tài liệu sắc ký điều chế

I SẮC KÝ LỚP MỎNG ĐIỀU CHẾ Nguyên tắc – yêu cầu: Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative thin layer chromatography – PTLC) phương pháp sắc ký sử dụng để tách lượng nhỏ đơn chất (10 – 1000 mg) từ hỗn hợp đơn giản (chỉ gồm vài cấu tử) Trong PTLC, dung dịch mẫu thử chấm lớp chất hấp phụ (thường silica gel, nhôm oxyd) có độ dày từ 0,5 – 2,0 mm tráng phẳng (kính, kim loại, chất dẻo) đóng vai trò pha tĩnh Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo mỏng làm di chuyển cấu tử mẫu thử theo vận tốc khác tạo thành sắc ký đồ gồm nhiều vết có Rf khác Sau khai triển, ta thu cấu tử đặc trưng cách cạo vùng chất hấp phụ chứa vết khỏi phản hấp phụ chất khỏi giá hấp phụ dung môi thích hợp Hợp chất thu từ mỏng tinh khiết hóa tiếp tục sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography – TLC) hay phương pháp sắc ký khác hợp chất đạt độ tinh khiết để tiến hành định tính, xác định cấu trúc phương pháp phân tích hay phép đo quang phổ, nghiên cứu hoạt tính sinh học, nghiên cứu tổng hợp hóa học, sử dụng chất chuẩn đối chiếu Ưu nhược điểm PTLC: Ưu điểm: Phương pháp tiến hành PTLC nhìn chung tương tự TLC khác việc sử dụng mỏng dày so với TLC: PTLC 0,5 – mm, dày đến 10 mm tùy yêu cầu sử dụng; TLC 0,2 – 0,25 mm So với sắc ký cột: Nhanh thuận tiện so với sắc ký cột cổ điển Dễ tìm dung môi thích hợp để tách chất Vùng chứa chất tụ thành lớp mỏng dễ phát hiện, dễ cô lập Tỉ lệ silicagel chất tách cao nên tách tốt Rẻ, đơn giản so với HPLC Thiết bị, thao tác đơn giản dễ nắm bắt áp dụng Sử dụng lượng nhỏ dung môi → triển khai nhiều lần để thu kết phân tách tốt hơn, dễ dàng tách vùng chứa chất hấp phụ khỏi mỏng, triển khai đồng thời chất chuẩn đối chiếu điều kiện xác định giúp tạo thuận lợi cho việc xác định hợp chất mong muốn Nhược điểm: Các hợp chất bền chấm bề mặt mỏng bị phân hủy tiếp xúc với không khí ánh sáng Sự diện đồng thời tạp chất phản hấp phụ chất mong muốn khỏi giá hấp phụ Ứng dụng: Dùng để tách chất với hàm lượng nhỏ (10 – 1000 mg) trường hợp tách phương pháp khác Có thể phân lập đơn chất tinh khiết với khối lượng đủ từ polymer tổng hợp, sản phẩm tự nhiên từ nuôi cấy mô hay từ dược liệu, sản phẩm chuyển hóa từ dịch sinh học, phân biệt cấu hình hoá học sản phẩm thiên nhiên hay tổng hợp.để khảo sát điểm chảy, phổ UV, IR, khảo sát cấu trúc làm chất chuẩn Pha tĩnh: Pha tĩnh hay sử dụng PTLC chất hấp phụ, chất hấp phụ phần lớn có trộn thêm chất kết dính CaSO4 – 15 %, tinh bột – %, dextran, có trường hợp không dùng chất kết dính Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 Trang 3.1 Silica gel: Là chất phân cực, hoạt động chủ yếu theo chế hấp phụ, trung tâm hấp phụ nhóm – OH silanol → hấp phụ chất có tính kiềm (alkaloid base ) chất có tính acid (polyphenol ) Mật độ nhóm silanol cao (VD: hạt mịn), khả hấp phụ silica gel lớn Khả hấp phụ silica gel phụ thuộc vào phụ thuộc vào tình trạng ngậm nước hệ thống → dùng silica gel làm chất hấp phụ nên sấy silica gel 1050C 2h đủ, đừng nung 4500C 3.2 Nhôm oxyd: Có dạng: oxyd nhôm kiềm, trung tính, acid Là chất hấp phụ phân cực mạnh, có tính trao đổi ion lưỡng tính Trung tâm hấp phụ nhóm OH, trung tâm hoạt động bị hút ẩm, oxyd nhôm giảm hoạt tính Muốn hoạt hóa nó, người ta sấy để loại bỏ lượng nước hấp phụ Nhiệt độ sấy cao, lượng nước hấp phụ giảm đi, oxyd nhôm hoạt động Oxyd nhôm có nhiều cỡ hạt, hạt bé khả hấp phụ cao 3.3 Cellulose: Cellulose chủ yếu có chế phân bố, thường dùng để tách chất phân cực mà khó tách tách chế hấp phụ Là chất cao phân tử thiên nhiên dùng dạng bột mịn thường không cần chất kết dính 3.4 Silica gel ghép: Là silica gel mà nhiều nhóm Si-OH silanol biến đổi thành nhóm Si-R, Si-O-R hay Si-O-SiR Khi –R mạch hydrocarbon phân cực (2C, 6C, 8C, 18C) ta có silica gel ghép pha đảo, chất phân bố không phân cực Khi –R mạch phân cực ta có silica gel ghép pha thuận, chất hấp phụ yếu so với silica gel không ghép 3.5 Các pha tĩnh khác: Polyamid, nhựa trao đổi ion loại ionit vô – hữu cơ, Kieselguhr Dung môi: Chọn dung môi: Có độ tinh khiết cao, tránh chứa vết kim loại Dung môi không dễ bay Thay đổi dung môi: Khả tách riêng hợp chất PTLC tùy thuộc tỉ lệ phân phối hợp chất chất hấp phụ dung môi ly giải Thường ly giải với hỗn hợp dung môi tránh sử dụng hỗn hợp dung môi có nhiều cấu tử (vì hỗn hợp phức tạp dễ dẫn đến việc thay đổi pha thay đổi nhiệt độ) Để thay đổi khả tách thay đổi dung môi thành phần dung môi Chuẩn bị mẫu sắc ký: Chuẩn bị lớp mỏng chế hóa: Các mỏng chế hóa tự làm phòng thí nghiệm (bản mỏng tự tráng) sử dụng mỏng tráng sẵn Độ dày mỏng PTLC thường sử dụng 0,5 – 2,0 mm, kích thước mỏng thường × 20, 10 × 20, 20 × 20, 20 × 40 hay đến 20 × 100 cm tùy yêu cầu sử dụng Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 Trang Dùng chất hấp phụ tạo hỗn dịch bền nước (có thể thêm lượng nhỏ chất trơ thạch cao để kết dính cần) tráng lên kính phẳng thành có độ dày 0,5 – 2,0 mm (có thể dày đến 10 mm) tùy yêu cầu sử dụng Để khô nhiệt độ phòng ngày, sau sấy sơ 600C 2h sấy hoạt hóa 1200C 2h Chuẩn bị mẫu thử (dịch chấm): Mẫu thử (đã sơ loại tạp) cô áp suất giảm đến khô, sau hòa vào lượng vừa đủ dung môi (phải hòa tan tốt mẫu thử dễ bay hơi) chấm lên mỏng Chấm mẫu thử: Đánh dấu đường xuất phát cách mép – cm Dùng ống mao quản hay micropipette chấm dung dịch mẫu thử lên mỏng thành băng liên tục, băng dày từ – mm, cách mép 1,5 – cm Khi chấm không làm thủng lớp mỏng, vết chấm phải gọn (nên chấm nguồn nhiệt), chứa lượng chất thử khoảng – 10 µg Khai triển sắc ký: Đặt mỏng chấm vào bình, đậy nắp bình Sau dung môi chạy đến cách đầu khoảng – cm lấy ra, đánh dấu mức dung môi kính, để khô Lưu ý: Cấu tử nghiên cứu phải dễ phát (tốt phát đèn UV) Những điều kiện để phân tách thành công mỏng chế hóa: Bản mỏng phải đồng Lượng mẫu chấm mỏng phù hợp Bình triển khai sắc ký bão hòa tốt: quan trọng hợp chất di chuyển mỏng với thay đổi vận tốc phụ thuộc vào tỷ lệ bay dung môi, di chuyển nhanh bề mặt mỏng chậm phần mỏng gần với giá mang, tượng giảm thiểu tối đa bình sắc ký bão hòa hoàn toàn Lượng chất hấp phụ mỏng thay đổi tùy theo trường hợp, silica gel cần 20 – 25 g/ mỏng kích thước 20 × 20 cm, dày 1mm, mỏng dày bị nứt trình sấy phải giảm lượng nước hỗn dịch hay hỗn hợp bột nhão chất hấp phụ, tăng lượng chất kết dính (thạch cao CaSO4), tăng thời gian sấy sấy tia hồng ngoại Vết chấm phải thẳng, hẹp phải cách mép hai bên mỏng – cm để tránh hiệu ứng viền thường làm dung môi chuyển động nhanh chậm bình thường hai mép mỏng trung tâm mỏng Mẫu thử hòa tan dung môi không phân cực, dễ bay nồng độ mà tất cấu tử mẫu thử hấp phụ không bề mặt mà phải xuyên suốt chiều dày mỏng Có thể chấm tay cách sử dụng micropipette hay syringe thước kẻ sử dụng dụng cụ thương mại hóa phục vụ cho việc chấm mẫu Cách phát sắc ký lớp mỏng điều chế: 6.1 Soi UV: Ưu điểm: Nhanh, tiện lợi Không bị hao hụt mẫu phun xịt Nhược điểm: Mắt nhìn thấy vị trí biểu kiến khác vị trí thực vết → đánh dấu trật vết không thu chất cạo ly giải Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 Trang Phun xịt với thuốc thử đặc trưng: Tiến hành: Dùng kiếng nilon che phần 6.2 Phun thuốc thử lên phần không bị che Dựa vào vết bản, dùng spatule cạo phần silicagel để thu hợp chất Ưu điểm: Biết xác vị trí vết Nhược điểm: Thuốc thử tạo phức với hợp chất sử dụng để cạo bản, cô lập hợp chất 6.3 Sử dụng iod: Tiến hành: Đặt buồng iod Khi thấy vết lấy khỏi buồng Đánh dấu vị trí vết Phơi quạt gió để bay iod Cạo để thu chất II SẮC KÝ CỘT ĐIỀU CHẾ Phương pháp sắc ký dựa vào phân bố khác chất hai pha động tĩnh Có nhiều nguyên nhân đưa đến phân bố khác chất, lặp lặp lại tượng hấp phụ - phản hấp phụ chất dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh nguyên nhân chủ yếu việc tách sắc ký CÁC CÁCH TIẾN HÀNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ Tuỳ thuộc chế độ đưa mẫu vào hệ thống sắc ký thao tác tiến hành sắc ký, người ta chia cách tiến hành sắc ký thành ba loại: 1.1 Phương pháp tiền lưu Đây phương pháp sắc ký đơn giản người ta cho hỗn hợp, ví dụ, hai chất A B liên tục chảy qua cột có nạp sẵn các chất hấp phụ Người ta xác định nồng độ cấu tử dung dịch chảy khỏi cột xây dựng đồ thị theo hệ toạ độ: nồng độ cấu tử- thể tích dung dịch chảy qua cột đồ thị thường gọi sắc ký đồ hay đường cong thoát (có tác giả gọi đường cong xuất) Do cấu tử bị hấp phụ lên cột, nên trước hết từ cột chảy dung môi Sau dung dịch thoát có cấu tử bị hấp phụ yến cột, ví dụ cấu tử A, sau đến phần dung dịch chứa hỗn hợp A+B, đường cong thoát theo phương pháp tiền lưu cho hình Trong phương pháp tiền lưu, ta thu dung dịch thoát có cấu tử A tinh khiết lúc đầu, sau hỗn hợp A+B Phương pháp tiền lưu không cho phép tách hoàn toàn cấu tử khỏi nên thực tế dùng vào mục đích phân tích chất Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 Trang 1.2 Phương pháp rửa giải Trong phương pháp rửa giải, người ta cho Vml dung dịch chứa hỗn hợp cấu tử (ví dụ, hỗn hợp hai cấu tử A B, A có lực với cột nhỏ B) chạy qua cột Các cấu tử A, B chứa Vml trước hết bị giữ lại phần cột Sau cho dung dịch rửa (thường dung môi hoà tan cấu tử) chảy qua cột Lúc cấu tử bị giữ phần cột bị dung môi “rửa” đưa dẫn xuống phía Cấu tử A có lực với cột nhỏ B nên chuyển động xuống phía nhanh B Nếu cột đủ dài chế độ chảy dung dịch rửa thích hợp sau thời gian cho chảy dung dịch rửa, cấu tử tách thành vùng Các vùng thoát khỏi cột, vùng lại cách phần dung môi Hình bên biểu diễn đường cong thoát trình rửa giải Trong phương pháp rửa giải, người ta hay dùng dung dịch chứa cấu tử có lực với cột phải nhỏ lực cấu tử cần tách với cột 1.3 Phương pháp rửa đẩy Trong phương pháp rửa đẩy, sau đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột dung dịch rửa chứa chất có lực với pha tĩnh lớn cấu tử cần tách Các cấu tử cần tách bị chuyển dần xuống phía ta tiến hành trình rửa cột thoát khỏi cột Cấu tử thoát khỏi cột cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất, sau đến cấu tử có lực với cột mạnh dần Khác với phương pháp rửa giải, nồng độ cấu tử không giảm qua trình sắc ký Một nhược điểm quan trọng phương pháp rửa đẩy khó phân biệt phần riêng cấu tử dung dịch thoát phần dung dịch thoát chứa cấu tử không tách thể tích dung dịch rửa Cột sắc ký Cột sắc ký làm thép không rỉ , thủy tinh đặc biệt chất dẻo 2.1 Cột phân tích Dài: 10-30cm Đường kính trong: 4-10mm Cỡ hạt pha tĩnh: 5-10µm N=40.000-60.000 đĩa /met Cột nhỏ (microcolumn): 3-7.5cm, 1-2mm, 3-5µm, N=100.000 đĩa/mét 2.2 Chất nhồi cột: Silica (silic dioxyd) kết tụ thành silicagel Silicagel bao lớp mỏng hữu liên kết ( hóa học vật lý) với bề mặt Nhôm oxyd, polymer, nhựa trao đổi ion 2.3 Cột chế hóa Dài 25-100cm Đường kính 6-50mm, tránh hiệu ứng thành cột Tốc độ dòng lớn cột phân tích Sử dụng dược liệu để sơ tách nhóm hợp chất Pha tĩnh 3.1 Silicagel(hay kieselgel acid silicic) pha thuận - Chất hấp phụ sử dụng rộng rãi Là chất phân cực, thường dùng làm pha tĩnh để phân tách chất phù hợp với hầu hết pha động chạy với lượng mẫu nhỏ sắc ký lớp mỏng Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 Trang - Ngày nay, Silicagel có kích thước lỗ 40,60 100Å(Si-40, Si-60, Si-100) dùng tron sắc ký điều chế Si-60 thường sử dụng Trong vài trường hợp, kích thước hạt nhỏ làm giảm hiệu chiết tách - Silicagel có diện tích bề mặt từ 0.4-0.6g/cm3, nhiều 2.2g/cm3 Có nhiều kích cỡ silicagel khác phụ thuộc vào nhà sản xuất Đối với sắc ký chế hóa sử dụng cho lượng mẫu phòng thí nghiệm thường sử dụng loại có kích thước 1525µm,25-40µmhay 40-63µm - Tính hấp phụ silicagel nhóm OH bề mặt định Nhóm OH trung tâm hấp phụ - Để Silicagel hấp phụ tốt cần hoạt hóa trước sử dụng: Sắt kim loại loại bỏ cách đun sôi với HCl đặc, dùng nước rửa ion clorid lắng gan loại hạt nhỏ lơ lửng, sau sấy 120oC 48 giờ.( bảng tráng sẵn không cần hoạt hóa) Không sấy lâu tránh làm nhóm silanol→bất hoạt - Tùy chất cần phân tích mà hoạt hóa silicagel khác Ví dụ : chạy tịnh dầu sấy silicagel cần lâu tốt chất phân cực mạnh sấy hoạt hóa đi, them nước để giảm hoạt tăng Rf - Tuỳ theo việc chọn dung môi thích hợp cá thể dùng silicagel để tách hợp chất base(alkaloid) hay hợp chất ưa dầu Phân tách chất có độ phân cực gần với Silicagel lựa chọn tốt làm pha tĩnh phân tách cá chất có khối lượng phân tử nhỏ( 400C) nhằm tránh bay trình phân lập Dung môi với độ nhớt thấp ưu tiên giúp giảm áp lực phải đặt lên cột Tính bền vững tính trơ phải quan tâm để tránh hư mẫu Độc tính thấp, khả cháy nổ giá cần quan tâm Độ mạnh dung môi Snyder dựa giá trị thực nghiệm đưa bảng giá trị độ mạnh dung môi: Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 Trang Độ phân cực dung môi Độ phân cực dung môi lựa chọn dựa tam giác chọn lọc xây dựng Snyder: Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 10 Trang vào cột sắc ký khí, sắc ký đồ dễ dàng nhận diện Hơn nữa, thông tin độ phân cực liên quan giai đoạn rửa giải silicagel hữu ích việc nhận dạng pic Sesquiterpene Việc phân lập sesquiterpene từ dược liệu thường thực bước sắc ký cột phương pháp chiết xuất không phân cực áp suất thấp hay trung bình, hay phân lập sắc ký lớp mỏng chế hóa kết tinh lại với số lượng lớn.Thường sử dụng cột RP-8 hay RP-18 với dung môi rửa giải hỗn hợp methanol-nước Những giai đoạn chắn dẫn đến hấp thu không thuận nghịch hợp chất mong muốn Diterpene Nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư paclitaxel từ loài T yunnanensis Trung Quốc Phân tích với sắc ký cột khô ( silicagel 80-200 mesh; CH 2Cl2- MeOH 40:1) sau cột mở thông thường cho taxin B 2-deacetyltaxin B Hỗn hợp silicagel ( 63-200 µg) AgNO3 ( 5:1) để phân lập labdane diterpene methyl ester Cucurbitacins Sắc ký cột khô silicagel sử dụng suốt trình phân lập chất độc 11deoxycucurbitacin từ Desfontainia spinosa, triển khai với ethyl acetate- nước 9:1 hexanedichloromethane 7:3 Giai đoạn tinh chế cuối thực với sắc ký lớp mỏng chế hóa ly tâm Lignans Cả lignans neolignans thu cách kết hợp sắc ký cột khô sắc ký lớp mỏng chế hóa Depside Ví dụ acid salvianolic B, sử dụng thuốc cổ truyền Trung Quốc Được phân lập với sắc ký cột khô 2.3 kg silicagel ( CHCl 3-MeOH-HCOOH 85:15:1) Cột cắt thành 16 phần rửa giải ethanol ấm Phần 13-14 tinh khiết hóa sephadex LH-20 ( MeOH) để thu 20.6 g acid salvianolic B ( Ai Li 1988) 11 SẮC KÝ LỎNG CHÂN KHÔNG Sắc ký lỏng chân không ( VLC) có nguồn gốc từ Úc Vào năm 1977, mô tả ngắn phương pháp phân lập cembrenoid terpene từ san hô mềm Úc xuất 11.1 Nguyên tắc: Kỹ thuật xem sắc ký lỏng chế hóa, hoạt động cột, dùng chân không để tăng tốc độ chảy chất rửa giải Kỹ thuật khác với sắc ký cột nhanh cột chạy khô sau thu phân đoạn Điều giống sắc ký lớp mỏng chế hóa đĩa làm khô sau chạy sau rửa giải lại 11.2 Quy trình: Một cột nhỏ phễu lọc Buchner vừa với thủy tinh ( 10-20 µm, độ xốp D hay 2) gắn khô với chất hấp thụ ( 10-40 µm loại sắc ký lớp mỏng, ví dụ silicagel Merck 60 H hay 60 G) Chất hấp thụ cho vào cách gõ nhẹ trọng lực Sau đưa chân không vào thông qua vòi ngã, chất hấp thụ nén xuống thành lớp mỏng cứng cách đè nút chặn cao su gõ nhẹ Tắt chân không, rót dung môi phân cực nhanh lên bề mặt chất hấp phụ, sau mở chân không Khi mà chất rửa giải qua, cột hút khô sẵn sàng để tải Mẫu dung môi thích hợp cho trực tiếp phía đầu cột kéo nhẹ nhàng vào vật hứng chân không Mẫu tái hất thu silicagel, nhôm oxide Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 22 Trang Cột triển khai với hỗn hợp dung môi thích hợp, bắt đầu với dung môi phân cực, tăng dần độ phân cực, rút cho cột khô phân đoạn thu ( điều tránh tạo rãnh) Ngược với phương pháp sử dụng áp suất phía đầu cột, lôi kéo cột VLC dễ dàng phía đầu cột với áp suất khí Nhìn chung, chiều cao cột hấp thụ không nên cm Với lớp nhỏ ( < 100 mg), thích hợp với cột 5-1 cm i.d cao cm, 0.5-1g, thích hợp kích thước 2.5*4 cm, từ 1-10 g, 5*5 cm, với lượng lớn phân lập tốt với phễu lọc thủy tinh nung với chiều cao cm Hỗn hợp để phân lập thêm vào cột silic vị trí với dầu hỏa ( làm thêm vào chất rắn) Tăng lượng dung môi phân cực cho phân đoạn dung môi liên tiếp Tăng độ phân cực lượng nhỏ (1%,2%, 3%), sau lượng tăng tới 5%, 10%, 20% 11.3 Các ứng dụng: Sắc ký lỏng chân không dùng để phân lập phần dịch chiết dược liệu trước dùng HPLC bước phân lập phức tạp khác Trong năm trước VLC sử dụng rộng rãi lĩnh vực sản phẩm tự nhiên chế hoạt động đơn giản Những chất hỗ trợ sắc ký khác sử dụng VLC: silicagel ( loại thường loại pha đảo), Al 2O3, CN, diol polyamide Chất rửa giải phổ biến ether dầu hỏa, tăng thành phần ethyl acetate Alkaloid Diterpene alkaloids phân lập nhanh chóng dễ dàng VLC Việc tinh khiết hóa aconitine thương mại VLC nhanh hơn, rẻ thuận tiện sắc ký lớp mỏng chế hóa, yếu tố quan trọng nhất, rõ việc rữa giải mẫu VLC mà không cần phải cạo đĩa Những phân lập diterpene alkaloids dùng VLC Al 2O3 báo cáo ( Pelletier and Badawi 1987; Joshi et al 1990: Liang et al 1991) Trong ví dụ có kết hợp VLC CTLC Một alkaloid guanidine độc phân lập từ bọt biển lục địa Anchinoe paupertas quy trình bao gồm VLC diol, với dichloromethane-methanol ( 10:05:5) ( Bouaicha et al 1994) Diterpene Dầu hạt Croton tiglium chứa phorbol-12,13-diester biết chất dị ứng gây ung thư Những diesters tinh khiết hóa silicagel 60( 15-40 µm, Merck) với máy VLC sữa đổi dùng dòng dung môi không đổi chân không Isobenzofuranones Dịch chiết từ rễ Polygonum multiflorum sử dụng thuốc cổ truyền Trung Quốc trị bệnh tim mạch Dịch chiết methanol rễ chia nước ethyl acetate Phần ethyl acetate sắc ký VLC giá sâu 2.5 cm theo loại silicagel 60H sắc ký lớp mỏng pha đảo, Merck ( số 7716) ( phễu Buchner đường kính 13.7 cm, thủy tinh xốp loại 3) Triterpen Glcosides Oleanolic acid saponin Dialium guineense phân lập từ quy trình sắc ký cột nhanh silicagel sau VLC lichoprep RP-18 với methanol 7:4 ( Odukova et al 1996) Limonoids Azadirone phân lập từ nhân hạt chưa chín Trichilia havanensis Dịch chiết hexane nhân chia hexane methanol-nước 19:1 Dung dịch methanol nước chiết với ethyl acetate VLC dịch chiết sau silicagel tái hoạt hóa với 5% nước ( rửa giải với dầu hỏa-ethyl acetate 19:1) thu trực tiếp limonoid( Arenas and Rogriquez-Hahn 1990) Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 23 Trang Xanthones xanthones phân lập từ Garcinia cowa quy trình gồm bước phân lập chủ yếu VLC Dịch chiết methanol vỏ phân lập thành phân đoạn VLC silicagel ( 80g), rửa giải thường xuyên với hexane, hỗn hợp hexane-benzene dichloromethane Các xanthones thu cách kết tinh trực tiếp từ phân đoạn hay từ sắc ký lớp mỏng ly tâm liên tục Cowanol cho thấy hoạt tính kháng khuẩn trung bình với Staphylococcus areus ( Na Pattalung et al 1994) Iridoids Việc áp dụng VLC để phân lập iridoid khác báo cáo Handjieva et al.( 1991 a,b) Với mục đích này, nhôm trung tính 60G ( 5-40 µm, Merck 1090), Silicagel sắc ký lớp mỏng 60H ( 15 µm, Merck 11695), Florisil ( 10-63 µm, Merck 12519 ) phễu lọc Buchner với đường kính khác ( tùy theo kích thước mẫu) sử dụng Một số biến đổi nhỏ phương pháp Coll Bowden ( 1986) thực hiện, đun nóng chất hấp thụ sử dụng lớp nhựa bên phần hỗ trợ Ví dụ: -Mẫu dịch chiết dichloromethane từ rễ khô Centrathus ruber -So sánh VLC sắc ký lớp mỏng chế hóa cho việc phân lập valepotriates từ Valeriana oficinalis cho thấy thuận lợi VLC: thời gian phân tích ngắn lần, lần dung môi, chất hấp thụ tái sử dụng 6-7 lần, VLC thu valepotriate bị biến chất so với sắc ký cột mở -Secoiridoid glucosides gentiopicroside swertiamarin thu dạng tinh khiết từ rễ tươi Gentiana punctata sau dùng VLC Ngoài việc phân lập iridoid glycosides VLC bao gồm báo cáo Boros at al ( 1990,1991), Akunyili et al ( 1991) Justice et al ( 1992) Trong ứng dụng báo cáo Boros et al.( 1990), “ mini-VLC” pipet Pasteur có sẵn dùng để phân lập số lượng nhỏ nguyên liệu Flavonoid glycosides Trong việc phân lập flavonol glycoside ( kaempferol-3-(2,3-diacetoxy-4-p-coumaroyl) rhamnoside) từ Myrica gale, bước tinh khiết hóa ban đầu VLC polyamide-TLC AC ( Macherey-Nagel), rửa giải với 50 ml, ước số methanol-nước với độ phân cực tăng dần ( methanol-nước 1:1Methanol 100%) ( Carton et al 1990) Acetylenic Alcohols VLC pha khung cyano ( 40 µm) sử dụng để phân lập acetylenic alcohols gây độc tế bào từ bọt biển Cribrochalina vasculum ( Hallock et al.1995) Chiết xuất bọt biển thô rửa giải VLC với gradient t-butyl methyl ether-hexanes: HPLC pha đảo cần thiết cho giai đoạn phân lập cuối alcohols chuỗi dài Polyacetylenes Một polyacetyllene độc tế bào, (-)-17-hydroxy-9,11,13,15-octadecatetraynoic aicd phân lập từ Minquartia guianensis, từ Ecuador Vỏ thân chiết xuất với dung môi có độ phân cực tăng dần dịch chiết chloroform cho có hoạt tính chống lại tế báo ung thư máu lympho P-388 chuột Dịch chiết trước tiên sắc ký với sắc ký cột mở phân đoạn hoạt tính mẫu cho VLC mộtt cột 8*40 cm silicagel 70-230 mesh Sau rửa giải với chloroform- ethylacetate- methanol ( 18:1:1) cuối kết tinh thu polyacetylene có hoạt tính Kawalactones Dịch chiết Cryptocarya kurzii ( Lauraceae) với ethanol thu cặn, cặn độc với tế bào KB Hỗn hợp có hoạt tính này, lacton loại kawa mới, kurzilactone, thu cách kết hợp VLC, sắc ký lớp mỏng chế hóa, HPLC pha đảo Silicagel 60H ( 70-230 mesh) sử Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 24 Trang dụng cho VLC, với dichloromethane-methanol ( 100:0, 99:1, 99:2, 19:1, 9:1) chất rửa giải ( Fu et al 1993) III HPLC ĐIỀU CHẾ Nguyên tắc, yêu cầu: Sự tách chất phương pháp sắc ký dựa trạng thái cân thành phần, chất hấp phụ cột (=pha tĩnh) dung môi chảy qua (pha động).Khi thành phần liên kết với pha tĩnh, tượng định nghĩa hấp phụ, thành phần bị tách nhờ pha động, tượng định nghĩa phản hấp phụ Khả hấp phụ cao thành phần nghiên cứu với pha tĩnh nghĩa lưu giữ thành phần cột cao thành phần rửa giải khỏi cột trễ thành phần khác Việc tách riêng chất từ hỗn hợp thành tiến hành chất có khả hấp phụ phản hấp phụ khác pha tĩnh pha động Bình chứa dung môi Bơm dung môi Bình chứa mẫu Bơm mẫu Valve mẫu bơm Cột sắc ký chế hóa Detector Bộ xử lý dữ liệu Valve bơm phân đoạn Bình hứng các phân đoạn Sơ đồ mô hình sắc ký lỏng chế hóa HPLC điều chế phương pháp hiệu sử dụng phổ biến để tách chất cần nghiên cứu khỏi hỗn hợp để tinh chế chất Các yếu tố sau phải ý đặc biệt: - Linh hoạt việc chọn cột Số lượng chất yêu cầu tách ảnh hưởng khác đến vấn đề cần giải Đơn giản phù hợp với kinh tế vấn đề phân tích cụ thể giải - Hiệu suất bơm cao Dung tích cột lớn yêu cầu thể tích dòng lớn hơn, tốc độ dòng cần phải lớn - Áp suất lớn Khuynh hướng sắc ký điều chế rõ ràng hướng chất hấp phụ dạng hạt mịn, điều dẫn đến kháng lực dòng đáng ý Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 25 Trang Ưu- nhược điểm, khả mức độ ứng dụng: Kích thước tiểu phân nhỏ hiệu trình tách chiết cao Tuy nhiên kích thước tiểu phân nhỏ áp suất phản hồi cột nhồi cao, điều giới hạn kích thước thực tế tiểu phân, tùy thuộc vào khả chịu áp thiết bị Nói chung, đa số thiết bị chịu áp suất phản hồi gây tiểu phân kích thước 5µm tốc độ dòng tối ưu Giá thành cao Trong phân tách điều chế, pha tĩnh thường hồi phục tái sử dụng để tinh chế hoạt chất Dung môi chạy sắc kí phần tốn khả tái sử dụng dung môi dùng quan trọng lựa chọn dung môi Nếu trình chạy ta dùng nhiều dung môi, ví dụ dung môi để tiêm mẫu dung môi khác để rửa giải, nên gom riêng dung môi để tiện cho việc tái chế vài hỗn hợp dung môi hexane–methyl-tert-butyl ether, hexane–ether, hỗn hợp thành phần phục hồi dung môi tinh khiết Trong kỹ thuật HPLC điều chế, cần sử dụng cột có kích thước lớn Nếu bán kính cột tăng, sử dụng kỹ thuật nhồi đặc biệt, nhồi hạt cột trở nên không hiệu nhồi hạt tự không ổn định Ngoài ra, để trì tốc độ tối ưu cho pha động, lưu lượng pha động cần phải tăng lên tiêu thụ pha động tốn Ngược lại, tăng chiều dài cột, kháng lực dòng chảy lớn dẫn đến áp suất cao cột Nếu sử dụng cột có bán kính lớn, sau nhờ sức mạnh khí hệ thống cột hạn chế áp suất tối đa cột Do đó, kéo dài cột sắc ký bán kính hạt nhồi phải tăng lên để cung cấp đủ tính thấm Tăng đường kính hạt làm giảm hiệu cột, làm giảm độ phân giải chất cần nghiên cứu Thật vậy, việc tính toán cho kỹ thuật sắc ký điều chế phức tạp, phải kiểm soát nhiều yếu tố tương tác, vậy, thông số tối ưu cần cho việc phân tách khó xác định Để hiểu yếu tố cần thiết sắc ký điều chế cần phải xác định công suất tải cột Pha tĩnh, cách chuẩn bị cột: Lí thuyết van Deemter cho tính chất quan trọng pha tĩnh dễ dàng chuyển khối qua lỗ tiểu phân Các tiểu phân silica dễ đạt độ đồng kích thước lỗ độ đồng tiểu phân tiểu phân polymer Điều nghĩa polymerics hơn, ngược lại pha tĩnh có kích cỡ tiểu phân đồng Bởi khác biệt pha tĩnh silica polymer rõ ràng so sánh chúng dạng cột nhồi sẵn (được nhồi áp suất cao cột DAC dẫn tới biến dạng tiểu phân polymer- điều làm giảm khe hỡ  tạo tiểu phân nhỏ hơn) IUPAC định nghĩa pha thuận tiến trình rửa giải pha tĩnh phân cực pha động thực tế, pha tĩnh thường dùng cho HPLC điều chế dựa silica tính phân cực silyl ether silanol cung cấp bề mặt thân nước Liên kết amino cyano với silica phổ biến pha thuận liên kết với cyano có vài tính chất pha đảo Cơ chế chiếm ưu liên kết Hydro Tuy nhiên nhóm silanol có tính acid nhẹ, bề mặt silica có khả trao đổi cation Pha thuận thường dùng để tinh chế phân tử hữu nhỏ, kĩ thuật thường dùng dược phẩm nông dược.Sự phát triển từ sắc kí cột nhanh tới HPLC điều chế dễ dàng hiểu nhà hóa học hữu truyền thống dẫn tới chấp nhận kĩ thuật với nhiều ng tiên phong tách chiết chất từ thực vật chuyển tiếp đồng thời từ tiểu phân vô định hình irregular tới tiểu phân pha tĩnh có dạng hình cầu chắn (điều chế cách phun dung dịch silicate trung tính thành giọt nhỏ luồng khí nóng, hay phân tán dung dịch silica thành dạng nhũ tương dung môi hữu thích hợp, giọt gel hình cầu hình thành Tuy nhiên chi tiết việc sản xuất giấu kín LC-A3) thúc đẩy nhu cầu tăng dần Như nói trước, tiểu phân silica vô định hình thường dễ bị đứt gãy tạo thành bụi mịn Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 26 Trang Pha tĩnh bao phủ nhóm –OH thiết kế cho sắc kí loại cỡ Zorbax GF 250 PLaquagel tương tự pha thuận, thuận lợi chúng chỗ tăng độ ổn định pH cao lựa chọn pha tĩnh qua trình nâng cấp qui mô (từ sắc kí phân tích) tiêu chuẩn quan trọng phát triển phương pháp ban đầu pha tĩnh sắc kí dùng qui trình nâng cấp phải có bán sẵn dạng cột phân tích (250mm x 4mm) dạng thô lượng lớn Nói chung, vật liệu nhồi thường dùng cho cột điều chế có kích cỡ từ 10-20 mcm 3.1 Normal-phase silica gels: • Kromasil, 10 µm dp with 60 or 100 Å pore diameter • Kromasil, 16 µm dp with 100 Å pore diameter • Chiralcel AS, 20 µm dp • Chiralcel OD, 20 µm dp 3.2 Reversed-phase silica gels: • Kromasil C8 • YMC C18 • Hyperprep C8 Mặc dù 84% pha tĩnh dung HPLC điều chế silica pha đảo Tuy vậy, pha thuận có lợi điểm riêng: + chuyển đổi trực tiếp từ TLC pha thuận HPLC sang LC chế hóa + giá thành vật liệu nhồi pha đảo cao vài vật liệu nhồi dạng thô (để nhồi thủ công) + làm silica pha thuận dễ pha thuận bền vững nhiều + loại bỏ dung môi thường dùng sắc kí pha thuận khỏi dịch sản phẩm cuồi dễ dàng loại bỏ nước khỏi phân đoạn sắc kí pha đảo, thực nhiệt độ thấp cho chất lượng sản phẩm cao tốn lượng Cách nhồi cột: + DAC (dynamic axial compression system- nén theo trục thẳng) phát minh Couillard: + radial compression system- phát triển Waters, thương mại hóa Biotage: Dùng cartridge polymer dẻo nhồi với pha tĩnh Cartridge đặt xy-lanh (cyclinder) áp cho áp suất + annular expansion: Dùng que có đầu hình nêm nén pha tĩnh cột (tạo nén trục nén kiểu tỏa trònradial) Cách nhồi cột phụ thuộc vào thiết kế cột Kiểu cột ngắn với phần cột mở rộng tháo rời đủ để chứa hỗn hợp chất nhồi(hình 4.3); cột dài, đủ lớn để chứa hỗn hợp chât nhồi pha tĩnh (hình 4.4) Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 27 Trang 4.1 Cột kiểu 4.3: Tính tổng thể tích cột cộng với ống chứa(reservoir) để xác định thể tích hỗn hợp nhồi A Mật độ nhồi pha tĩnh polymer thường 0.3g/cm3, pha tĩnh silica thường 0.6g/cm3 Thêm lượng thích hợp pha tĩnh vào bình đựng pha loãng với dung môi chọn để thể tích A Khuấy trộn tay hay máy, đạt hỗn hợp đồng nhất, ngừng khuấy để hỗn hợp qua đêm để loại khí pha tĩnh Lắp cột, phần ống chứa; gắn bơm hút chân không đồ hứng dung môi vào đáy cột Không hút chân không giai đoạn Phân tán lại hỗn hợp, sau đổ liên tục hỗn hợp vào cột Cần đổ nhanh để tránh hỗn hợp lắng trở lại; ngừng vài giây dẫn đến nứt cột làm giảm hiệu lực tách Hút chân không, rút dung môi lớp dung môi khoảng vài mm Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 28 Trang mặt cột Tháo ống hút chân không bít đáy cột (end fitting) lại Tháo ống chứa gắn nắp (column top end-fitting) Gắn đường dẫn dung môi thải vào cột (đáy cột bịt kín) Nén cột áp suất nén tới áp suất cho nhà sản xuất (60-100 bar) Cột lúc sẵn sàng cho nạp dung môi 4.2 Cột kiểu hình 4.4: Chuẩn bị hỗn hợp nhồi cột Bịt đáy cột nạp cột nhu Sau gắn piston lên cột, bình chứa dung môi, nén, mở đáy cột cho dung môi 4.3 Chuẩn bị mẫu- Đưa mẫu lên cột: Đưa mẫu vào : bước phức tạp áp suất đầu vào cao Thời gian lưu mẫu (retention time): Là khoảng thời gian từ lúc đưa mẫu vào đến đỉnh (peak) hiển thị rõ nét Khoảng thời gian bị chi phối yếu tố : + Áp suất đầu vào + Tính chất pha tĩnh (hợp chất, kích thước hạt) + Thành phần dung môi + Nhiệt độ cột overload sắc kí: lượng mẫu nạp lớn điều làm giảm hiệu cột, có loại: nạp vượt thể tích (volume overload) nạp vượt khối/ nồng độ (mass overload); mặc định có chủ ý sắc kí điều chế + volume overload dẫn tới mở rộng peak, mở rộng đối xứng hình dạng peak trước sau không bị méo/ biến dạng Trong sắc kí chế hóa thể tích mẫu tăng peak chất rửa giải gần chạm nhau, thể tích mẫu lúc tối ưu Trong sắc kí phân tích không chấp nhận chuyện này, không dùng cách nạp mẫu overload nào, ngoại trừ trường hợp làm tăng khả phân tích chất dạng vết + mass overload chắn làm cho peak bị biến dạng; mức nồng độ chất cần tách pha tĩnh vùng không tuyến tính đường đẳng nhiệt hấp phụ Nếu đường đẳng nhiệt hấp phụ lõm phía trục biểu thị nồng độ pha động nồng độ cao chất tan hệ số phân bố hiệu dụng thấp Vì phần có nồng độ chất tan cao di chuyển cột nhanh phần có nồng độ thấp, peak bị méo với phía trước nhọn đuôi bị nghiêng/ thoải Thời gian lưu nói chung giảm Tuy nhiên đường đẳng nhiệt lõm phía trục biểu diễn nồng độ pha tĩnh nồng độ cao chất tan, hệ số phân bố hiệu dụng lớn Và phần có nồng độ cao di chuyển chậm phần có nồng độ thấp cột, peak bị méo với phía trước nghiêng đuôi nhọn; trường hợp thời gian lưu nói chung giảm khối mẫu tăng 4.4 Với pha đảo (Reverse Phase HPLC Basics for LC/MS) Mẫu không nên hòa tan dung môi hữu không không gắn lên pha tĩnh Mẫu không nên tan dung dịch chứa chất tẩy, vài chất tẩy gắn lên cột pha đảo làm thay đổi tính chất cột không thuận nghịch Hơn chất tẩy ion hóa ưu tiên bị tác động dòng electron đầu dò khối phổ, làm giảm khả phát hay ức chế ion hóa chất phân tích Kiểm soát nhiệt độ: Không nghiên cứu sắc kí gọi hoàn chỉnh thiếu phần nghiên cứu nhiệt độ Nhiệt độ xung quanh ảnh hưởng thời gian lưu Nhiệt độ chạy thường 40°C Để ổn định nhiệt độ cho cột, ta dùng jacket (áo giữ nhiệt), buồng ổn nhiệt, Có thể dùng nhiệt độ để tác động tới trình chiết tách Nói chung nhiệt độ cao tốt hơn, peak nhọn rửa giải sớm Tuy nhiệt độ cao làm giảm tuổi thọ cột nhiều cột không chịu nhiệt độ 60°C Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 29 Trang Lựa chọn dung môi- Thay đổi dung môi: Pha thuận thường chạy với dung môi hữu cơ, thường hexane, heptane, cyclohexane hay halocarbon DCM, Cloroform Pha động rửa giải thường dung môi thân nước, nước, ester Acid hữu thường thêm vào để giảm thiểu hiệu ứng trao đổi ion nhóm silanol Rửa giải đẳng dòng với hỗn hợp butanol, acid acetiic nước giao thức chuẩn cho tách giải acid amin hỗn hợp methanol, cloroform, nước hữu dụng cho hợp chất hữu nói chung Peptide dễ dàng tinh chế rửa giải kiểu gradient silica pha thuận, tăng dần từ acetonitrile tới pha động có nước Kĩ thuật đặc biệt hiệu với peptide phân cực khó phân lập sắc kí pha đảo Pha đảo hoạt động môi trường đệm thân nước, nơi hấp phụ kị nước chất phân tích pha tĩnh bị xáo trộn bới tăng dần nồng độ dung môi hữu hỏa lẫn Ứng dụng phổ biến HPLC pha đảo tinh chế peptides protein, chất phân tích thường giả hấp rửa giải gradient Đệm chạy thân nước phổ biến thường nước chứa hàm lượng thấp axit trifluoroacetic (thường 0,1% v / v) pha động rửa giải thường acetonitrile- chất điều chỉnh độ phân cực- chứa axít trifluoroacetic Các trifluoroacetic axit phục vụ hai mục đích: trước hết, tạo cặp ion mạnh với chất phân tích, chống lại việc trao đổi cation với nhóm silanol tự giá mang silica; thứ nhì, với vai trò cặp ion, làm giảm thay đôi cấu trúc protein peptide cải thiện hình dạng peak Lợi điểm axit trifluoroacetic chỗ không hấp thu UV- kĩ thuật phát peptide nhiều phân tử khác Các đệm acid khác phosphate, acetate and hydrochloride thường dùng Ethanol, methanol, tetrahydrofuran, propionitrile propan-2-ol thường dùng với vai trò chất điều chỉnh độ phân cực, chúng không tốt acetonitrile Silica pha đảo không ổn định môi trường kiềm gốc ankyl hòa tan silica hoạt động lâu pH cao Với pha tĩnh polymer lỗ lớn ổn định pH cao (macroporous polymeric stationary phases) mở rộng khoảng pH hoạt động pha đảo khoảng 114 Pha đảo polymer thường dùng loại polymer trùng hợp từ styrene divinyl benzene Tính kị nước pha tĩnh mạch polymer dài vòng benzene, trình rửa giải dự đoán khác với pha tĩnh silica C18 chẳng hạn Thực tế, liệu rửa giải nhiều chất, trình tự rửa giải thời gian rửa giải quan sát pha tĩnh polymer chất lượng cao thường tương tự kết thu từ pha tĩnh silica chất lượng cao Phương pháp phát hiêên thu nhâên kết sắc ký: Một số phận phát hiện: -LC Detectors Based on Refractive Index Measurement The Refractive Index Detector The Angle of Deviation Method The Fresnel Method The Christiansen Effect Detector The Interferometer Detector The Thermal Lens Detector The Dielectric Constant Detector -The UV Detectors Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 30 Trang The UV Absorption Detectors The Fixed Wavelength UV Detector The Multi–Wavelength UV Detector The Multi–Wavelength Dispersive UV Detector The Diode Array Detector The Fluorescence Detector The Single Wavelength Excitation Fluorescence Detector The Multi Wavelength Fluorescence Detector -Transport Detectors The Moving Wire Detector The Chain Detector The Modified Moving Wire Detector The Disc Detector -The Evaporative Light Scattering Detector -Liquid Light Scattering Detectors The Low Angle Laser Light Scattering Detector The Multiple Angle Laser Light Scattering (MALLS) Detector -The Electrical Conductivity Detector -The Electrochemical Detector Electrode Configurations Electrode Construction Basic Electrochemical Detector Electronics The Multi–Electrode Array Detector Các ứng dụng cụ thể: Tinh chế taxol sắc ký lỏng điều chế sử dụng công nghiệp: phương pháp nghiên cứu phát triển để tinh chế taxol từ dịch chiết cloroform thô Taxus yunnanensis sử dụng sắc ký lỏng điều chế công nghiệp (IPLC) dựa pha tĩnh polymer (D956 resin) Sử dung hệ thống thiết bị đơn (single-system apparatus), khoảng kg dịch chiết thô tải qua cột đầu tiên, cuối cùng, qua lần chạy sắc ký, khoảng 50g taxol (99% tinh khiết) thu sau 155h, ko tốn dung môi hữu Sự thu hồi taxol đạt 80% Nhựa D956 cho thấy tính chon lọc khả tách taxol cao so với silicagel C materials Với hệ thống này, việc áp dung chiết taxol công nghiệp thực (Journal of Chromatography A, 813 (1998) 201–204 Purification of taxol by industrial preparative liquid chromatography, Xuefeng Yang*, Kailu Liu, Man Xie, Beijing Research Institute of Chemical Engineering and Metallurgy, P.O Box 234, Beijing 101149, China, 1998) Ứng dụng sắc ký lỏng điều chế xác định polyphenol từ chè xanh thứ phẩm TS Phùng Lan Hương IV SẮC KÝ PHÂN BỐ NGƯỢC DÒNG Nguyên tắc phương pháp:[7] Là phương pháp sử dụng chất lỏng hoàn toàn, tham gia giá mang phase rắn dựa Sắc ký điều chế - Nhóm – TT DL chiều T3 31 Trang vào phân bố mẫu chất lỏng không hỗn hòa để tiến hành tách Hệ số phân bố giúp xác định tỉ lệ mẫu phase Cột CCC gồm ống hình xoắn ốc Teflon độn vào pha tĩnh lỏng, Pha động cho chảy qua từ từ qua, thay dần pha tĩnh Để tránh tượng pha động chảy qua đơn đẩy toàn pha tĩnh ngoài, người ta thêm tác động trọng trường cách dùng lực ly tâm, lực thay đổi chuyển động quay tròn hai trục.[6] Ưu nhược điểm phương pháp:[9] Ưu điểm: So với phương pháp phân tích rắn lỏng truyền thống CCC có nhiều ưu điểm trội: có hấp phụ đảo ngược hồi phục hoàn toàn mẫu bơm kéo vệt sắc ký đồ rủi ro khả mẫu bị phá hủy tiết kiệm dung môi kinh tế ( không cần cột đắt tiền, dung môi thông thường…) Trong HPLC pha tĩnh chiếm 29% thể tích, trong CCC số 80% Có thể nội chuyển đổi phase động phase tĩnh thay tuyệt vời cho quy trình gặp phải hấp phụ phase rắn Nhược điểm: Số đĩa lý thuyết CCC HPLC Thời gian sắc ký kéo dài phải giữ nhiệt độ cố định suốt trình Pha tĩnh: Cellulose: tách chất phân cực mà không tách chế hấp phụ Cấu tạo polysacccharid dạng polymer (C6H10O5)n Đối với sắc ký cột, dùng dạng cellulose vi tinh thể làm ẩm với lượng pha tĩnh vừa đủ, hoà vào pha động tạo thành hỗn dịch Polyamid: chất phân bố chất hấp phụ, chế phân bố nhớ xoang rỗng polyamid Polyamid thông dụng loại polyamid (polycaprolactam) polyamid 11 (polyundecanamid) Silica gel ghép: silica gel (Si-OH) ghép với mạch hydrocarbon phân cực (Silica gel pha đảo), ghép với mạch phân cực (Silica gel pha thuận) Dung môi: Do sắc ký tuỳ thuộc vào khả hoà tan chất phân tích pha động pha tĩnh nên dung môi yếu tố quan trọng định bảng sắc ký tốt Mẫu phân tích thường chất phân cực nên dùng môi mang tính phân cực Việc chọn dung môi nên tham khảo tài liệu nghiên cứu trước Bảng hệ dung môi tương ứng với loại hợp chất tự nhiên tham khảo tài liệu [8] Hệ dung môi pha tốt cần đảm bảo yêu cầu: Đảm bào pha tĩnh có lực thích hợp nhất, thời gian ổn định hệ dung môi nên 30s Hệ số phân bố chất phân tích nên khoảng 0,5[...]... Ví dụ các kết quả: Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3 19 Trang 10 SẮC KÝ CỘT KHÔ Sắc ký cột khô ( DDC) là một kỹ thuật sắc ký hiện đại cho phép chuyển đổi nhanh chóng và dễ dàng các thông số hoạt động của cắc ký lớp mỏng phân tích ( TLC) sang sắc ký cột chế hóa ( CC) Sắc ký cột khô khắc phục được nhược điểm của 2 phương pháp sắc ký lớp mỏng phân tích và sắc ký cột chế hóa Sắc ký lớp mỏng là một... USA Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3 35 Trang VII.MỤC LỤC I SẮC KÝ LỚP MỎNG ĐIỀU CHẾ 1 1 Ưu nhược điểm của PTLC: 1 2 Ứng dụng: 1 3 Pha tĩnh: 1 4 Dung môi: 2 5 Chuẩn bị mẫu sắc ký: 2 6 Cách phát hiện trong sắc ký lớp mỏng điều chế: 3 II SẮC KÝ CỘT ĐIỀU CHẾ .4 1 CÁC CÁCH TIẾN HÀNH PHÂN TÍCH SẮC... TÍCH SẮC KÝ 4 2 Cột sắc ký 5 3 Pha tĩnh 5 4 Kỹ thuật nhồi cột sắc kí 7 5 Pha động 9 6 Cách phát hiện trong sắc ký cột điều chế: 12 7 Định tính một cột sắc ký .12 8 Phân lập kết quả sắc ký: 15 9 Sắc ký cột nhanh (FC – Flash Chromatography) 15 10 SẮC KÝ CỘT KHÔ 20 11 SẮC KÝ LỎNG CHÂN... hấp phụ Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3 20 Trang Chất hấp phụ sắc ký cột khô có sẵn trên thị trường được điều chỉnh phù hợp với đặc tính lý hóa của sắc ký lớp mỏng, trong suốt chu trình sản xuất Với những đặc tính lý hóa tương tự, các giá trị Rf của các chất phân tích bằng sắc ký lớp mỏng thì hầu như đúng với các giá trị thu được từ sắc ký cột khô Việc sử dụng những chất hấp phụ được điều chỉnh... gel với nhóm không phân cực nhưng C-18 hoặc những gốc tương đồng Vật liệu pha đảo mắc hơn nhiều so với pha tĩnh chuẩn và đó là lý do chính khiến pha tĩnh chuẩn được sử dụng chủ yếu trong sắc ký nhanh Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3 16 Trang 9.3 Khảo sát hệ thống sắc ký trước bằng sắc ký lớp mỏng: Như đã đề cập, đa phần sắc ký cột nhanh sử dụng pha tĩnh là silica gel bình thường hoặc phân cực... cao hơn so với FC nên cần phải có sự điều chỉnh khi áp dụng từ TLC đến FC Thể tích cột CV = 1/Rf Rf nằm trong khoảng từ 0.15 – 0.4 sẽ tương ứng với thể tích cột 2.5 -6.6 Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3 18 Trang 9.5 Nạp mẫu lên cột Việc nạp mẫu đối với sắc ký cột bình thường là một công việc đơn giản trong phân tích sắc ký, tuy nhiên trong sắc ký điều chế, cột thường được triển khai quá tải... môi cho sắc ký pha thuận: 5.3 Dung môi cho sắc ký pha đảo: 5.4 Dung môi cho sắc ký gel: (Theo cơ chế rây phân tử, trao đổi ion, ái lực) Ngược lại với các loại sắc ký khác, sắc ký gel không cho phép người dùng tác động lên tính tan do sự thay đổi pha động Pha động chỉ được chọn theo 3 tiêu chí: Khả năng hòa tan tốt mẫu Độ nhớt thấp (= áp lực tác động lê gel thấp) Không làm phá hủy pha tĩnh Tài liệu cung... và có thể chuyển đổi những kết quả của sắc ký lớp mỏng sang sắc ký cột rửa giải một cách nhanh chóng, tiết kiệm thời gian và tiền bạc Những chất liệu cho sắc ký cột hấp phụ tương ứng với những chất liệu của lớp mỏng thông dụng nhất, như chì DDC, nhôm DDC Những chất hấp thụ sắc ký cột khô này được sử dụng rộng rãi khi cần phải tăng lên một cách tương xứng với sắc ký lớp mỏng, để chuẩn bị đủ số lượng các... pH Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3 32 Trang 5 Cách phát hiện: Cũng như kỹ thuật sắc ký cột thông thường, ta sẽ thu những phân đoạn chất chảy ra, những chất có độ tan càng nhiều trong pha động thì sẽ ra trước Từ những phân đoạn thu được, ta tiến hành những phương pháp chuyên biệt để định tính cũng như định lượng chất phân tích Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3 33 Trang V MPLC ĐIỀU CHẾ... kurzilactone, thu được bằng cách kết hợp VLC, sắc ký lớp mỏng chế hóa, HPLC pha đảo Silicagel 60H ( 70-230 mesh) được sử Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3 24 Trang dụng cho VLC, với dichloromethane-methanol ( 100:0, 99:1, 99:2, 19:1, 9:1) như là chất rửa giải ( Fu et al 1993) III HPLC ĐIỀU CHẾ 1 Nguyên tắc, yêu cầu: Sự tách các chất bằng phương pháp sắc ký dựa trên trạng thái cân bằng giữa các thành