 4.6- (D), tín hiệu cảm biến không thay đổi sau 40 ngày lưu trữ tủ lạnh Sau đó, tín hiệu giảm xấp xỉ 23,34%, 47,17% 91,35%, tương ứng với 60, 70 80 ngày Khi thời gian tăng lên 90 ngày, tín hiệu cảm biến khơng ghi nhận phần mềm đo phổ tổng trở EIS Điều hoạt tính sinh học 22 chuỗi ssADN dị giảm dẫn tới khơng thể bắt cặp với chuỗi bổ sung 4.3.5 Xác định vi khuẩn Salmonella phương pháp PCR so sánh với số liệu phát cảm biến ADN Cảm biến ADN sử dụng để xác định mẫu thực vi khuẩn Salmonella Kết sau so sánh với phương pháp phản ứng chuỗi polyme PCR Kết điện di gen 200 bp xuất số (Hình 4.8-(a)) Khơng có dải phổ tìm thấy sử dụng phương pháp PCR để xác định mẫu đối chứng âm Kết phát chuỗi ssADN mẫu thật vi khuẩn Salmonella sử dụng cảm biến ADN biểu diễn Hình 4.8 - (b) cho thấy hai phương pháp cho kết xác định ssADN khuẩn Salmonella Hình 4.8: So sánh kết phát mẫu vi khuẩn Salmonella phương pháp PCR với số liệu cảm biến ADN 4.4 Kết luận chương Với điều kiện tối ưu, cảm biến sinh học ADN có khoảng phát tuyến tính từ 0,01 nM đến 0,4 nM, với độ nhạy 593,7 Ω.nM-1.cm-2 Chỉ số LOD LOQ cảm biến ADN đạt tương ứng 0,084 0,28 nM Hơn cảm biến sinh học sử dụng để phát mẫu ssADN khuẩn Salmonella thực tế 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trong khuôn khổ luận án, tác giả đã: Chế tạo vật liệu nano CeO2 có kích thước chiều dài xấp xỉ 200 nm đường kính xấp xỉ 20 nm chế độ tổng hợp tối ưu 24 h, nhiệt độ 200 ℃, nồng độ tiền chất ban đầu Ce3+ 0,4 M nồng độ chất khống hóa Na3PO4 4% phương pháp thủy nhiệt Bọc Ppy lên nano CeO2 để tạo vật liệu nano composit có cấu trúc lõi – vỏ chế độ tổng hợp tối ưu tỷ lệ tiền chất CeO2/Py = 1/10, thời gian tổng hợp h dung dịch chứa FeCl3.6H2O với hàm lượng 50 g 100 ml dung dịch, phương pháp trùng hợp hóa học Phát triển cảm biến ADN điện hóa nhằm phát chuỗi ssADN vi khuẩn Salmonella sở vật liệu nano CeO2 Cảm biến có giới hạn phát độ nhạy tương ứng 0,01 µM 3362,1 ΩµM-1cm-2 Khoảng phát tuyến tính tìm thấy từ 0,01 µM đến µM Thời gian lưu giữ cảm biến dung dịch đệm Tris HCl (pH = 7) 40 ngày để tín hiệu giảm khơng q % Phát triển cảm biến ADN dựa vật liệu nano composit cấu trúc lõi-vỏ CeO2 NR@Ppy để phát đoạn ssADN Salmonella Dưới điều kiện tối ưu, cảm biến sinh học ADN thu thể khoảng tuyến tính rộng 0,01÷0,4 nM với độ nhạy 593,7 Ω.nM-1.cm-2 Giới hạn phát giới hạn định lượng cảm biến ADN tương ứng 0,084 0,28 nM Hơn nữa, cảm biến sinh học phát triển sử dụng để phát mẫu ADN khuẩn Salmonella thực tế Kiến nghị: Cần có nghiên cứu sâu để mọc trực tiếp nano CeO2 lên bề mặt cảm biến nhằm giảm tối đa điện trở tiếp xúc vật liệu cảm biến Ngoài ra, cần tiếp tục nghiên cứu, phát triển cảm biến ADN sở CeO2 vật liệu có cấu trúc nano khác, để phát số chủng vi khuẩn/virus khác như: Mycobacterium Tuberculosis, Zica virus, H5N1, SARS… 24 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN A Tạp chí quốc tế Nguyen Thi Nguyet, Le Thi Hai Yen, Pham Hung Vuong, Phu ong Dinh Tam, Tran Trung (2018), “Highly sensitive DNA sensors based on cerium oxide nanorods”, Journal of Physics and Chemistry of Solids, Vol.115, pp 18-25 IF: 2.207 Nguyen Thi Nguyet, Vu Y Doan, Nguyen Luong Hoang, Vu Van Thu, Tran Trung, Pham Hung Vuong, Phuong Dinh Tam (2019), “A label-free and highly sensitive DNA biosensor based on the core-shell structured CeO2-NR@ Ppy nanocomposite for Salmonella detection”, Materials Science and Engineering: C, Vol.96, pp 790-797.IF: 5.08 Nguyen Thi Nguyet, Vu Van Thu, Hoang Lan, Tran Trung, AnhTuan Le, Vuong-Hung Pham, Phuong Dinh Tam (2019), “Simple Label-Free DNA Sensor Based on CeO2 Nanorods Decorated with Ppy Nanoparticles”, Journal of Electronic materials IF: 1.676 B Tạp chí nước Nguyen Thi Nguyet, Tran Trung, Hoang Lan, Vu Van Thu, Pham Hung Vuong, Phuong Dinh Tam (2019), “Direct synthesis of CeO2 nanospindles on gold electrode by electrochemical method”, Vietnam Journal of Chemistry, Vol.57, pp 57-63 C Kỷ yếu hội nghị Nguyễn Thị Nguyệt, Lê Thị Hải Yến, Phương Đình Tâm, Trần Trung (2017), “Nghiên cứu chế tạo hạt nano CeO2 phương pháp điện hóa”, Hội nghị Vật liệu Công nghệ Nano Tiên tiến-WANN 2017, pp 175-179 Le Thi Hai Yen, Nguyen Thi Nguyet, Vu Van Thu, Hoang Lan, Tran Trung, Pham Hung Vuong, Dinh Van Tuan, Nguyen Thi Thuy, Phuong Dinh Tam (2017), “A facile approanch for preparation of core-shell nanostructured Cerium dioxide nanorods@Polypyrrole via in situ Polymerization”, Hội nghị Vật liệu Công nghệ Nano Tiên tiến-WANN 2017, pp 180-186 Nguyen Thi Nguyet, Dang Thi Thuy Ngan, Nguyen Duc Dung, Pham Hung Vuong, Tran Trung, Tuan Duong Anh, Tu Le Manh, Phuong Dinh Tam (2019), “On the electrochemical synthesis of CeO2/Ppy nanocomposite: cyclic voltammetry technique”, Hội nghị Vật lý Chất rắn Khoa học Vật liệu Toàn quốc – SPMS 2019, No.2, pp 484-488 26 ... tổng hợp vật liệu CeO có cấu trúc nano nhằm ứng dụng cảm biến ADN? ?? đề tài mà nghiên cứu sinh hướng tới Theo việc tập trung nghiên cứu tổng hợp vật liệu CeO2 có cấu trúc dạng nano (CeO2 NRs) có. .. vật liệu nano composits CeO2/ Ppy có cấu trúc lõi vỏ  Phát triển cảm biến cảm biến ADN hiệu suất cao sở vật liệu nano chế tạo Nội dung nghiên cứu luận án - Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano CeO2. .. ? ?Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano CeO2 nano composit CeO2@ Ppy” Chương 3: Trình bày kết nghiên cứu “Phát triển cảm biến ADN sở nano CeO2? ?? Chương 4: Trình bày kết nghiên cứu ? ?Cảm biến sinh học ADN