Enterobacter sakazakii mối hiểm họa đối với trẻ sơ sinh

Enterobacter sakazakii mối hiểm họa đối với trẻ sơ sinh

Enterobacter sakazakii

MỐI HIỂM HỌA ĐỐI VỚI TRẺ SƠ SINH

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BPW = Buffer Pepton Water

EE broth = Enterobacteriaceae Enrichment broth

FDA = Food and Drug Administration

IFM = Infant Fomula Milks

IAC = Internal Amplification Control

MRS = DeMann Rogosa Sharpe Agar

ompA = outer membrane protein A

PCA = Plate Count Agar

PCR = Polymerase Chain Reaction

TSA = Trypticase Soya Agar

VRBGA = Violet Red Bile Glucose Agar

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÁC NHÂN GÂY NGỘ ĐỘC

1.1 Lịch sử phát hiện:

Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) mỗi năm có hàng triệu trường hợp

bệnh do thực phẩm xảy ra trên toàn thế giới Năm 1958 Enterobacter sakazakii lần đầu

tiên liên quan đến một trường hợp viêm màng não ở trẻ sơ sinh Kể từ đó, khoảng 70trường hợp nhiễm E sakazakii đã được báo cáo, nhưng đó chỉ có thể là số trường hợpđáng kể dưới báo cáo trong tất cả các nước và tỷ lệ này có thể là cao hơn Lúc bấy giờ,

sinh vật này được gọi là “sắc tố màu vàng - Enterobacter cloacae” mãi đến năm 1980 mới được đổi tên là Enterobacter sakazakii (bởi Farmer và cộng sự).

Một cuộc điều tra quy mô về các sản phẩm sữa bột và thức ăn khô cho trẻ đã diễn ratrên phạm vi 7 quốc gia châu Âu, Mỹ, Hàn Quốc và Nam Phi Hơn 200 mẫu từ 110 sảnphẩm khác nhau được phân tích cẩn thận để truy lùng dấu vết của các loại khuẩn gây hại.Kết quả hoàn toàn bất ngờ, 8 trong số 82 mẫu sữa bột dành cho trẻ sơ sinh có chứa các

loại vi khuẩn gây bệnh đường ruột 12 trong 49 thực phẩm khô cũng ở tình trạng tương tự.Trong số các loại khuẩn được phát hiện, người ta nhận dạng được 13 dòng vi khuẩn thuộc

họ Enterobacteriaceae gây bệnh viêm dạ dày - ruột, trong đó có cả Enterobacter sakazakii

gây viêm màng não

Vào năm 2001, một thảm cảnh đã diễn ra tại khu chăm sóc đặc biệt cho trẻ sơ sinh ởbang Tennessee (Mỹ), - hàng chục bé đã bị viêm màng não Sau này, người ta mới pháthiện ra nguyên nhân là từ một lô sữa bột dành cho trẻ Năm 2004, các chuyên gia của Tổchức Lương thực và Nông nghiệp của Liên hợp quốc (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới(WHO) đã họp và phát triển hướng dẫn quốc tế qua các thông điệp giáo dục về

-Genus (chi): Enterobacter

-Species (loài): Enterobacter sakazakii

1.3 Đặc điểm:

1.3.1 Đặc điểm chung:

Enterobacter sakazakii là trực khuẩn hình que,

gram âm, có kích thước chiều dài là 3 micromet và

chiều rộng là 1 micromet, kị khí tuỳ nghi, không có

sự hình thành bào tử, có sắc tố vàng, chịu được áp

suất thẩm thấu cao, di động, cung cấp các viên

nang và có vành lông rung Ngoài ra nó thuộc loại

vi khuẩn ưa nhiệt ôn hòa

- Nhiệt độ tối đa của sự phát triển: 41-45oC

- Nhiệt độ tối thiểu của sự phát triển: 5.5-8.0oC

- Không phát triển ở nhiệt độ: 4oC

1.3.2 Đặc điểm sinh hóa:

Các chủng Enterobacter đều có sự hoạt động của α-glucosidase và phosphoamidase

Enterobacter sakazakii sau khi phân lập thấy có sự lên men của đường sucrose, raffinose,

và α-methyl-D-glucozit, nhưng không phải D-sorbitol, dulcitol, adonitol, Daeabinol

1.4 Cấu trúc:

- Enterobacter sakazakii có cấu trúc gen ompA với trình tự ATCC 51329.

1.5 Yếu tố độc lực:

E.sakazakii tiết ra độc tố enterotoxin (độc tố về đường ruột) Đây là độc tố protein có

trọng lượng phân tử thấp, thường có nhiệt độ ổn định và tan trong nước Độc tố thườngxuyên gây độc tế bào và giết chết tế bào bằng cách thay đổi tính thấm của màng tế bàođỉnh (biểu mô) tế bào niêm mạc của thành ruột

1.6 Cơ chế gây bệnh:

Trong tế bào mô của động vật có vú, Enterobacter sakazakii có thể gắn vào đường ruộtcủa tế bào và tồn tại bên trong các đại thực bào Tuy nhiên, cơ chế mà adhesions củaEnterobacter sakazakii có khả năng thụ thể trên tế bào chủ thì hiện nay quá trình này vẫnchưa được xác định rõ ràng Chủng Enterobacter sakazakii có thể sinh ra các viên nang,nhờ đó có thể tấn công vào cơ thể tế bào vật chủ mà vẫn tránh được hiện tượng đại thựcbào trong ruột Hơn thế nữa, viên nang này giúp bảo vệ tế bào trực khuẩn Enterobactersakazakii, tạo điều kiện thuận lợi giúp nó tồn tại trong môi trường khô Sau khi xâm nhậpvào tế bào chủ (nhất là đối với trẻ sơ sinh) sinh vật này sẽ gắn vào bề mặt màng plastics

và lớp silicon, và cứ như thế phát triển bởi lớp màng biofim Việc nhiễm E sakazakii đốivới trẻ sơ sinh dễ xảy ra nhất trong quá trình pha chế sữa cho trẻ, trực khuẩn này sẽ tồn tạivới một số lượng lớn dưới núm vú của bình sữa Trong tế bào chủ, nó được bao bọc bởimàng biofim có thể tránh được những thay đổi bên trong tế bào chủ làm ảnh hưởng đếnsinh vật này, từ đó khả năng kháng sinh của nó cũng được phát triển

1.7 Bệnh và các triệu chứng bệnh:

- Như những báo cáo gần đây bởi cơ quan chính phủ Mỹ FDA cho rằng Enterobacter sakazakii không chịu nhiệt và có thể dễ dàng giết chết ở nhiệt độ trên 600, như áp dụngtrong các quá trình công nghiệp, ví dụ như phương pháp tiệt trùng Pasteur Vì vậy trướckhi cho trẻ dùng sữa cần tiến hành khử trùng dụng cụ pha chế, đun sôi nước dùng (nhiệt

độ trên 70oC) pha chế sữa hoặc đun hoàn nguyên để đảm bảo các điều kiện an toàn

- Những chuyên gia về y tế cần được đào tạo với chất lượng cao và được hướng dẫn quản

lý rủi ro hiệu quả, đảm bảo những điều kiện vệ sinh tối ưu cho việc lưu trữ, xử lý, sảnxuất và chuẩn bị các công thức sữa bột với mục đích ngăn chặn sự hiện diện và phát triển

của một số loài vi khuẩn gây bệnh có trong công thức sữa đặc biệt là Enterobacter sakazakii.

-Các trung tâm chuẩn đoán, phòng trừ và chữa trị bệnh như bệnh viện,… cũng phải đảmbảo vệ sinh tốt trong khu vực đảm bảo của họ, bao gồm cả việc điều trị chống vi khuẩntrước khi chuẩn bị các công thức và phối hợp nỗ lực để giảm thiểu thời gian giữa chuẩn bị

và tiêu dùng

- Về phía các nhà sản xuất thực phẩm cho trẻ sơ sinh cần có biện pháp mở rộng ở cấp dộnhà máy để đảm bảo mức độ cao nhất về chất lượng sản phẩm và độ an toàn Để thựchiện được yêu cầu này các nhà sản xuất phải:

+Có một quy trình kiểm soát nghiêm ngặt nhằm ngăn ngừa ô nhiễm từ khâu sản xuấtđến các điểm mua hàng của người tiêu dùng

+ Giám sát chặt chẽ các thành phần, đặc biệt là những gia tăng sau bước cuối cùng củagiai đoạn chế biến nhiệt

+Có các biện pháp phát hiện, loại bỏ hay xử lý tốt nhất để giảm thiểu sự có mặt củaEnterobacteriaceae hoặc coliform trong môi trường sản xuất

+Đào tạo, bồi dưỡng và tổ chức cán bộ để đảm bảo tuân thủ những tiêu chuẩn an toàntrong quy trình công nghệ sản xuất

+Kiểm tra tiêu chuẩn vi sinh của thành phẩm nhằm đảm bảo chất lượng và sự an toàncủa sản phẩm Nếu đạt yêu cầu, đủ tiêu chuẩn sẽ được phân phối đưa ra thị trường, cònkhông phải xử lý hoặc hủy bỏ tránh ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng

CHƯƠNG II : CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH

2.1 Phương pháp truyền thống:

Nhóm chúng tôi sử dụng 2 phương pháp: nuôi cấy và đếm khuẩn lạc

 Phương pháp nuôi cấy:

2.1.1 Nguyên tắc:

Chỉ sử dụng các thuốc thử thuộc loại phân tích, nước được sử dụng phải là nước cất,nước đã loại khoáng hoặc có chất lượng tương đương Nước được sử dụng không chứacác chất gây ức chế sự phát triển của vi sinh vật trong điều kiện thử nghiệm

Để tăng độ tái lập của các kết quả, nên sử dụng các thành phần cơ bản khô hoặc môitrường hoàn chỉnh khô để chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Các giá trị pH được quy về 250C Dùng acid clohydric [c(HCL)= 1mol/l] hoặc dungdịch natri hydroxit [c(NaOH)= 1mol/l] để chỉnh pH nếu cần

Môi trường nuôi cấy và thuốc thử đã chuẩn bị nếu chua sử dụng ngay thì phải được bảoquản trong các điều kiện không làm thay đổi thành phần của chúng, nơi tối, ở nhiệt độ từ

00C đến 50C không quá 1 tháng , trừ khi có quy định khác

2.1.2 Môi trường nuôi cấy và thuốc thử:

2.1.2.1 Môi trường nuôi cấy:

-Môi trường pha loãng mẫu nước đệm pepton Buffer Pepton Water (BPW)

-Môi trường thạch đậu tương trypton (TSA)

-Canh thang tryptoza lauryl sunfat cải biến (mLST)/môi trường vancomyxin

-Môi trường thạch phân lập Enterobacter sakazakii(ESIA TM)

-Môi trường vi sinh Brilliance Enterobacter sakazakii Agar (DFI)

2.1.2.2 Môi trường và thuốc thử về đặc tính sinh hóa:

-Thuốc thử phát hiện oxidaza

-Môi trường L-lysin tách nhóm carboxyl (decarboxylation)

-Môi trường L-Ornithin tách nhóm carboxyl (decarboxylation)

-Môi trường L-Arginin cộng hai hydro (dihydrolation)

-Môi trường để lên men hydrat carbon (nước pepton có đệm phenol, D-sorbitol, L-sobitol,L-rhamnoza, D-sucroza, D-melibioza và amygdalin)

-Môi trường Simmons xitrat

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ:

-Thiết bị khử trùng khô (tủ sấy) hoặc thiết bị khử trùng ướt (Autoclave)

-Pipet 1ml

-Nồi cách thủy, có thể duy trì ở nhiệt độ 440C ± 0.50C

-Đĩa Petri, đường kính từ 90mm đến 100mm

-Ống nghiệm, đường kính 18mm và dài 160mm

-Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 250C ± 10C, 300C ± 10C và 440C± 10C tương ứng-Vòng cấy, đường kính 3mm hay vòng cấy sử dụng một lần

-Máy đo pH, có thể đo chính xác đến 0.1 pH ở nhiệt độ 250C ± 10C

2.1.4 Quy trình phân tích:

Nhóm 23- 08DSH2 9

Chuẩn bị mẫu thử/tiền tăng sinh:

Cân 25g mẫu cho vào 225ml môi trường BPW

Tăng sinh chọn lọc trong môi trường vancomyxin/mLST:

Chuyển 0.1ml từ BPW đã cấy vào 10ml môi trường vancomyxin/mLST

Phân lập trên thạch sinh màu chọn lọc:

Cấy vạch một vòng đầy dịch cấy từ môi trường vancomyxin/mLST lên

thạch sinh màu trong đĩa Petri

Khẳng định: Sinh màu vàng

Chọn năm khuẩn lạc điển hình và cấy vạch lên đĩa TSA

Khẳng định: Sinh hóa

Chọn một khuẩn lac màu vàng từ mỗi đĩa TSA để thử sinh hóa

Diễn giải kết quả

Ủ ở 37C trong 18h ± 2h

Ủ ở 44C trong 24h ± 2h

Ủ ở 44C trong 24h ± 2h

Ủ ở 25C trong 48h ± 4h

2.1.5 Thuyết minh quy trình:

2.1.5.1 Chuẩn bị mẫu:

Cân 9g mẫu thử cho vào 225ml môi trường BPW Để yên cho các mẫu khô tan trongdịch lỏng mà không khuấy trộn nếu sau 30 phút mà mẫu không hết thì trộn nhẹ nhàngmẫu với môi trường

2.1.5.2 Tiền tăng sinh:

Ủ mẫu đã cấy trong môi trường tiền tăng sinh ở 370C ± 10C trong 18h ± 2h

2.1.5.4 Phân lập Enterobacter sakazakiigiả định:

Sau khi ủ trong môi trường vancomyxin/mLST đã cấy, ria cấy một vòng đầy (khoảng10µl) lên bề mặt đĩa thạch phân lập Ủ đĩa ở 440C ± 10C trong 24h ± 2h

Sau khi ủ, kiểm tra đĩa thạch sinh màu về sự có mặt hay không có mặt các khuẩn lạc

điển hình Enterobacter sakazakii giả định Các khuẩn lạc điển hình có màu xanh lá cây

đến màu xanh lục, cỡ nhỏ đến trung bình (1mm-3mm) Các khuẩn lạc không điển hìnhthường hoi trong suốt và có màu tím.

2.1.5.5 Khẳng định:

a Sinh sắc tố vàng

Chọn từ một đến năm khuẩn lạc Enterobacter sakazakii giả định điển hình đã kiểm tra

trên đĩa thạch sinh màu đã ủ

Cấy vạch các khuẩn đã chọn lên bề mặt đĩa thạch TSA, sao cho sau khi ủ quan sát đượccác khuẩn lạc tách biệt Ủ đĩa này ở 250C ± 10C trong 48h ± 4h Sau khi ủ, kiểm tra cácđĩa TSA về sự có mặt các khuẩn lạc màu vàng (Hình 1)

Hình 1 Khuẩn lạc màu vàng phát triển trên môi trường TSA

•Phép thử oxidaza:

Dùng kim cấy sử dụng một lần hoặc que cấy

bằng thủy tinh, lấy một phần của mỗi khuẩn lạc

đặc trưng đã chọn

Ria cấy lên giấy lọc được làm ẩm bằng thuốc

thử oxidaza Không sử dụng vòng cấy hoặc que

cấy bằng niken hoặc crom

Nếu màu của giấy lọc không đổi sang màu tím

hoa cà, màu tím hoặc màu xanh đậm trong 10s

thì phản ứng được xem là âm tính.(Hình 2)

Hình 2 Kết quả phép thử oxidaza

•Phép thử decarboxylaza L-Lysin:

Dùng vòng cấy, que cấy hoặc đĩa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngaydưới bề mặt môi trường lỏng L-Lysin decarboxylation Ủ các ống này ở 300C ± 10C từ24h ± 2h

Sau khi ủ có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính Màu vàng chứng tỏ âm tính

•Phép thử decarboxylaza L-Ornithin:

Dùng vòng cấy, que cấy hoặc đĩa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngaydưới bề mặt môi trường lỏng L-Ornithin decarboxylation Ủ các ống này ở 300C ± 10C từ24h ± 2h

Sau khi ủ có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính Màu vàng chứng tỏ âm tính

•Phép thử dihydrolaza L-Arginin:

Dùng vòng cấy, que cấy hoặc đĩa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngaydưới bề mặt môi trường lỏng dihydrolaza L-Arginin Ủ các ống này ở 300C ± 10C từ 24h

± 2h

Sau khi ủ có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính Màu vàng chứng tỏ âm tính.(Hình 3)

Hình 3 Kết quả của phép thử decarboxylaza L-Lysin, L-Ornithing, L-Ariginin

•Phép thử lên men các loại đường khác nhau:

Dùng vòng cấy, que cấy hoặc đĩa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngaydưới bề mặt môi trường lỏng lên men hydrat carbon Ủ các ống này ở 300C ± 10C từ 24h

Đối chứng trắng Phản ứng âm tính Phản ứng dương tính

Hình 4 Kết quả của thử nghiệm xitrat2.1.5.6 Diễn giải kết quả:

Đối chứng trắng Phản ứng âm tính Phản ứng dương tính

Axit sinh ra từ việc

-lên men D-sorbitol

-lên men L-rhamnoza

-lên men D-sucroza

-lên men D-melibioza

-lên men amygdalin

-thủy phân xitrat

+++++

Brilliance™ Enterobacter sakazakii Agar (công thức chuẩn Chromogenic Enterobacter sakazakii Agar) là môi trường sử dụng cho việc phân lập và đếm Enterobacter sakazakii

Cân 43.1g Brilliance Enterobacter sakazakii Agar đổ vào một lít nước cất Lắc đều và

đun sôi đến khi hòa tan hoàn toàn Thanh trùng bằng nồi hấp ở 121°C trong vòng 15 phútlàm nguội đến 50°C Trộn đều và đổ vào đĩa Petri

2.1.3 Mô tả thí nghiệm:

Brilliance Enterobacter sakazakii Agar (DFI formulation1) dựa trên phản ứng α glucosidase , phản ứng này dựa trên sự kết hợp chặt chẽ giữa cơ chất chromogenic 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α -D-glucopyranoside có mặt trong môi trường Enzyme α -

-glucosidase, hiện diện trong Enterobacter sakazakii, cơ chất hydrolyses sinh ra khuẩn lạc

màu xanh trên đĩa môi trường màu vàng xám

Proteus vulgaris cũng có hoạt tính α -glucosidase dương tính yếu và cũng có thể phát

triển để sinh ra những khuẩn lạc có màu tương tự như E sakazakii

Tuy nhiên, trên môi trường này, Proteus spp mọc lên là những khuẩn lạc màu xám: chúng

sản sinh ra hydrogen sulphide trong sự hiện diện của ferric ions hình thành nên ferroussulphide Desoxycholate có tác dụng làm ẩn đi sự phát triển của hầu hết vi sinh vật Gramdương

Phương pháp FDA hiện nay cho phép phát hiện Enterobacter sakazakii dựa trên việc sản sinh ra đốm màu vàng theo nghiên cứu của Muytjens et al.4 Các mẫu được giữ ấmtrong nước qua đêm, sau đó được làm giàu trong môi trường EE broth (CM0317), bướctiếp theo sử dụng môi trường VBRGA (CM0485) để đồng hóa Enterobacteriaceae 5khuẩn lạc được chọn lọc và xếp dãy trên môi trường Tryptone Soya Agar (CM0131), giữ

ấm 3 ngày và quan sát màu vàng của khuẩn lạc, nó đặc trưng cho Enterobacter sakazakii.

(Hình 5).Tuy nhiên , phương pháp này

không cho phép phân lập Enterobacter

sakazakii và việc kết hợp EE broth với

VRBGA có thể cho phép các dòng khác

ngoài Enterobacteria phát triển vượt trội

hơn Enterobacter sakazakii đồng thời

cho kết quả âm tính sai Điều này chứng

tỏ rằng không thể chọn lọc khuẩn lạc

Enterobacter sakazakii từ thạch

VRBGA

Hình 5 Khuẩn lạc của E.sakazakii

2.2 Phương pháp hiện đại(PCR):

- Đối với sản phẩm sữa tiệt trùng, các bình chứa được ủ trực tiếp qua đêm ở 37oC Sau đó10ml mẫu ủ này được chuyển vào canh trường EE và ủ qua đêm ở 37oC và khi mẫu đượcnhân lên ba lần thì được lấy để chiết xuất DNA

2.2.2 Tách chiết DNA:

Tách DNA được thực hiện theo phương pháp sửa đổi của Van Elsas Trước khi chiếtxuất DNA, 2ml mẫu được ly tâm ở mức 5900 x g trong 10 phút Sau khi ly tâm ta loại bỏphần lỏng, lấy phần cặn rồi bỏ thêm các thành phần sau:

+ hạt thủy tinh tiệt trùng (0.6g) (có đường kính 0.2-0.3 mm)

+ 800µl đệm phosphat (1 phần 120 mM NaH2PO4 và 9 phần 120 mM Na2HPO4)

+ 700 µl phenol

+ 100µl sodium dodecyl sulfate (SDS) 20%(m/v)

Sau đó hỗn hợp này được ly tâm trong 2 phút và ủ ở nhiệt độ 60oC trong 20 phút và lặplại bước tiến hành này 2 lần Sau khi ủ, mẫu được ly tâm trong 5 phút ở mức độ 1500 x g.Dịch được thu lại và các protein được tách chiết với 600 μl phenol Tiếp theo ta cho 600

l

µ hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1) cho đến khi kỳ trung gian đượcsạch sẽ DNA được kết tủa bằng 0,1g sodium acetate 3M (NaOAc) (pH 5.5) và 0,6 gisopropanol Các mẫu được lưu giữ trong tủ lạnh trong khoảng 1 giờ và sau đó ly tâmtrong 10 phút ở 15000 x g

2.2.3 Khuếch đại PCR:

2.2.3.1 Thiết kế mồi:

Các cặp mồi Esak2 (5 'CCC GCA TCT CTG CAG TCT GAT C 3') và Esak3 (5 'CTAATA CCG CAT AAC GTC TAC G 3') được phát triển cho khuếch đại đặc trưng của E.sakazakii

2.2.3.2 Phản ứng PCR:

a) Chuẩn bị mẫu phản ứng:

- Phản ứng phát hiện PCR được thực hiện trong tổng thể tích phản ứng 25µl có chứa 1U

(0,35 µl) Taq ADN polymerase, 2,5 µl đệm magie tự do được cung cấp với enzyme, 2

mM (1,5 ml)MgCl2, 1 µl dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 mM (1 µl) dNTPs, 0.5 μM (0,5

ml) mỗi mồi và 750 μg / ml (1 µl) mẫu DNA.

- Đối với mẫu đối chứng dương thì ta lấy 1µlchiết xuất DNA từ môi trường tinh sạch của

E sakazakii và mẫu đối chứng âm thì ta thay thế DNA mẫu bằng 1µl nước cất vô trùng.

b) Cách tiến hành PCR: