Bài TÁCH CHIẾT VÀ QUAN SÁT TRỰC QUAN DNA Phương pháp đơn giản tách chiết DNA từ chuối Mục đích, yêu cầu - Sinh viên hiểu cấu trúc tế bào, vị trí DNA nằm chủ yếu nhân tế bào - Sinh viên nắm nguyên lý phương pháp tách chiết DNA từ tế bào thực vật - Sinh viên thực hành quan sát trực quan DNA kết tủa hiểu tính chất axit nucleic bước tiến hành thí nghiệm Cơ sở khoa học - Một số đặc điểm phân tử DNA: DNA nằm chủ yếu nhân tế bào (98 - 99%), nằm ty thể, lạp thể, virut, viroid gây bệnh DNA SV nhân thật có cấu tạo dạng thẳng, SV tiền nhân có cấu tạo dạng vòng (vi khuẩn, virus) cuộn chặt thành cấu trúc NST DNA mang điện âm protein histon lại tích điện dương, làm trung hòa điện tích DNA nhiễm sắc thể DNA thường dài đến 1mm, sợi DNA quấn quanh phân tử protein histon tạo nên sợi nhiễm sắc - poly nucleosome Sợi nhiễm sắc có kích thước khoảng 100Ao , sợi nhiễm sắc gấp nếp tạo nên cấu trúc phức tạp lớn có đường kính 300Ao gọi solenoid Trong nhân tế bào, sợi solenoid kết hợp chặt chẽ với nhiều protein RNA tạo thành nhiễm sắc chất, đạt độ nén cực đại tạo thành nhiễm sắc thể - Nguyên lý phương pháp tách chiết DNA Mục đích tách chiết DNA: nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử việc chiết xuất tinh lượng DNA RNA không bị phân huỷ, bị gãy tác động giới, enzyme nội, ngoại bào hoá chất; không lẫn tạp thành phần khác (protein, RNA, lipid, gluxit, xác tế bào…) Gồm bước lấy mẫu bước tách chiết - Lấy mẫu: Lấy mẫu, tốt mô non, không bẩn hay bị nhiễm bệnh Không nên lấy mẫu quan dự trữ nhiều protein, gluxit lipid chiết xuất phải tốn công loại bỏ tạp chất Mẫu lấy xong cần phải hạn chế hoạt động enzym DNase cách làm lạnh bỏ vào đá lạnh Phá vỡ màng tế bào màng nhân: tùy đặc điểm cấu tạo màng/thành tế bào có phương pháp phá vỡ khác (nghiền, dùng enzyme, nhiệt độ cao…) Trong tế bào thịt chuối yếu nên cần dằm nát đạt yêu cầu 2 Hoà tan DNA loại bỏ tạp chất: thành phần mẫu DNA chiết xuất thường chứa protein, RNA, carbohydrate lipid, cần phải loại bỏ tạp chất khỏi dung dịch DNA Kết tủa DNA: mục đích kết tủa nhằm thu DNA dạng cô đặc, bảo vệ chúng không bị phân hủy enzyme DNase cần lại hòa tan chúng theo nồng độ tùy ý Để kết tủa DNA dùng hóa chất là: Ethanol Isopropanol Vật liệu, hóa chất thiết bị 3.1 Vật liệu hóa chất - 1-2 chuối chín - Đệm chiết: (1.5 g salt + 10 ml detergent + 90 ml distilled water) - Ethanol 100% để đá tủ lạnh 3.2 Thiết bị - Đĩa petri, thìa nhựa Ống nghiệm thủy tinh Bể ổn nhiệt cài đặt sẵn nhiệt độ 50-60oC Giấy/khăn lọc Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị: - Pha dung dịch đệm chiết 100 mL (1.5 g salt + 10 ml detergent hòa tan 90 ml nước cất) - Cài đặt bể ổn nhiệt 50-60oC - Để Ethanol 100% đá tủ lạnh Tiến hành: Lấy thìa thịt chuối vào đĩa petri, nghiền thật kỹ thìa Thêm mL đệm chiết đảo thìa Chuyển hỗn hợp vào ống nghiệm ủ bể ổn nhiệt 50-60° C 10 phút Trong lúc chờ đợi, sinh viên chuẩn bị giấy/vải lọc ông nghiệm thủy tinh Lấy hỗn hợp khỏi bể ổn nhiệt Cẩn thận dùng giấy/khăn lọc hỗn hợp, thu dịch vào ống nghiệm thủy tinh Bước để loại bỏ xác tế bào cụ tế bào thừa sau phá màng Giữ ống nghiệm nghiêng góc 45o đổ nhẹ nhàng Ethanol 100% lạnh chảy từ từ theo thành ông nghiệm xuống bề mặt dung dịch Cắm ống nghiệm thẳng đứng vào giá, để im 5-10 phút Quan sát vẩn DNA kết tủa trắng đục lên từ lớp hỗn hợp phía lên lớp dung dịch ethanol phía Những điểm cần lưu ý - Kiểm tra mực nước trước bật bể ổn nhiệt - Tắt thiết bị sau sử dụng - Đệm chiết chứa chất tẩy rửa giúp hòa tan lớp màng tế bào cấu tạo từ lớp lipid kép - Dung dịch muối làm cho phân tử DNA kết dính vào dễ kết tủa 6 Câu hỏi Vai trò đệm chiết tách chiết DNA Tác dụng ethanol/isopropanol tách chiết DNA Giải thích khó khăn việc phá màng tế bào thực vật? Thuận lợi việc sử dụng thịt chuối để tách chiêt DNA? ... tan DNA loại bỏ tạp chất: thành phần mẫu DNA chiết xuất thường chứa protein, RNA, carbohydrate lipid, cần phải loại bỏ tạp chất khỏi dung dịch DNA Kết tủa DNA: mục đích kết tủa nhằm thu DNA dạng... chúng không bị phân hủy enzyme DNase cần lại hòa tan chúng theo nồng độ tùy ý Để kết tủa DNA dùng hóa chất là: Ethanol Isopropanol Vật liệu, hóa chất thiết bị 3.1 Vật liệu hóa chất - 1-2 chuối... lipid kép - Dung dịch muối làm cho phân tử DNA kết dính vào dễ kết tủa 6 Câu hỏi Vai trò đệm chiết tách chiết DNA Tác dụng ethanol/isopropanol tách chiết DNA Giải thích khó khăn việc phá màng tế