tài liệu sắc ký điều chế

Sử dụng một lượng nhỏ dung môi → có thể triển khai nhiều lần để thu được kết quả phân táchtốt hơn, dễ dàng tách các vùng chứa chất hấp phụ ra khỏi bản mỏng, có thể triển khai đồng thờicá

I SẮC KÝ LỚP MỎNG ĐIỀU CHẾ

Nguyên tắc – yêu cầu:

Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative thin layer chromatography – PTLC) là một phương phápsắc ký được sử dụng để tách một lượng nhỏ đơn chất (10 – 1000 mg) từ một hỗn hợp đơn giản(chỉ gồm vài cấu tử) Trong PTLC, một dung dịch mẫu thử được chấm trên một lớp chất hấp phụ(thường là silica gel, nhôm oxyd) có độ dày từ 0,5 – 2,0 mm tráng trên nền phẳng (kính, kimloại, chất dẻo) đóng vai trò là một pha tĩnh Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọctheo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau tạo thànhmột sắc ký đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau Sau khi khai triển, ta có thể thu được những cấu

tử đặc trưng bằng cách cạo vùng chất hấp phụ chứa vết ra khỏi bản và phản hấp phụ chất ra khỏigiá hấp phụ bằng một dung môi thích hợp Hợp chất thu được từ bản mỏng có thể được tinhkhiết hóa tiếp tục bằng sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography – TLC) hay các phươngpháp sắc ký khác hoặc hợp chất này đã đạt độ tinh khiết để tiến hành định tính, xác định cấu trúcbằng các phương pháp phân tích cơ bản hay bằng phép đo quang phổ, nghiên cứu hoạt tính sinhhọc, nghiên cứu tổng hợp hóa học, sử dụng như chất chuẩn đối chiếu

Ưu điểm:

Phương pháp tiến hành của PTLC nhìn chung tương tự như TLC chỉ khác ở việc sử dụng nhữngbản mỏng dày hơn so với TLC: PTLC 0,5 – 2 mm, có thể dày đến 10 mm tùy yêu cầu sử dụng;TLC 0,2 – 0,25 mm

So với sắc ký cột:

Nhanh và thuận tiện hơn so với sắc ký cột cổ điển

Dễ tìm được dung môi thích hợp để tách các chất

Vùng chứa chất tụ thành lớp mỏng dễ phát hiện, dễ cô lập

Tỉ lệ giữa silicagel và chất tách cao nên tách tốt hơn

Rẻ, đơn giản hơn so với HPLC Thiết bị, thao tác đơn giản dễ nắm bắt và áp dụng

Sử dụng một lượng nhỏ dung môi → có thể triển khai nhiều lần để thu được kết quả phân táchtốt hơn, dễ dàng tách các vùng chứa chất hấp phụ ra khỏi bản mỏng, có thể triển khai đồng thờicác chất chuẩn đối chiếu trong cùng một điều kiện xác định giúp tạo thuận lợi cho việc xác địnhhợp chất mong muốn

UV, IR, khảo sát cấu trúc và làm chất chuẩn

3 Pha tĩnh:

Pha tĩnh hay sử dụng trong PTLC là các chất hấp phụ, các chất hấp phụ này phần lớn có trộnthêm chất kết dính như CaSO4 5 – 15 %, tinh bột 2 – 5 %, dextran, nhưng cũng có trường hợpkhông dùng chất kết dính

3.1 Silica gel:

Là một chất phân cực, hoạt động chủ yếu theo cơ chế hấp phụ, trung tâm hấp phụ là các nhóm –

OH silanol → hấp phụ các chất có tính kiềm (alkaloid base ) hơn là các chất có tính acid(polyphenol )

Mật độ nhóm silanol càng cao (VD: hạt càng mịn), khả năng hấp phụ của silica gel sẽ càng lớn Khả năng hấp phụ của silica gel phụ thuộc vào phụ thuộc vào tình trạng ngậm nước của hệ thống

→ khi dùng silica gel làm chất hấp phụ thì nên sấy silica gel ở 1050C trong 2h là đủ, đừng nungquá 4500C

3.2 Nhôm oxyd:

Có 3 dạng: oxyd nhôm kiềm, trung tính, acid

Là một chất hấp phụ phân cực mạnh, có tính trao đổi ion lưỡng tính

Trung tâm hấp phụ là các nhóm OH, khi các trung tâm hoạt động này bị hút ẩm, oxyd nhôm sẽgiảm hoạt tính Muốn hoạt hóa nó, người ta sấy để loại bỏ lượng nước hấp phụ này đi Nhiệt độsấy càng cao, lượng nước hấp phụ càng giảm đi, oxyd nhôm càng hoạt động

Oxyd nhôm có nhiều cỡ hạt, hạt càng bé khả năng hấp phụ càng cao

Si-O-Si-Khi –R là mạch hydrocarbon kém phân cực (2C, 6C, 8C, 18C) ta có silica gel ghép pha đảo, đây

là các chất phân bố không phân cực

Khi –R là mạch phân cực ta có silica gel ghép pha thuận, đây là các chất hấp phụ yếu nếu so vớicác silica gel không ghép

3.5 Các pha tĩnh khác:

Polyamid, nhựa trao đổi ion loại ionit vô cơ – hữu cơ, Kieselguhr

Chọn dung môi:

Có độ tinh khiết cao, tránh chứa các vết kim loại

Dung môi không quá dễ bay hơi

Thay đổi dung môi:

Khả năng tách riêng các hợp chất bằng PTLC tùy thuộc tỉ lệ phân phối của các hợp chất nàygiữa chất hấp phụ và dung môi ly giải

Thường ly giải với hỗn hợp dung môi nhưng tránh sử dụng hỗn hợp dung môi có nhiều hơn 2cấu tử (vì hỗn hợp phức tạp dễ dẫn đến việc thay đổi pha khi thay đổi nhiệt độ)

Để thay đổi khả năng tách có thể thay đổi dung môi hoặc thành phần dung môi

Dùng các chất hấp phụ tạo hỗn dịch bền trong nước (có thể thêm một lượng nhỏ chất trơ nhưthạch cao để kết dính nếu cần) rồi tráng lên tấm kính phẳng thành các bản có độ dày 0,5 – 2,0

mm (có thể dày đến 10 mm) tùy yêu cầu sử dụng

Để khô bản ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày, sau đó sấy sơ bộ 600C trong 2h rồi mới sấy hoạt hóa

Đánh dấu đường xuất phát cách mép dưới 1 – 2 cm

Dùng ống mao quản hay micropipette chấm dung dịch mẫu thử lên bản mỏng thành băng liêntục, băng có thể dày từ 1 – 2 mm, cách mép bản 1,5 – 2 cm

Khi chấm không được làm thủng lớp mỏng, vết chấm phải gọn (nên chấm dưới một nguồnnhiệt), chứa lượng chất thử khoảng 1 – 10 µg

Khai triển sắc ký:

Đặt bản mỏng đã chấm vào bình, đậy nắp bình Sau khi dung môi chạy đến cách đầu trên củabản khoảng 1 – 2 cm thì lấy ra, đánh dấu mức dung môi trên kính, để khô

Lưu ý:

Cấu tử nghiên cứu phải dễ phát hiện (tốt nhất là phát hiện được bằng đèn UV)

Những điều kiện để phân tách thành công trên bản mỏng chế hóa:

Bản mỏng phải đồng nhất

Lượng mẫu chấm trên bản mỏng phù hợp

Bình triển khai sắc ký được bão hòa tốt: quan trọng nhất vì một hợp chất di chuyển trên bảnmỏng với sự thay đổi vận tốc phụ thuộc vào tỷ lệ bay hơi của dung môi, nó di chuyển nhanh hơntrên bề mặt của bản mỏng và chậm hơn ở phần bản mỏng gần với giá mang, hiện tượng nàyđược giảm thiểu tối đa trong một bình sắc ký đã được bão hòa hoàn toàn

Lượng chất hấp phụ trên bản mỏng thay đổi tùy theo từng trường hợp, đối với silica gel cần 20 –

25 g/ bản mỏng kích thước 20 × 20 cm, dày 1mm, những bản mỏng dày có thể bị nứt trong quátrình sấy do đó phải giảm lượng nước trong hỗn dịch hay hỗn hợp bột nhão của chất hấp phụ,tăng lượng chất kết dính (thạch cao CaSO4), tăng thời gian sấy hoặc có thể sấy bằng tia hồngngoại

Vết chấm phải thẳng, hẹp và phải cách 2 mép hai bên của bản mỏng ít nhất 1 – 3 cm để tránhhiệu ứng viền thường làm dung môi chuyển động nhanh hơn hoặc chậm hơn bình thường ở haimép của bản mỏng hơn là ở trung tâm của bản mỏng

Mẫu thử được hòa tan trong một dung môi không phân cực, dễ bay hơi ở một nồng độ mà tất cảcác cấu tử của mẫu thử được hấp phụ không chỉ trên bề mặt mà phải xuyên suốt chiều dày củabản mỏng Có thể chấm bằng tay bằng cách sử dụng micropipette hay syringe và thước kẻ hoặc

có thể sử dụng những dụng cụ được thương mại hóa phục vụ cho việc chấm mẫu

6 Cách phát hiện trong sắc ký lớp mỏng điều chế:

6.1 Soi UV:

Ưu điểm:

Nhanh, tiện lợi

Không bị hao hụt mẫu như phun xịt bản

Nhược điểm:

Mắt nhìn thấy vị trí biểu kiến khác vị trí thực của vết → đánh dấu trật vết và không thu đượcchất khi cạo rồi ly giải

Phun xịt bản với thuốc thử đặc trưng:

Tiến hành:

Dùng tấm kiếng hoặc tấm nilon che 1 phần bản

6.2 Phun thuốc thử lên phần không bị che

Dựa vào những vết hiện trên bản, dùng spatule cạo phần silicagel để thu hợp chất

Đặt bản trong buồng hơi iod

Khi thấy vết lấy bản ra khỏi buồng

Tuỳ thuộc chế độ đưa mẫu vào hệ thống sắc ký cũng như các thao tác tiến hành sắc ký, người tachia cách tiến hành sắc ký thành ba loại:

1.1 Phương pháp tiền lưu

Đây là phương pháp sắc ký đơn giản nhất người ta cho hỗn hợp, ví dụ, hai chất A và B liên tụcchảy qua cột có nạp sẵn các các chất hấp phụ Người ta xác định nồng độ các cấu tử trong dungdịch chảy ra khỏi cột và xây dựng đồ thị theo hệ toạ độ: nồng độ cấu tử- thể tích dung dịch chảyqua cột đồ thị này thường gọi là sắc ký đồ hay đường cong thoát (có tác giả gọi là đường congxuất) Do các cấu tử bị hấp phụ lên cột, nên trước hết từ cột chỉ chảy ra dung môi Sau đó trongdung dịch thoát sẽ có cấu tử bị hấp phụ yến hơn trên cột, ví dụ cấu tử A, sau đó đến phần dungdịch chứa hỗn hợp A+B, đường cong thoát theo phương pháp tiền lưu cho trên hình dưới Trongphương pháp tiền lưu, ta chỉ thu được dung dịch thoát có cấu tử A tinh khiết ở lúc đầu, sau đó làhỗn hợp A+B Phương pháp tiền lưu không cho phép tách hoàn toàn các cấu tử ra khỏi nhau nênthực tế ít được dùng vào mục đích phân tích các chất

1.2 Phương pháp rửa giải

Trong phương pháp rửa giải, đầu tiên người ta cho Vml dung dịch chứa hỗn hợp các cấu tử (ví

dụ, hỗn hợp hai cấu tử A và B, trong đó A có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy qua cột Các cấu tử

A, B chứa trong Vml trước hết sẽ bị giữ lại ở phần trên của cột Sau đó cho dung dịch rửa(thường là dung môi hoà tan các cấu tử) chảy qua cột Lúc đó các cấu tử bị giữ ở phần trên củacột sẽ bị dung môi “rửa” và đưa dẫn xuống phía dưới Cấu tử A có ái lực với cột nhỏ hơn B nênchuyển động xuống phía dưới nhanh hơn B Nếu cột đủ dài và chế độ chảy của dung dịch rửathích hợp thì sau một thời gian cho chảy dung dịch rửa, các cấu tử tách ra thành từng vùng Cácvùng này sẽ tuần tự thoát ra khỏi cột, mỗi vùng lại được cách nhau bằng một phần dung môi.Hình bên dưới biểu diễn đường cong thoát của quá trình rửa giải Trong phương pháp rửa giải,người ta cũng hay dùng những dung dịch chứa một cấu tử có ái lực với cột nhưng phải nhỏ hơn

ái lực của các cấu tử cần tách với cột

1.3 Phương pháp rửa đẩy

Trong phương pháp rửa đẩy, sau khi đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một dung dịch rửachứa chất có ái lực với pha tĩnh lớn hơn các cấu tử cần tách Các cấu tử cần tách sẽ bị chuyểndần xuống phía dưới khi ta tiến hành quá trình rửa cột và tuần tự thoát ra khỏi cột Cấu tử thoát

ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất, sau đó dần dần đến các cấu tử có áilực với cột mạnh dần Khác với phương pháp rửa giải, nồng độ các cấu tử không giảm qua quátrình sắc ký Một nhược điểm quan trọng của phương pháp rửa đẩy là rất khó phân biệt các phầnriêng của các cấu tử trong dung dịch thoát vì ở đây giữa các phần dung dịch thoát chứa các cấu

tử không tách nhau bằng các thể tích dung dịch rửa

Silica (silic dioxyd) kết tụ thành silicagel

Silicagel bao lớp mỏng hữu cơ liên kết ( hóa học hoặc vật lý) với bề mặt

Nhôm oxyd, polymer, nhựa trao đổi ion

3.1 Silicagel(hay kieselgel của acid silicic) pha thuận

- Chất hấp phụ được sử dụng rộng rãi hiện nay Là một chất phân cực, thường được dùng làmpha tĩnh để phân tách các chất phù hợp với hầu hết các pha động nó có thể chạy với nhữnglượng mẫu rất nhỏ như trong sắc ký lớp mỏng

- Ngày nay, Silicagel có kích thước các lỗ là 40,60 và 100Å(Si-40, Si-60, Si-100) được dùngtron sắc ký điều chế Si-60 thường được sử dụng nhất Trong một vài trường hợp, kích thướchạt quá nhỏ làm giảm hiệu quả của sự chiết tách.

- Silicagel có diện tích bề mặt từ 0.4-0.6g/cm3, và nhiều nhất là 2.2g/cm3

Có nhiều kích cỡ silicagel khác nhau phụ thuộc vào nhà sản xuất Đối với sắc ký chế hóa sửdụng cho những lượng mẫu trong phòng thí nghiệm thường sử dụng loại có kích thước 15-25µm,25-40µmhay 40-63µm

- Tính hấp phụ của silicagel do các nhóm OH trên bề mặt quyết định Nhóm OH là các trungtâm hấp phụ

- Để Silicagel hấp phụ được tốt thì cần hoạt hóa trước khi sử dụng: Sắt kim loại được loại bỏbằng cách đun sôi với HCl đặc, dùng nước rửa sạch ion clorid và lắng gan loại các hạt nhỏ lơlửng, sau đó sấy 120oC trong 48 giờ.( đối với các bảng tráng sẵn thì không cần hoạt hóa) Không sấy quá lâu tránh làm mất nhóm silanol→bất hoạt

- Tùy chất cần phân tích mà hoạt hóa silicagel khác nhau Ví dụ : khi chạy tịnh dầu thì sấysilicagel cần lâu càng tốt còn đối với các chất phân cực mạnh thì sấy hoạt hóa ít đi, them một ítnước để giảm hoạt tăng Rf

- Tuỳ theo việc chọn các dung môi thích hợp cá thể dùng silicagel để tách các hợp chấtbase(alkaloid) hay các hợp chất ưa dầu Phân tách các chất có độ phân cực gần với nó Silicagel

là sự lựa chọn tốt nhất làm pha tĩnh khi phân tách cá chất có khối lượng phân tử nhỏ(<2000Da)

- Khả năng tách của silicagel tốt hơn khi tẩm nó bằng dung dịch bạc nitrat10-12%, dung dịchacid boric , ammoniac, dung dịch đệm phosphate

- Để tách tốt hơn người ta xử lý nhôm với các dung dịch acid hoặc base

Hoạt tính của nhôm oxyd tùy thuộc lượng nước nó chứa, hoạt tính sẽ giảm đi khi lượng nước giatăng Trước khi dùng cần hoạt hóa ở 120oC trong 1 giờ.Bậc hoạt tính của nhôm được chia làm 5bậc:

Bậc hoạt

tính

- Diện tích bề mặt của oxyd nhôm khoảng 0.9g/cm3 đến khoảng 4.0g/cm3

- Oxyd nhôm phân tách tốt các chất phân cực yếu đến trung bình, thường dùng để phân tách cáchợp chất thơm( có ái lực mạnh với OH phenol) và các hợp chất đồng phân của nó Oxyd nhômcòn được dùng để tách các chất : hydrocacbon, alkaloid, chất màu thực phẩm, lipid

3.3 Kieselguhr

- Ở dạng bột , chứa khoảng 70-95% SiO2 phần còn lại là các oxyd kim loại

- Là một chất phân cực yếu, dùng để tách các chất phân cực như đường, các triglyceric, các acidbéo bậc cao, cetoacid, lacton Nhưng thường được dùng chủ yếu làm giá mang cho pha tĩnhtrong sắc ký phân bố

3.4 Polyamide

- Ít được dùng làm chất hấp phụ , chủ yếu được dùng để tách các chất có chứa nhóm chứcphenol( flavon) , đường

3.5 Silicagel pha đảo

- Có nhiều loại mẫu kị nước như các peptid, thì sắc ký pha đảo thường là phương pháp được lựachọn sử dụng cột silicagel C-18

- Trong sắc ký pha đảo thì pha tĩnh có bản chất khác với pha động(pha tĩnh không phân cực ,phân động phân cực)

- Đây là silicagel có gắn một chuỗi carbon dài thường là 18C(c-18) hay 8C(C-8) :Si-O-Si- nốiCarbon

- Các hợp chất được rửa giải ra khỏi theo thứ tự: hợp chất chứa nhóm _COOH→ alcol/phenol

→amin→ eter/aldehyd→ cetone→hợp chất halogen→alkan

- Mặc dù sắc ký pha đảo có mắc tiền hơn sắc ký pha thuận nhưng nó có nhiều ưu điểm hơn như:Không cần phải hoạt hóa trước khi dùng

Hệ được thiết thiết lập cân bằng nhanh chóng

Dung dịch thân nước có thể đi qua

Tách tốt đối với các chất phân cực

- Thường được áp dụng trong HPLC

3.6 Pha tĩnh cho sắc ký rây phân tử

- Rây phân tử thường dùng các chất như :dextran, agarose hay polyacrylamide( Sephadex,Sepharose, Fraktogel, Bio-gel…)

- Có các loại gel như gel cứng và gel bán cứng Các gel cứng được cấu tạo từ các hợp chất vinyl

và divinyl styren polymer Còn các gel cúng thì được cấu tạo bởi các hạt thủy tinh xốp vàsilicagel xốp Tùy vào tính chất của từng loại gel ma chia ra hai loại là gel thân nước(hydrophilic gel) và gel thân dầu (lipophilic gel)

- Chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary phase, thường dùng silicagel, có 2 loại là silicagel pha thuận

và silicagel pha đảo, silicagel pha thuận thường dùng hơn, gồm Si có đính các nhóm OH,silicagel pha đảo gồm Si có đính các dây alkan R, ngoài ra còn dùng alumin) Chất nhồi cộtquyết định quá trình sắc kí

- Nếu dùng pha thuận, silicagel có gắn nhóm OH thì nó sẽ giữ chặt các chất phân cực, các chấtkhông phân cực sẽ liên kết với silicagel yếu hơn nên sẽ ra trước, các chất phân cực hơn sẽ ra sau.Ngoài ra tùy thuộc vào lượng mẫu có mà sẽ dùng lượng silicagel bao nhiêu, từ đó sẽ chọn kích

cỡ cột sắc kí Dùng lượng silicagel gấp 20, 30 hay 50 lần lượng mẫu Chú ý lượng silicagel phải

đổ đến khoảng gấp 10 lần đường kính cột thì quá trình tách sẽ diễn ra tốt Dung môi: thôngthường chọn dung môi phụ thuộc vào chất nhồi cột

- Nếu dùng silicagel pha thường (phân cực) thì chọn dung môi đi từ không phân cực đến phâncực (ví dụ từ chloroform đếm methanol), thông thường dùng hỗn hợp dung môi Chú ý dungmôi chạy sắc kí cột phải phân cực hơn một chút so với dung môi chạy bản mỏng vì hạt silicageldùng cho cột sắc kí sẽ to hơn hạt trên bản mỏng nên khả năng tách sẽ kém hơn một chút.(sắc kí cột là phương pháp để tách chất sau khi đã có tất cả thông tin trên bản mỏng, TLC, thinlayer chromatography, là biện pháp đầu tiên dùng để "dò tìm" thông tin về hỗn hợp của mìnhcũng như biện pháp tách chất cần lấy)

4.2 Thực hiện

Bước 1: nhồi cột

Sau khi đã chọn cột, làm khô và cân silicagel cần dùng, pha dung môi chạy hệ rồi thì hòa tansilicagel vào dung môi đó trong một erlen Lấy một miếng nhỏ bông gòn nhồi dưới đáy cột đểchặn silicagel lại, nếu cột quá dài thì dùng 1 dây kẽm thọt bông gòn xuống, chú ý dùng ít bônggòn Với những cột có sẵn miếng xốp hay lọc thủy tinh để chặn silicagel rồi thì không cần làmviệc này, tuy nhiên miếng xốp có nhược điểm là sau khi chạy cột xong ta phải rửa lại nhiều lầncho sạch, rất mất thời gian so với việc nhồi bông gòn, khi chạy cột xong chỉ cần vứt bông gòn Sau khi nhồi chặt bông gòn thì tiến hành khuấy silicagel trong dung môi (không phân cực) đãpha sẵn rồi rót nhẹ nhàng vào cột Trong lúc rót thì nên mở khóa để silicagel lắng đều, nhớ để 1erlen bên dưới để thu hồi dung môi, tiếp tục làm như vậy đến khi cho hết lượng silicagel vào,tiến hành rót thêm dung môi (từ erlen bên dưới) để ổn định hệ, chế đi chế lại nhiều lần đến khi

hệ ổn định, cột không bị nứt hay gãy thì xem như việc nhồi cột đã hoàn thành Khóa cột lại

Bước 2:

Nạp mẫu chất vào Có 2 loại nạp mẫu là nạp mẫu khô và nạp mẫu ướt Nạp mẫu ướt là hỗn hợpchất phân tích cũng tan trong dung môi chạy cột nên chỉ cần cho mẫu vào Còn nếu mẫu khôngtan trong dung môi chạy cột thì phải hòa tan mẫu vào dung môi gián tiếp trong 1 erlen Sau đódùng lượng ít silicagel cho vào erlen để hấp thu mẫu, sau đó cho hết vào bình cô quay để côquay đuổi dung môi đi thu được silicagel khô có chứa mẫu Lúc này nạp hết silicagel đó vào cột

và cho dung môi chạy cột vào: gọi là nạp mẫu khô Khi cô quay thì nhớ lót miếng bông gòn ởmiệng bình cô quay để tránh silicagel bay lên Cô quay là chưng cất trong áp suất kém (chânkhông)

Bước 3:

Sau khi hoàn tất việc nạp mẫu rồi thì lót 1 miếng bông gòn ở bên trên mẫu chất để ổn định hệ rồitiếp tục châm dung môi vào, từ từ thay đổi độ phân cực của hệ, chú ý không được thay đổi độtngột cũng như chuyển từ không phân cực sang phân cực rồi lại quay lại không phân cực, làmnhư vậy sẽ gãy cột và phải nhồi lại từ đầu

Bước 4:

Mở khóa, lúc này cột bắt đầu tách chất, hứng lượng dung môi chảy ra có kém theo chất đã táchđược bằng ống nghiệm nhỏ, mỗi lần hứng khoảng 1/3ống nghiệm Sau đó đem chấm bản cácống nghiệm, những ống có vệt tương tự nhau sẽ được gom lại, đó là 1 chất Tiếp tục như vậy thìcuối cùng ta sẽ tách được các chất mong muốn

Ghi chú

- Mỗi lần tách cần khoảng 50-200ống nghiệm, thời gian tách từ 2 đến 7 ngày.Dùng khóa để điều chỉnh tốc độ dòng chảy dung môi, ra chậm hay nhanh, việc này quyết định

quá trình tách có tốt hay không Nếu thận trọng quá cho chạy chậm thì phải chờ lâu, nếu nônnóng quá cho chảy nhanh thì silicagel chưa kịp tách đã phải cho ra chất, như vậy cũng khôngtách được.

Có những hệ phải tách rất lâu, cho dù đã mở khóa hết cỡ vẫn không chảy xuống nhanh thì dùngmáy đẩy (máy sục oxi dùng để nuôi cá) Nó sẽ sục không khí vào để tăng tốc quá trình đẩy dungmôi xuống (chỉ dùng khi tốc độ dòng dưới khoảng 3 giọt/phút) Chú ý chất không dễ bị oxi hóathì mới dùng phương pháp này được Nếu không oxi không khí sẽ oxi hóa hết chất phân tích

- Nếu dùng silicagel pha đảo thì cột không cần khóa vì pha đảo chạy rất chậm, nhưng nhượcđiểm là phải ngồi canh nó liên tục Chú ý khi đã chạy pha đảo thì không được dùng máy đẩy, vìbản chất pha đảo là chậm Nếu dùng máy đẩy thì như đã nói ở trên, silicagel không táchđược.Khi chạy cột thì điều tối kị là khóa cột lại quá lâu Dĩ nhiên chạy cột 2-3 ngày thì phảikhóa cột lại ở cuối ngày, nhưng hôm sau phải lên làm ngay, nếu để quá lâu thì chất bị giữ lạitrong cột lâu sẽ khó tách ra hơn

Pha động là một thông số dễ điều chỉnh nhất khi tối ưu hóa hệ thống sắc ký Trong khảo sát phađộng, vấn đề đặt ra là làm sao để tìm dung môi hoặc hỗn hợp dung môi phù hợp nhất trong thờigian ngắn nhất có thể và sử dụng ít nhất vật liệu

5.1 Lựa chọn dung môi:

Dung môi lựa chọn không được ảnh hưởng tới kết quả của phương pháp phát hiện

Thường dùng hỗn hợp dung môi nên cần phải chú ý đến khả năng trộn thành hỗn hợp của cácdung môi:

Điểm sôi của các dung môi cũng là một yếu tốt rất quan trọng Nhiệt độ sôi thấp sẽ dễ dàng vàtiết kiệm cho việc thu hồi Tuy nhiên dung môi sử dụng không nên có điểm sôi quá thấp (Ts >

400C) nhằm tránh sự bay hơi trong quá trình phân lập

Dung môi với độ nhớt thấp cũng được ưu tiên vì giúp giảm áp lực phải đặt lên cột

Tính bền vững và tính trơ phải được quan tâm để tránh hư mẫu

Độc tính thấp, khả năng cháy nổ và giá cả cũng cần quan tâm

Độ mạnh của dung môi

Snyder dựa trên giá trị thực nghiệm đưa ra bảng giá trị độ mạnh của dung môi:

Độ phân cực của dung môi

Độ phân cực của dung môi có thể lựa chọn dựa trên tam giác chọn lọc được xây dựng bởiSnyder:

Độ tinh khiết của pha động:

Không có hoạt chất nào 100% tinh khiết Độ tinh khiết càng cao, giá càng cao Cần phù hợp yếu

tố chi phí với độ tinh khiết nhằm đưa các ảnh hưởng của nó về giới hạn phù hợp

5.2 Dung môi cho sắc ký pha thuận:

5.3 Dung môi cho sắc ký pha đảo:

5.4 Dung môi cho sắc ký gel:

(Theo cơ chế rây phân tử, trao đổi ion, ái lực)

Ngược lại với các loại sắc ký khác, sắc ký gel không cho phép người dùng tác động lên tính tan

do sự thay đổi pha động Pha động chỉ được chọn theo 3 tiêu chí:

Khả năng hòa tan tốt mẫu

Độ nhớt thấp (= áp lực tác động lê gel thấp)

Không làm phá hủy pha tĩnh

Tài liệu cung cấp từ nhà sản xuất gel cần phải được nghiên cứu kĩ lưỡng nhằm tránh cho gel bịphá hủy do tương tác với dung môi không phù hợp

6 Cách phát hiện trong sắc ký cột điều chế:

Phương phát ghi nhận sắc ký bằng detector UV thường được sử dụng nhất Trong khi việc phunthuốc thử giống để phát hiện là không khả thi thì sử dụng máy đo UV lại tỏ rõ hiệu quả, sự chọnlọc và tính khả dụng

6.1 UV detector

Áp dụng được cho các hợp chất có nhân thơm, có nối đôi liên hợp, nhóm carbonyl, có chứa iod,brom, sulfur,…

Nhìn chung UV detector có thể sử dụng được cho sắc ký gel mà không cần rửa giải

6.2 Refractive detector (RI)

Bộ phận phát hiện nhờ chỉ số khúc xạ Bộ phận phát hiện này tuy có độ nhạy thấp hơn so với bộphát hiện UV nhưng nó có ứng dụng nhất định trong sắc ký điều chế Với độ nhạy thấp, khi lựachọn dung môi sẽ dựa vào RI để lựa chọn được loại dung môi nào chạy ra kết quả có nồng độcao nhất

7 Định tính một cột sắc ký

Vì nhiều lý do, cần thiết phải có sự đánh giá những đặc thù nhất định của cột tự làm

Thông tin nào quan trọng nhất cho việc đánh giá một cột sắc ký chế hóa?

Thông tin về hiệu lực cột, thông tin này cho phép đưa ra kết luận về kết quả phân lập của sắc ký

7.1 Sắc ký đồ

Nếu đầu ra của cột được ghi nhận bởi một bộ phận phát hiện thích hợp trong quá trình phân lậpsắc ký, và tín hiệu từ bộ phận phát hiện được ghi nhận dạng nồng độ theo thời gian, sẽ ghi nhậnđược đường cong điển hình Đường cong Gausian

Toàn bộ các ghi nhận của các tín hiệu được gọi là sắc ký đồ Dữ liệu sau đâu có thể thu trực tiếp

từ một sắc ký đồ:

to = thời gian chết của cột, thời gian cần thiết cho dung môi chảy qua hết cột với tốc độ dòng xácđịnh

tR = Thời gian lưu, thời gian từ khi triển khai mẫu đến pic cực đại

W = Độ rộng cơ bản của pic

B0,5 = độ rộng pic tại ½ chiều cao

Sẽ không thực sự hợp lý nếu đánh giá một cột dựa vào thời gian lưu hoặc độ rộng của pic

Những thông số này phụ thuộc vào quá nhiều yếu tố như tốc độ dòng, thành phần dung môi,chiều dài cột… Tuy nhiên, việc đánh giá cột một cách thích hợp đối với sắc ký điều chế là dựavào SI (symmetry index - chỉ số đối xứng) và số đĩa lý thuyết hay chiều cao đĩa lý thuyết

SI mô tả sơ lược hình dáng của pic và do đó là một thông số có ích cho việc đánh giá đặc tínhchảy của cột SI được định nghĩa:

SI = b/a

Sự bất đối xứng trở nên rõ ràng, tuy nhiên, một điều kiện tiên quyết cho loại thử nghiệm nàyphải sử dụng đối với chất có khả năng tách rửa tốt nhất

Ví dụ của một pic tốt (trái) và một pic xấu (phải)

SI được đo không phải tại đường nền mà ở vị trí 5% hoặc 10% của chiều cao pic (trong ví dụnày là 5%)

7.2 Số đĩa lý thuyết

Một thông số dùng để so sánh khác là số đĩa lý thuyết N của cột

Công thức tính N có được dựa trên giả định rằng pic có hình dạng đường cong Gaussian Đểđơn giản tính toán, các pic được thừa nhận có hình dạng Gaussian

Số N lớn tương ứng với cột tốt

Khoảng cách lý thuyết cho một quá trình giải hấp phụ - hấp phụ là một đĩa lý thuyết do đó nó làthông số đại diện tốt nhất cho các thông số khác (kích thước pha hấp phụ, tốc độ dòng, chiều dàicột,…)

7.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến số đĩa lý thuyết:

Các yếu tố do pha động:

Độ nhớt

Hóa chất tự nhiên

Tốc độ đưa vào cột

Tốc độ khuếch tán vào pha tĩnh

Các yếu tố hòa tan

Bề mặtKích thước và hình dạng lỗ

Các yếu tố thuộc tính toán

Các yếu tố thuộc về máy móc thiết bị

Tính đồng nhất của cấu trúc lớp nhồi cộtKhoảng trống và các kênh giữa các lớp nhồi cộtThể tích chết quá mức trong hệ thống LC

7.4 Chiều cao tương ứng với một đĩa lý thuyết

Để có thể so sánh các cột có chiều dài khác nhau, cần thiết phải tính chiều cao của đĩa lý thuyết

H (H=L/N với L là chiều dài của cột)

7.5 Chiều cao đĩa lý thuyết đã làm giảm

Nhằm so sánh các cột có kích cỡ khác nhau, thông số thích hợp nhất là chiều cao đã làm giảm h

V0 = tR Fm (Fm là tốc độ phân phối hay lưu lượng dòng)

G Helmchen và B.Glatz đã đề nghị một phương pháp khác để tính V0

Cột được làm đầy với một dung môi thứ nhất (tỉ trọng d1), đóng kín và cân (G1) Cột sau khitriển khai được phục hồi lại bằng một dung môi thứ hai (d2), cũng đóng kín và cân (G2) V0

được tính theo công thức

V0 = (G2 – G1)/(d2 – d1)

Biết được V0 có thể tính toán được thời gian chết to

to = V0 / Fm

8 Phân lập kết quả sắc ký:

Khi yếu tố phân giải giảm và các pic trở nên gần nhau hơn, việc phân lập trở nên khó khăn

Mặc dù không lý tưởng nhưng sựphân lập của các chất tinh khiết vẫn

có thể thực hiện được với độ phângiải R = 0.6 nhưng việc này đòi hỏimột điểm cắt trong các phân đoạnthu được Chỉ các phân đoạn rìa tùytheo mỗi pic được thu thập và phầncòn lại nằm giữa chúng có thể đượcthu hồi và tái phân lập

Trường hợp tiến hành sắc ký quá tải

có thể xảy ra hiện tượng kéo đuôi,cần có sự điều chỉnh vị trí thu thập

để tránh lẫn phần kéo đuôi của pictrước

8.1 Yếu tố phân giải alpha

α = (tR2 – t0) / (tR1 – t0) (tR2 >= tR1)

Nếu hai thời gian lưu bằng nhau, α

= 1 khi đó không thể phân lập được.Giá trị α càng lớn, việc phân lập càng dễ dàng

9 Sắc ký cột nhanh (FC – Flash Chromatography)

Giới thiệu

Vào giai đoạn đầu của kỹ thuật sắc ký, nhữngcột đơn giản bằng thủy tinh được sử dụng,hoạt động nhờ vào áp lực thủy tĩnh của dungmôi Trong một ấn phẩm năm 1978 ClarkW.Still khám phá ra khả năng tăng tốc quátrình phân lập trên cột thủy tinh, từ đó gia tănghiệu lực của phương pháp sắc ký Kết quả hếtsức thuyết phục và trở nên một phương pháptinh chế không ngờ trong hóa học chế hóa

Ngày nay sắc ký cột nhanh càng được phát triển với nhiều thiết bị hỗ trợ và sự tiện dụng.

Sắc ký cột nhanh trở nên phổ biến vì chúng đơn giản dễ sử dụng, tiện lợi và có thể trang bị ởmọi phòng thí nghiệm

9.3 Khảo sát hệ thống sắc ký trước bằng sắc ký lớp mỏng:

Như đã đề cập, đa phần sắc ký cột nhanh sử dụng pha tĩnh là silicagel bình thường hoặc phân cực cao do đó việc tiến hành khảo sáttrước bằng TLC là hợp lý với một sự đầu tư nhỏ nhất về thời gian vàvật liệu, hứa hẹn tìm ra điều kiện sắc ký có khả năng áp dụng cho cộtsắc ký nhanh

Xác định pha tĩnhTìm pha động với sự chọn lọc nhấtXác định độ mạnh dung môiMột cách lý tưởng, chất hấp phụ trên 2 loại sắc ký nên giống nhau đểkhả năng áp dụng từ TLC cho FC là cao nhất

Khảo sát pha tĩnh

Thực nghiệm với TLC có thể giúp đưa ra chọn lựa đúng đắn NếuTLC với silica gel thường được sử dụng cho kết quả tốt thì cũng cóthể sử dụng cho FC Nếu kết quả không đạt, khi đó mới nghĩ đến khảnăng sử dụng pha đảo

Khảo sát dung môi

Một khi đã chọn được pha tĩnh với những đặc tính thích hợp, dungmôi hoặc hỗn hợp dung môi phân lập các chất thành phần sẽ đượckhảo sát

Một cách tổng quát, mỗi dung môi đều có những đặc tính riêng, một

số có xu hướng giống nhau trong khi một số thì khác nhau rất nhiều.L.R.Snyder và J.J.Kirkland đã nghiên cứu và so sánh các kết quả đặctính của nhiều loại dung môi và các nhóm dung môi có chung tácdụng thành các nhóm chọn lọc

Nhóm chọn lọc chophép công việc tìmkiếm được tập trung,

sẽ có ít điểm so sánhkhi mà dung môichung nhóm Côngviệc sẽ được tiến hànhtheo hướng so sánhgiữa các nhóm đặctính

Những dung môi quantrọng cho sắc ký đượctrình bày theo bảngsau chỉ bao gồm cácdung môi có thể dùngtrong phân lập sửdụng bộ phận pháthiện UV (không gâytín hiệu)

Dựa trên độ phân cực của các thành phần cần được phân lập, trong trường hợp độ dung môi có

độ mạnh quá lớn khiến không thể phân tách được, độ mạnh của dung môi có thể được giảmxuống bằng cách hòa tan thêm hexane (độ mạnh 0.1), ngay lập tức có thể phân lập tốt

Giảm độ mạnh của dung môi (trái: dichloromethane, phải: Hexane:dichloromethane 3:1)

Việc thêm hexane giúp giảm độ mạnh của dung môi nhưng không tác động lên tính chọn lọc(khả năng phân giải)

Tùy theo thành phần được lựa chọn để chọn dung môi có sự chọn lọc thích hợp Bản VI có sựphân tách tốt nhưng nếu chỉ quan tâm tới việc phân lập thành phần đầu tiên, dung môi chạy ởbản V sẽ được chọn