Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây Na biển (Annona glabra L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY NA BIỂN (Annona glabra L.) Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 62.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội - 2015 Công trình hoàn thành tại: Viện Hóa sinh biển Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phan Văn Kiệm TS Hoàng Lê Tuấn Anh Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án đuợc bảo vệ truớc Hội đồng chấm luận án cấp Học viện họp tại: vào hồi ngày tháng Có thể tìm hiểu Luận án thư viện……… năm I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Cây na biển (Annona glabra) loại ăn thường trồng để chắn sóng vùng ngập mặn Cây thường dùng để trị tiêu chảy, kiết lỵ làm thuốc sát trùng Vỏ giã có công dụng tương tự Dịch dùng để trừ chấy Hạt nghiền nát làm săn da, sát trùng Thịt có vị mát, giải nhiệt Các nghiên cứu thành phần hóa học công bố giới cho thấy loài chứa nhiều lớp chất quý có cấu trúc độc đáo, đặc biệt lớp chất diterpenoid ent-kaurane acetogenin Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy số hợp chất phân lập từ loài thể hoạt tính sinh học đáng quan tâm như: hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư, tác dụng kháng viêm, giảm đau Tuy nhiên, có công trình khoa học nước công bố thành phần hóa học hoạt tính sinh học thuốc quý Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học hoạt tính sinh học na biển (Annona glabra L), lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Na biển (Annona glabra L.)" Đối tượng nghiên cứu nội dung luận án Đối tượng nghiên cứu luận án loài na biển Annona glabra Nội dung luận án: Phân lập hợp chất từ loài na biển (A glabra) phương pháp sắc ký; Xác định cấu trúc hoá học hợp chất phân lập phương pháp vật lý hóa học; Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập được; Đánh giá hoạt tính kháng viêm hợp chất phân lập Những đóng góp luận án 3.1 Từ loài na biển (A glabra) phân lập được: 3.1.1 hợp chất là: 7β,16α,17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (1), 7β,17-dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester (2), 7β,17-dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester (3), 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-D-glucopyranoside ester (4), (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-D-glucopyranoside (13); 3.1.2 hợp chất lần đầu phân lập từ chi Annona là: paniculoside IV (5), (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid 3′-O-β-D-glucopyranoside (14), cucumegastigmane I (15), icariside B1 (17), icariside D2 (18), icariside D2 6′-O-βD-xylopyranoside (19), 3,4-dimethoxyphenyl 1-O-β-D-glucopyranoside (20); 3.1.3 hợp chất lần đầu phân lập từ loài A glabra là: 16α,17-dihydroxy-entkaurane (6) 3,4-dihydroxybenzoic acid (21) 3.2 Lần thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro dòng tế bào ung thư LU-1, MCF-7, SK-Mel2, HL-60 KB 22 hợp chất phân lập từ loài na biển (A glabra) Kết cho thấy, hợp chất 3, 4, 6, 14, 15 thể khả gây độc 4/5 dòng tế bào ung thư thử nghiệm (ngoại trừ dòng HL-60) Trong đó, ba hợp chất khung ent-kaurane 3, thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 khoảng 0,65 ÷7,39 µM Hợp chất megastigmane 14 15 thể khả gây độc tế bào với giá trị IC50 khoảng 2,79 ÷11,17 µM Phenolic 18 acetogenin 22 (squamocin M) thể hoạt tính dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 khoảng 6,30 ÷10,61 µM độc tính dòng tế bào thường HEL-299 3.3 Lần chế gây chết tế bào ung thư HL-60 cấp độ protein hợp chất 18 22 nghiên cứu Kết hợp chất 18 22 kích thích trình tế bào chết theo chương trình (appotosis) 3.4 Lần đánh giá hoạt tính kháng viêm thông qua việc ức chế sản sinh NO điều kiện đại thực bào 19 hợp chất phân lập từ loài na biển (A glabra) Kết cho thấy hợp chất phân lập từ loài na biển (A glabra) thể hoạt tính ức chế sản sinh NO điều kiện đại thực bào hợp chất 1, 3, (16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al), 12 (19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acid), 13 ức chế sản sinh NO mạnh chất đối chứng dexamethasone, với giá trị IC50 khoảng 0,01 ÷ 0,42 µM Bố cục luận án Luận án gồm 138 trang với 26 bảng số liệu, 62 hình, 147 tài liệu tham khảo Bố cục luận án: Mở đầu (2 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (35 trang), Chương 2: Ðối tượng phương pháp nghiên cứu (7 trang), Chương 3: Thực nghiệm (9 trang), Chương 4: Kết thảo luận (64 trang), Kết luận Kiến nghị (3 trang), Các công trình công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (17 trang) Phụ lục phổ II NỘI DUNG LUẬN ÁN ÐẶT VẤN ÐỀ: Phần đặt vấn đề nêu ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối tuợng, mục tiêu nhiệm vụ nghiên cứu luận án CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần tổng quan tài liệu trình bày nghiên cứu nuớc quốc tế vấn đề: 1.1 Giới thiệu chi Na (Annona) 1.2 Giới thiệu loài na biển (Annona glabra) CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu thực vật Mẫu lá, loài na biển (Annona glabra) thu hái vào tháng năm 2013 Thành phố Hồ Chí Minh 2.2 Phương pháp phân lập hợp chất Phối hợp phương pháp sắc ký bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng điều chế sắc ký cột (CC) 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Sử dụng kết hợp xác định thông số vật lý phương pháp phổ đại đồng thời kết hợp phân tích, tra cứu tài liệu tham khảo Các thiết bị phương pháp sử dụng gồm: đo điểm nóng chảy (Mp), độ quay cực ([α]D), phổ khối lượng (ESIMS, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ nhân (1D, 2D-NMR), phổ lưỡng sắc tròn (CD) phương pháp hóa học 2.4 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 2.4.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào Hoạt tính gây độc tế bào hoạt chất đuợc xác định theo phương pháp MTT 2.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm Hoạt tính kháng viêm hợp chất đuợc đánh giá dựa khả ức chế sản sinh NO điều kiện đại thực bào RAW 264.7 kích thích với LPS CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Phân lập hợp chất từ na biển Phần trình bày cụ thể cách thức phân lập hợp từ na biển A glabra Việc phân tách chất đuợc nêu tóm tắt sơ đồ hình 3.1, 3.2, 3.3 Hình 3.1 Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu na biển (A glabra) Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cặn chiết dichloromethane Hình 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cặn chiết nước 3.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất 3.2.1 Hợp chất 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (mới) Chất bột vô định hình, màu trắng Độ quay cực [α ]D : –64,9 (c 0,1, MeOH) 25 Nhiệt độ nóng chảy: 298-299oC H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 0,93 (1H, m, Ha-1), 1,87 (1H, m, Hb-1), 1,44 (1H, m, Ha-2), 1,96 (1H, m, Hb-2), 1,08 (1H, dd, J = 4,5 Hz, 13,5 Hz, Ha-3), 2,17 (1H, d, J = 13,5 Hz, Hb-3), 1,17 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5), 1,98 (1H, m, Ha-6), 2,11 (1H, m, Hb-6), 3,63 (1H, br s, H-7), 1,43 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-9), 1,57 (1H, m, Ha11), 1,64 (1H, m, Hb-11), 1,57 (1H, m, Ha-12), 1,68 (1H, m, Hb-12), 2,08 (1H, m, H-13), 1,70 (1H, dd, J = 4,0 Hz, 12,0 Hz, Ha-14), 1,83 (1H, d, J = 12,0 Hz, Hb-14), 1,56 (1H, d, J = 13,5 Hz, Ha-15), 1,74 (1H, d, J = 13,5 Hz, Hb-15), 3,62 (1H, d, J = 11,5 Hz, Ha-17), 3,72 (1H, d, J = 11,5 Hz, Hb-17), 1,18 (3H, s, H-18), 1,00 (3H, s, H-20) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 41,71 (C-1), 20,29 (C-2), 34,23 (C-3), 44,25 (C4), 48,09 (C-5), 30,48 (C-6), 78,05 (C-7), 49,00 (C-8), 51,08 (C-9), 40,44 (C-10), 19,11 (C-11), 27,64 (C-12), 46,09 (C-13), 37,50 (C-14), 50,13 (C-15), 82,86 (C16), 66,71 (C-17), 29,27 (C-18), 182,00 (C-19), 16,14 (C-20) HR-ESI-MS: m/z 375,2159 [M+Na]+ Tính toán lý thuyết [C20H32O5Na]+: 375,2142 Công thức phân tử C20H32O5, M = 352 3.2.2 Hợp chất 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) Chất bột vô định hình, màu trắng Độ quay cực [α ]D : –40,7 (c 0,1, MeOH); 25 Nhiệt độ nóng chảy: 185-186oC H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 0,94 (1H, m, Ha-1), 1,88 (1H, m, Hb-1), 1,45 (1H, m, Ha-2), 1,94 (1H, m, Hb-2), 1,13 (1H, m, Ha-3), 2,22 (1H, m, Hb-3), 1,78 (1H, d, J = 13,0 Hz, H-5), 1,97 (1H, m, Ha-6), 2,18 (1H, dd, J = 13,0 Hz, 14,5 Hz, Hb-6), 3,50 (1H, br s, H-7), 1,43 (1H, m, H-9), 1,57 (1H, m, Ha-11), 1,63 (1H, m, Hb-11), 1,43 (1H, m, Ha-12), 1,63 (1H, m, Hb-12), 2,11 (1H, m, H-13), 1,08 (1H, m, Ha-14), 1,80 (1H, d, J = 11,5 Hz, Hb-14), 1,12 (1H, m, Ha-15), 1,71 (1H, dd, J = 3,5 Hz, 10,0 Hz, Hb-15), 1,94 (1H, m, H-16), 3,35 (2H, m, H-17), 1,22 (3H, s, H-18), 0,99 (3H, s, H-20), 5,42 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′), 3,38 (1H, m, H-2′), 3,45 (1H, m, H-3′), 3,39 (1H, m, H-4′), 3,39 (1H, H-5′), 3,71 (1H, dd, J = 4,0 Hz, 11,5 Hz, Ha6′), 3,86 (1H, d, J = 11,5 Hz, Hb-6′) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 41,77 (C-1), 20,20 (C-2), 39,09 (C-3), 44,69 (C4), 49,05 (C-5), 30,68 (C-6), 78,70 (C-7), 49,80 (C-8), 50,62 (C-9), 40,47 (C-10), 19,51 (C-11), 32,93 (C-12), 39,46 (C-13), 37,17 (C-14), 42,58 (C-15), 44,66 (C16), 67,66 (C-17), 28,82 (C-18), 178,67 (C-19), 16,28 (C-20), 95,66 (C-1′), 74,07 (C-2′), 78,67 (C-3′), 71,14 (C-4′), 78,56 (C-5′) 62,42 (C-6′) HR-ESI-MS: m/z 521,2732 [M+Na]+ Tính toán lý thuyết [C26H42O9Na]+: 521,2721 Công thức phân tử C26H42O9, M = 498 3.2.3 Hợp chất 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) Chất bột vô định hình, màu trắng Độ quay cực [α ]D : –38,5 (c 0,1, MeOH) 25 Nhiệt độ nóng chảy: 280-281oC H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 1,03 (1H, dd, J = 3,5 Hz, 13,5 Hz, Ha-1), 1,87 (1H, d, J = 13,5 Hz, Hb-1), 1,44 (1H, dt, J = 5,0 Hz, 10,0 Hz, Ha-2), 1,96 (1H, m, Hb-2), 1,12 (1H, dd, J = 4,0 Hz, 13,5 Hz, Ha-3), 2,22 (1H, m, Hb-3), 1,78 (1H, m, H-5), 1,96 (1H, m, Ha-6), 2,23 (1H, m, Hb-6), 3,59 (1H, br s, H-7), 1,39 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-9), 1,58 (1H, m, Ha-11), 1,64 (1H, m, Hb-11), 1,52 (2H, m, H-12), 2,57 (1H, m, H-13), 1,42 (1H, dd, J = 7,5 Hz, 10,5 Hz, Ha-14), 2,06 (1H, d, J = 10,5 Hz, Hb-14), 5,81 (1H, s, H-15), 4,13 (2H, d, J = 1,0 Hz, H-17), 1,22 (3H, s, H-18), 1,02 (3H, s, H-20), 5,42 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 3,38 (1H, m, H-2′), 3,42 (1H, m, H-3′), 3,40 (1H, m, H-4′), 3,39 (1H, H-5′), 3,71 (1H, dd, J = 4,0 Hz, 12,0 Hz, Ha-6′), 3,85 (1H, dd, J = 2,0 Hz, 12,0 Hz, Hb-6′) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 41,72 (C-1), 20,17 (C-2), 39,10 (C-3), 44,71 (C4), 48,30 (C-5), 29,28 (C-6), 75,62 (C-7), 54,25 (C-8), 43,56 (C-9), 40,88 (C-10), 19,65 (C-11), 26,33 (C-12), 42,19 (C-13), 43,51 (C-14), 132,13 (C-15), 148,11 (C16), 61,21 (C-17), 28,79 (C-18), 178,58 (C-19), 16,10 (C-20), 96,64 (C-1′), 74,06 (C-2′), 78,70 (C-3′), 71,13 (C-4′), 78,69 (C-5′) 62,41 (C-6′) HR-ESI-MS: m/z 519,2550 [M+Na]+ Tính toán lý thuyết [C26H40O9Na]+: 519,2565 Công thức phân tử C26H40O9, M = 496 3.2.4 Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) Chất bột, màu trắng Độ quay cực [α ]D : – 40 (c 0,1, MeOH) 25 Nhiệt độ nóng chảy: 191-192oC H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 0,87 (1H, m, Ha-1), 1,88 (1H, m, Hb-1), 1,52 (1H, m, Ha-2), 1,69 (1H, m, Hb-2), 1,11 (1H, m, Ha-3), 1,21 (1H, d, J = 14,0 Hz, Hb-3), 1,15 (1H, m, H-5), 1,88 (1H, m, Ha-6), 2,00 (1H, m, Hb-6), 1,57 (1H, m, Ha7), 1,96 (1H, m, Hb-7), 1,08 (1H, m, H-9), 1,43 (1H, m, Ha-11), 1,94 (1H, m, Hb11), 1,47 (1H, m, Ha-12), 1,71 (1H, m, Hb-12), 2,55 (1H, m, H-13), 1,17 (1H, m, Ha-14), 2,16 (1H, d, J = 12,0 Hz, Hb-14), 1,59 (1H, m, Ha-15), 1,97 (1H, m, Hb-15), 3,06 (1H, m, H-16), 1,24 (3H, s, H-18), 0,97 (3H, s, H-20), 5,53 (1H, d, J = 8,0 Hz, H1′), 3,35 (1H, m, H-2′), 3,48 (1H, m, H-3′), 3,42 (1H, m, H-4′), 3,40 (1H, H-5′), 3,71 (1H, dd, J = 2,0 Hz, 11,5 Hz, Ha-6′), 3,84 (1H, d, 11,5 Hz, Hb-6′) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 41,44 (C-1), 19,15 (C-2), 39,04 (C-3), 45,11 (C4), 58,61 (C-5), 23,19 (C-6), 42,91 (C-7), 45,62 (C-8), 57,59 (C-9), 40,83 (C-10), 20,14 (C-11), 28,05 (C-12), 41,09 (C-13), 41,87 (C-14), 42,69 (C-15), 46,62 (C16), 175,32 (C-17), 29,04 (C-18), 178,43 (C-19), 16,36 (C-20), 95,61 (C-1′), 74,04 (C-2′), 78,68 (C-3′), 71,11 (C-4′), 78,68 (C-5′) 62,40 (C-6′), 95,61 (C-1′′), 74,04 (C-2′′), 78,68 (C-3′′), 71,11 (C-4′′), 78,68 (C-5′′) 62,34 (C-6′′) HR-ESI-MS: m/z 681,3095 Tính toán lý thuyết cho công thức [C32H50O14Na]+: 681,3093 Công thức phân tử C32H50O14, M = 658 3.2.5 Hợp chất 5: Paniculoside IV Chất bột, màu trắng Độ quay cực [α ]D : +56 (c 0,1, MeOH) 31 Nhiệt độ nóng chảy: 192-193oC H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 0,91 (1H, m, Ha-1), 1,88 (1H, m, Hb-1), 1,62 (2H, m, H-2), 1,12 (1H, m, Ha-3), 2,21 (1H, m, Hb-3), 1,10 (1H, dd, J = 2,0 Hz, 12,0 Hz, H-5), 1,87 (1H, m, Ha-6), 2,01 (1H, m, Hb-6), 1,52 (1H, m, Ha-7), 1,68 (1H, m, Hb-7), 1,03 (1H, m, H-9), 1,42 (1H, m, Ha-11), 1,97 (1H, m, Hb-11), 1,50 (1H, m, Ha-12), 1,61 (1H, m, Hb-12), 2,01 (1H, br s, H-13), 1,72 (1H, m, Ha-14), 2,02 (1H, m, Hb-14), 1,42 (1H, m, Ha-15), 1,58 (1H, m, Hb-15), 3,62 (1H, m, Ha17), 3,71 (1H, m, Hb-17), 1,23 (3H, s, H-18), 0,99 (3H, s, H-20), 5,43 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′), 3,40 (1H, m, H-2′), 3,42 (1H, m, H-3′), 3,90 (1H, m, H-4′), 3,43 (1H, H5′), 3,71 (1H, dd, J = 6,0 Hz, 11,5 Hz, Ha-6′), 3,85 (1H, dd, J = 2,5 Hz, 11,5 Hz, Hb-6′) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 41,80 (C-1), 19,62 (C-2), 39,05 (C-3), 45,10 (C4), 58,53 (C-5), 23,16 (C-6), 43,32 (C-7), 45,77 (C-8), 57,32 (C-9), 40,88 (C-10), 20,10 (C-11), 27,16 (C-12), 46,20 (C-13), 38,07 (C-14), 53,69 (C-15), 82,99 (C16), 66,87 (C-17), 29,02 (C-18), 178,38 (C-19), 16,35 (C-20), 95,60 (C-1′), 74,03 (C-2′), 78,67 (C-3′), 71,11 (C-4′), 78,67 (C-5′) 62,41 (C-6′) Công thức phân tử C26H42O9, M = 498 3.2.6 Hợp chất 6: 16α,17-Dihydroxy-ent-kaurane Tinh thể hình kim, không màu Độ quay cực [α ]D : -25 (c 0,1, CHCl3) 31 Nhiệt độ nóng chảy: 153-154oC H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH 0,77 (1H, dd, J = 2,0 Hz, 12,0 Hz, H-5), 1,12 (1H, dt, J = 4,5 Hz, 14,0 Hz, , H-9), 1,59 (2H, br d, H-14), 1,43 (2H, m, H-15), 3,65 (1H, d, J = 11,0 Hz, Ha-17), 3,77 (1H, d, J = 11,0 Hz, Hb-17), 0,84 (3H, s, H18), 0,80 (3H, s, H-18) 1,01 (3H, s, H-18) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC 42,02 (C-1), 18,28 (C-2), 42,06 (C-3), 33,26 (C4), 56,17 (C-5), 20,45 (C-6), 37,31 (C-7), 44,75 (C-8), 56,72 (C-9), 39,38 (C-10), 18,59 (C-11), 26,32 (C-12), 45,51 (C-13), 40,33 (C-14), 53,39 (C-15), 81,89 (C16), 66,38 (C-17), 33,56 (C-18), 21,55 (C-19) 17,72 (C-20) Công thức phân tử C20H34O2, M = 306 3.2.7 Hợp chất 7: 16β,17-Dihydroxy-ent-kaurane Tinh thể hình kim, không màu Độ quay cực [α ]D : -32 (c 0,1, CHCl3) 31 Nhiệt độ nóng chảy: 151-152oC H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH 0,76 (1H, m, Ha-1), 1,82 (1H, d, J = 12,0 Hz, Hb1), 1,41 (1H, overlep, Ha-2), 1,63 (1H, m, Hb-2), 1,12 (1H, m, Ha-3), 1,46 (1H, m, Hb-3), 0,77 (1H, m, H-5), 1,25 (1H, m, Ha-6), 1,51 (1H, m, Hb-6), 1,37 (2H, m, H7), 1,12 (1H, H-9), 1,63 (1H, m, Ha-11), 1,87 (1H, m, Hb-11), 1,55 (1H, m, Ha-12), 1,75 (1H, m, Hb-12), 2,07 (1H, m, H-13), 0,99 (1H, br d, J = 12,0 Hz, Ha-14), 1,99 (1H, br d, J = 12,0 Hz, Hb-14), 1,38 (1H, m, Ha-15), 1,42 (1H, m, Hb-15), 3,38 (1H, d, J = 11,0 Hz, Ha-17), 3,46 (1H, d, J = 11,0 Hz, Ha-17), 0,84 (3H, s, H-18), 0,79 (3H, s, H-19) 1,02 (3H, s, H-20) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC 40,45 (C-1), 18,82 (C-2), 42,10 (C-3), 33,27 (C4), 56,21 (C-5), 20,05 (C-6), 41,93 (C-7), 43,58 (C-8), 57,06 (C-9), 39,43 (C-10), 18,64 (C-11), 26,76 (C-12), 40,89 (C-13), 38,32 (C-14), 52,84 (C-15), 79,82 (C16), 69,90 (C-17), 33,60 (C-18), 21,60 (C-19) 17,57 (C-20) ESI-MS: m/z 329,2 [M+Na]+ Công thức phân tử C20H34O2, M = 306 3.2.8 Hợp chất 8: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al Tinh thể hình kim, không màu Độ quay cực [α ]D : – 45 (c 0,1, CHCl3) 31 Nhiệt độ nóng chảy: 186-187oC H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH 0,88 (1H, m, Ha-1), 1,90 (1H, m, Hb-1), 1,44 (1H, m, Ha-2), 2,07 (1H, m, Hb-2), 1,06 (1H, m, Ha-3), 2,12 (1H, m, Hb-3), 1,23 (1H, dd, J = 2,5 Hz; 12,5 Hz, H-5), 1,59 (H, m, Ha-6), 1,63 (1H, m, Hb-6), 1,52 (2H, m, H7), 1,16 (1H, m, H-9), 1,72 (1H, m, Ha-11), 1,89 (1H, m, Hb-11), 1,49 (1H, m, Ha12), 1,84 (1H, m, Hb-12), 2,08 (1H, H-13), 1,13 (1H, m, Ha-14), 2,00 (1H, dd, J = 2,0 Hz; 12,0 Hz, Hb-14), 1,45 (2H, m, H-15), 3,32 (1H, d, J = 11,5 Hz, Ha-17), 3,43 (1H, d, J = 11,5 Hz, Hb-17), 1,00 (3H, s, H-18), 9,75 (1H, d, J =1,5 Hz, H-19) 0,93 (3H, s, H-20) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC 41,02 (C-1), 19,47 (C-2), 35,28 (C-3), 49,84 (C4), 57,90 (C-5), 20,71 (C-6), 43,08 (C-7), 44,69 (C-8), 57,19 (C-9), 40,65 (C-10), 19,82 (C-11), 27,77 (C-12), 42,20 (C-13), 39,41 (C-14), 53,09 (C-15), 80,74 (C16), 70,61 (C-17), 24,57 (C-18), 207,87 (C-19) 16,85 (C-20) 11 Chất bột, màu trắng Độ quay cực [α ]25D : −25,0 (c 0,1, MeOH) Nhiệt độ nóng chảy: 229-230oC CD (c = 1,5 ×10-5, MeOH), [θ] (λmax, nm) –52481 (237) H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 5,86 (1H, s, H-2), 8,05 (1H, d, J = 16,0 Hz, H4), 6,62 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-5), 2,14 (3H, s, H-6), 1,82 (1H, m, Ha-2′), 2,02 (1H, m, Hb-2′), 4,28 (1H, m, H-3′), 1,82 (1H, m, Ha-4′), 2,21 (1H, m, Hb-4′), 3,78 (1H, d, J = 7,0 Hz, Ha-7′), 3,83 (1H, d, J = 7,0 Hz, Ha-7′), 0,96 (3H, s, H-8′), 1,19 (3H, s, H-9′), 5,54 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′′), 3,17 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-2′′), 3,30 (2H, m, H-3′′, H-4′′), 3,42 (1H, m, H-5′′), 3,70 (1H, m, Ha-6′′), 3,87 (1H, m, Hb-6′′), 4,38 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′′′), 3,40 (1H, m, H-2′′′), 3,46 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-3′′′), 3,39 (2H, m, H-4′′′, H-5′′′), 3,70 (1H, m, Ha-6′′) 3,87 (1H, m, Hb-6′′) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 166,00 (C-1), 117,78 (C-2), 154,00 (C-3), 131,78 (C-4), 136,43 (C-5), 21,32 (C-6), 48,83 (C-1′), 42,86 (C-2′), 73,99 (C-3′), 42,83 (C-4′), 87,63 (C-5′), 83,25 (C-6′), 77,13 (C-7′), 16,34 (C-8′), 19,72 (C-9′), 95,44 (C-1′′), 73,86 (C-2′′), 78,04 (C-3′′), 71,66 (C-4′′), 78,79 (C-5′′), 62,76 (C-6′′), 103,04 (C-1′′′), 73,99 (C-2′′′), 77,96 (C-3′′′), 71,14 (C-4′′′), 78,08 (C-5′′′), 62,37 (C-6′′′) HR-ESI-MS: m/z 629,2431[M+Na]+ Tính toán lý thuyết: [C27H42O15Na]+ 629,2416 Công thức phân tử C27H42O15, M = 606 3.2.14 Hợp chất 14: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 3′-O-β-Dglucopyranoside Chất bột, màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 199-200oC Độ quay cực [α ]31D : -110 (c 1,0, MeOH) H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 5,85 (1H, s, H-2), 7,78 (1H, d, J = 16,0 Hz, H4), 6,31 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-5), 2,17 (3H, s, H-6), 1,96 (2H, m,H-2′), 4,28 (1H, m, H-3′) 1,19 (1H, m, Ha-4′), 2,17 (1H, m, Hb-4′), 3,76 (1H, d, J = 7,5 Hz, Ha-7′), 3,82 (1H, dd, J = 2,0, 7,5 Hz, Ha-7′), 0,95 (3H, s, H-8′),1,18 (3H, s, H-9′), 4,37 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′′), 3,16 (1H, dd, J = 8,0, 9,0 Hz, H-2′′), 3,30 (1H, m, H-3′′), 3,29 (1H, m, H-4′′), 3,39 (1H, m, H-5′′), 3,29 (1H, dd, J = 2,0, 12,0 Hz, Ha-6′′) 3,90 (1H, dd, J = 5,0, 12,0 Hz, Hb-6′′) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 174,50 (C-1), 126,76 (C-2), 142,57 (C-3), 132,95 (C-4), 130,98 (C-5), 20,62 (C-6), 49,85 (C-1′), 42,89 (C-2′), 74,09 (C-3′), 12 42,83 (C-4′), 87,63 (C-5′), 83,16 (C-6′), 77,19 (C-7′), 16,34 (C-8′), 19,74 (C-9′), 103,16 (C-1′′), 75,13 (C-2′′), 78,09 (C-3′′), 71,69 (C-4′′), 77,94 (C-5′′) 62,79 (C-6′′) Công thức phân tử C21H32O10, M = 444 3.2.15 Hợp chất 15: Cucumegastigmane I Dạng dầu màu vàng nhạt Độ quay cực [α ]D : + 35 (c 0,1, MeOH) 31 H-NMR (500MHz, MeOD): δH 2,18 (1H, d, J = 17,0 Hz, Ha-2), 2,53 (1H, d, J = 17,0 Hz, Hb-2), 5,90 (1H, s, H-4), 5,92 (d, J = 16,0 Hz, H-7), 5,81 (1H, dd, J = 5,5 Hz; 16,0 Hz, H-8), 4,22 (1H, m, H-9), 3,53 (1H, dd, J = 5,5 Hz; 11,0 Hz, Ha-10), 3,48 (1H, dd, J = 7,0 Hz, 11,0 Hz, Hb-10), 1,06 (3H, s, H-11), 1,04 (3H, s, H-12) 1,94 (3H, d, J = 1,0 Hz, H-13) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 42,38 (C-1), 50,72 (C-2), 201,25 (C-3), 127,16 (C-4), 167,30 (C-5), 80,13 (C-6), 132,54 (C-7), 132,43 (C-8), 73,62 (C-9), 67,28 (C-10), 23,43 (C-11), 24,50 (C-12) 19,56 (C-13) Công thức phân tử C13H20O4, M = 240 3.2.16 Hợp chất 16: Blumenol A Chất bột, màu trắng Độ quay cực [α ]D : +25 (c 0,3, CHCl3) 31 Nhiệt độ nóng chảy: 112-113oC H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH 2,22 (1H, d, J = 17,0 Hz, Ha-2), 2,43 (1H, d, J = 17,0 Hz, Hb-2), 5,91 (1H, br s, H-4), 5,77 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7), 5,86 (1H, dd, J = 5,0, 16,0 Hz, H-8), 4,41 (1H, m, H-9), 1,30 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-10), 1,02 (3H, s, H-11), 1,08 (3H, s, H-12) 1,90 (3H, s, H-13) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC 41,16 (C-1), 49,70 (C-2), 198,06 (C-3), 126,88 (C-4), 162,60 (C-5), 79,04 (C-6), 135,74 (C-7), 129,02 (C-8), 68,02 (C-9), 23,74 (C-10), 22,90 (C-11), 24,03 (C-12) 18,89 (C-13) Công thức phân tử C13H20O3, M = 224 3.2.17 Hợp chất 17: Icariside B1 Chất bột, màu trắng Độ quay cực [α ]D : -42 (c 0,05, MeOH) 31 Nhiệt độ nóng chảy: 183-184oC H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 1,50 (1H, dd, J = 4,0 Hz, 12,0 Hz, Ha-2), 2,11 (d, J = 12,0 Hz, Hb-2), 4,37 (1H, tt, J = 4,0 Hz, 12,0 Hz, H-3), 1,47 (1H, dd, J = 4,0 Hz, 12,0 Hz, Ha-4), 2,39 (1H, d, J = 12,0 Hz, Hb-4), 5,86 (1H, s, H-8), 2,21 (3H, s, 13 H-10), 1,18 (3H, s, H-11), 1,41 (3H, s, H-12), 1,42 (3H, s, H-13), 4,46 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 3,18 (1H, dd, J = 7,5 Hz, 9,0 Hz, H-2′), 3,36 (2H, m, H-3′, H-4′), 3,40 (1H, m, H-5′), 3,71 (1H, dd, J = 5,0 Hz, 12,0 Hz, Ha-6′) 3,90 (1H, d, J = 12,0 Hz, Hb-6′) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 36,99 (C-1), 48,11 (C-2), 72,57 (C-3), 46,61 (C4), 72,37 (C-5), 120,08 (C-6), 211,48 (C-7), 101,15 (C-8), 200,86 (C-9), 26,53 (C10), 32,24 (C-11), 29,40 (C-12), 30,79 (C-13), 102,66 (C-1′), 75,07 (C-2′), 78,11 (C-3′), 71,63 (C-4′), 77,87 (C-5′) 62,72 (C-6′) Công thức phân tử C19H30O8, M = 386 3.2.18 Hợp chất 18: Icariside D2 Chất bột, màu trắng Độ quay cực [α ]D : -52 (c 0,1, MeOH) 31 Nhiệt độ nóng chảy: 151-152oC H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 7,16 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2, H-6), 7,04 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3, H-5), 2,78 (2H, t, J = 7,5Hz, H-7), 3,73 (2H, m, H-8), 4,88 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 3,46 (3H, m, H-2′, H-3′, H-5′), 3,43 (1H, m, H-4′), 3,72 (1H, dd, J = 5,0, 12,0 Hz, Ha-6′), 3,89 (1H, dd, J = 2,0, 12,0 Hz, Hb-6′), 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 134,29 (C-1), 130,85 (C-2), 117,82 (C-3), 157,64 (C-4), 117,82 (C-5), 130,85 (C-6), 39,41 (C-7), 64,36 (C-8), 102,56 (C-1′), 74,95 (C-2′), 78,11 (C-3′), 71,42 (C-4′), 78,02 (C-5′) 62,54 (C-6′) Công thức phân tử C14H20O7, M = 300 3.2.19 Hợp chất 19: Icariside D2 6′-O-β-D-xylopyranoside Chất bột, màu trắng Độ quay cực [α ]D : -32 (c 0,05, MeOH) 31 Nhiệt độ nóng chảy: 178-179oC H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 7,08 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2, H-6), 7,18 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3, H-5), 2,79 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-7), 3,74 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-8), 4,88 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 4,36 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′′) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 134,33 (C-1), 130,96 (C-2), 117,81 (C-3), 157,45 (C-4), 39,36 (C-7), 64,32 (C-8), 102,32 (C-1′), 74,93` (C-2′), 77,84 (C-3′), 71,44 (C-4′), 77,34 (C-5′), 69,67 (C-6′), 105,23 (C-1′′), 74,88 (C-2′′), 77,56 (C-3′′), 71,44 (C-4′′), 66,81 (C-5′′) Công thức phân tử C18H26O11, M = 418 3.2.20 Hợp chất 20: 3,4-Dimethoxyphenyl 1-O-β-D-glucopyranoside Chất bột, màu trắng 14 Độ quay cực [α ]D : -26 (c 0,4, MeOH) 31 Nhiệt độ nóng chảy: 195-196oC H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 6,84 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 6,87 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5), 6,68 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-6), 3,80 (3H, s, 3-OCH3), 3,83 (3H, s, 4-OCH3), 4,80 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 3,69 (1H, dd, J = 5,0, 12,5 Hz, Ha-6′), 3,92 (1H, dd, J = 2,5, 12,5 Hz, Hb-6′) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 153,96 (C-1), 104,13 (C-2), 146,06 (C-3), 151,16 (C-4), 113,99 (C-5), 109,36 (C-6), 57,16 (3-OCH3), 56,62 (4-OCH3), 103,47 (C-1′), 74,98 (C-2′), 78,05 (C-3′), 71,57 (C-4′), 78,22 (C-5′) 62,64 (C-6′) Công thức phân tử C14H20O8, M = 316 3.2.21 Hợp chất 21: 3,4-Dihydroxybenzoic acid Chất bột, màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 190-191oC H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 7,45 (1H, s, H-2), 6,82 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5), 7,44 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 123,84 (C-1), 117,76 (C-2), 145,99 (C-3), 151,33 (C-4), 115,73 (C-5), 123,84 (C-6), 170,51 (COOH) Công thức phân tử C7H6O4, M = 154 3.2.22 Hợp chất 22: Squamocin M Dạng sáp, màu trắng H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH 3,39 (2H, m, H-15, H-24), 3,86 (4H, m, H-16, H19, H-20, H-23), 0,87 (t, J = 6,5 Hz, H-34), 6,98 (br s, H-35), 4,99 (q, J = 6,5 Hz, H-36), 1,40 (d, J = 7,0 Hz, H-37) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC 173,86 (C-1), 134,34 (C-2), 74,05 (C-15), 83,14 (C-16), 81,76 (C-19), 81,76 (C-20), 83,14 (C-23), 74,05 (C-24), 14,08 (C-34), 148,83 (C-35), 77,37 (C-36) 19,20 (C-37) Công thức phân tử C37H66O6, M = 606 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định cấu trúc hợp chất Phần trình bày chi tiết kết phân tích phổ xác định cấu trúc 22 hợp chất phân lập từ loài na biển, có hợp chất 17 hợp chất biết * Cấu trúc hóa học tên gọi 22 hợp chất phân lập từ loài na biển (A glabra) trình bày hình 4.60 bảng 4.23 đây: 15 H H OH OH OH H H OH H COOH H COOGlc 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-entkauran-19-oic acid H OH 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester H OH O OGlc H OH H COOGlc H COOGlc 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester H 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-D-glucopyranoside ester H OH OH OH OH H H H H R R 5: R = COOGlc Paniculoside IV 6: R = CH3 16α,17-Dihydroxy-ent-kaurane 7: R = CH3 16β,17-Dihydroxy-ent-kaurane 8: R = CHO 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al 9: R = COOH 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid H H COOH COOH H H OH OR 12: 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acid 10: R = H annoglabasin E 11: R = Ac annoglabasin B O COOH OGlc OH OH O GlcO 13: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)Dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-Dglucopyranoside O GlcO 14: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 3′-O-β-D -glucopyranoside 16 OH H OH OH C OH OH O O O GlcO OH 15: Cucumegastigmane I 16: Blumenol A 17: Icariside B1 OH RO O HOHO HO OCH3 GlcO O COOH OH HO OCH3 18: R = H Icariside D2 19: R = Xylopyranosyl Icariside D2 6′-O-β-Dxylopyranoside 20: 3,4-Dimethoxyphenyl 1O-β-D-glucopyranoside 21: 3,4-Dihydroxybenzoic acid 36 24 O O 34 OH 15 OH O O 22: Squamocin M * Dưới trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc hợp chất đại diện, hợp chất lại xác định cấu trúc cách tương tự 4.1.4 Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) H 20 O 10 H HO HO O 18 19 O 1" 3" O 15 O 6' 6" COOH 17 HO H O 16 13 11 HO HO HO 1' OH H 3' COOH 4a OH Hình 4.24 Cấu trúc hóa học hợp chất hợp chất tham khảo Hợp chất phân lập dạng chất bột màu trắng Công thức phân tử hợp chất xác định C32H50O14 xất pic ion phân tử m/z 681,3095 phổ HR-ESI-MS (tính toán lý thuyết cho công thức [C32H50O14Na]+: 681,3093) Phổ 1H-NMR hợp chất xuất tín hiệu nhóm methyl bậc ba δH 0,97 (3H, s) 1,24 (3H, s), gợi ý có mặt cấu trúc khung entkaurane; proton anome δH 5,43 (d, J = 8,0 Hz) 5,53 (d, J = 8,0 Hz), gợi ý có mặt phân tử đường Phổ 13C-NMR DEPT hợp chất xuất tín hiệu 32 nguyên tử cacbon gồm cacbonyl, cacbon bậc bốn, 14 nhóm methine, 11 nhóm methylene nhóm methyl Số liệu phổ 1H- 13C-NMR hợp chất giống với hợp 17 chất 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid (4a) [71], ngoại trừ xuất tín hiệu phân tử đường C-17 C-19 Tương tác HMBC H-18 (δH 1,24) với C-3 (δC 39,0)/C-4 (δC 45,1)/C-5 (δC 58,6)/C-19 (δC 178,4) gợi ý có mặt nhóm methyl cacboxyl C-4; proton H-13 (δH 2,55)/H-15 (δH 1,59 1,97)/H-16 (δH 3,06) với C-17 (δC 175,3) khẳng định nhóm cacboxyl C-16; H-1′ (δH 5,53) với C-17 (δC 175,3) H-1″ (δC 5,43) với C-19 (δC 178,4) khẳng định vị trí phân tử glucopyranosyl C-17 C-19 Tương tác NOESY H-18 (δH 1,24) với H-5 (δH 1,15) tương tác với H-20 (δH 0,97) chứng tỏ nhóm methyl C-4 có cấu hình β Ngoài ra, tương tác NOESY H-16 (δH 3,06) với H-13 (δH 2,55); H-16 (δH 3,06) với Hα-15 (δH 1,59); H-9 (δH 1,08) với Hβ-15 (δH 1,97) khẳng định cấu hình α H-16 Thủy phân hợp chất môi trường axit thu D-glucose [17] Bên cạnh đó, số tương tác J glc H-1′/glc H-2′; glc H-1″/glc H-2″, J = 8,0 Hz cho phép khẳng định proton chiếm vị trí axial Do đó, nhóm hydroxyl liên kết với cacbon anomeric C-1′ C-1′′ có cấu hình β Từ kiện phổ trên, hợp chất xác định 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-D-glucopyranoside ester Hình 4.25 Các tương tác HMBC, COSY NOESY quan trọng hợp chất Bảng 4.4 Số liệu phổ NMR hợp chất hợp chất tham khảo C δC(#) DEPT δC(@) δH(@) 40,0 CH2 41,44 0,87(m)/1,88 (m) 20,3 CH2 19,15 1,52 (m)/1,69 (m) 41,1 CH2 39,04 1,11 (m) 1,21 (d, J = 14,0 Hz) 44,8 C 45,11 58,2 CH 58,61 1,15 (m) 23,5 CH2 23,19 1,88 (m)/2,00 (m) 41,6 CH2 42,91 1,57 (m)/1,96 (m) 45,6 C 45,62 57,8 CH 57,59 1,08 (m) 18 10 40,8 11 19,3 12 28,5 13 40,5 14 43,1 15 42,0 16 46,7 17 178,1 18 29,5 19 180,6 20 16,8 17-O-Glc 1' 2' 3' 4' 5' 6' 19-O-Glc 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' C CH2 CH2 CH CH2 CH2 CH C CH3 C CH3 40,83 20,14 28,05 41,09 41,87 42,69 46,62 175,32 29,04 178,43 16,36 1,43 (m)/1,94 (m) 1,47 (m)/1,71 (m) 2,55 (m) 1,17 (m)/2,16 (d, J = 12,0 Hz) 1,59 (m)/1,97 (m) 3,06 (m) 1,24 (s) 0,97 (s) CH CH CH CH CH CH2 95,61 74,04 78,68 71,11 78,68 62,40 5,53 (d, J = 8,0 Hz) 3,35 (m) 3,48 (m) 3,42 (m) 3,40 (m) 3,71 (dd, J = 2,0 Hz, 11,5 Hz) 3,84 (d, J = 11,5 Hz) CH CH CH CH CH CH2 95,61 74,04 78,68 71,11 78,68 62,34 5,43 (d, J = 8,0 Hz) 3,38 (m) 3,48 (m) 3,42 (m) 3,40 (m) 3,71 (dd, J = 2,0 Hz, 11,5 Hz) 3,84 (d, J = 11,5 Hz) δC 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid (4a) đo CD3OD [71], @ đo CD3OD # Hình 4.26 Phổ HR-ESI-MS hợp chất Hình 4.27 Phổ 1H-NMR hợp chất 19 Hình 4.28 Phổ 13C-NMR hợp chất Hình 4.29 Phổ DEPT hợp chất Hình 4.30 Phổ HSQC hợp chất Hình 4.31 Phổ HMBC hợp chất Hình 4.32 Phổ COSY hợp chất Hình 4.33 Phổ NOESY hợp chất 4.2 Kết thử hoạt tính sinh học 4.2.1 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn Kết cho biết dịch chiết methanol loài na biển (A glabra) thể hoạt tính gây độc tế bào hai dòng tế bào LU-1 KB với giá trị IC50 khoảng 12,57 ± 3,62 ÷ 38,19 ± 1,23 µg/mL So sánh khả ức chế phát triển hai dòng tế bào ung thư LU-1 KB thử nghiệm phân đoạn từ cho thấy phân đoạn từ thể hoạt tính mạnh phân đoạn từ Đồng thời hai phân đoạn dichloromethane nước từ thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 khoảng 1,08 ± 0,14 ÷ 3,70 ± 0,98 Đây sở để lựa chọn cho nghiên cứu thành phần hóa học 20 Bảng 4.24 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào dịch chiết phân đoạn từ loài na biển (A glabra) IC50 (µg/mL) Dịch chiết LU-1 KB Bộ phận na biển Lá Quả Lá Quả 32,43 ± 2,12 14,59 ± 3,16 38,19 ± 1,23 12,57 ± 3,62 Dịch chiết MeOH 25,15 ± 2,70 16,15 ± 1,04 30,35 ± 1,08 13,10 ± 1,23 Phân đoạn n-hexane 9,02 ± 1,34 6,85 ± 0,11 2,21 ± 0,15 1,08 ± 0,14 Phân đoạn dichloromethane > 100 > 100 > 100 > 100 Phân đoạn ethyl acetate > 100 > 100 3,47 ± 0,29 3,70 ± 0,98 Phân đoạn nước 0,34 ± 0,09 0,36 ± 0,08 Ellipticine 4.2.2 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất Trong số 12 hợp chất thuộc khung ent-kaurane từ loài na biển (A glabra), hợp chất 3, thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 khoảng 0,65 ÷7,39 µM dòng tế bào ung thư LU-1, MCF-7, SK-Mel2 KB; hợp chất megastigmane 14 15, phenolic 18 acetogenin 22 thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng tế bào LU-1, MCF-7, SK-Mel2 KB với giá trị IC50 khoảng 2,79 ÷11,17 µM Các hợp chất 1, 2, 5, 7, 19 17 thể hoạt tính gây độc tế bào mức độ trung bình Các hợp chất lại hoạt tính Riêng với dòng tế bào ung thư HL-60 hợp chất 7, 8, 18 22 thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 khoảng 6,94 ÷ 9,38 µM so sánh với mitoxantrone (IC50: 6,8 µM) Cả bốn hợp chất sau đánh giá khả gây độc tế bào dòng tế bào thường HEL-299 Theo kết thu được, có hợp chất 18 22 thể độc tính (% sống sót nồng độ 9,02 8,72 µM tương ứng 93,25 94,69 %) Hai hợp chất sau nghiên cứu sâu khả gây chết hợp chất có theo chế apoptosis hay không? Bảng 4.25 Kết thử hoạt tính hợp chất 1-22 % ss(*) IC50 (µM) Hợp chất LU-1$ MCF-7$ SK-Mel2$ KB$ HL-60# HEL-299# 55,68 62,36 53,66 58,38 55,76 88,47 94,10 61,85 80,80 >100 0,65 4,46 1,79 1,73 58,79 4,06 4,64 3,68 4,42 68,22 67,07 77,97 84,58 80,66 >100 1,70 7,39 6,44 3,69 35,64 25,59 55,46 93,17 23,27 6,94 >100 78,10 >100 >100 75,72 >100 9,38 >100 82,17 21 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Ellipticine Mitoxantrone 74,58 >100 >100 >100 16,72 5,33 2,79 >100 92,67 6,30 80,50 >100 >100 6,75 3,50 >100 >100 >100 >100 37,94 7,28 11,17 >100 80,91 10,07 74,43 >100 >100 10,61 3,73 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 18,96 19,93 5,36 6,71 5,13 5,58 >100 >100 90,05 117,07 8,50 6,63 93,97 >100 >100 >100 >100 >100 9,57 7,93 3,35 4,04 56,54 66,87 32,61 30,17 25,82 >100 >100 >100 >100 9,02 49,09 32,23 64,61 8,72 >100 93,25 >100 94,69 6,8 * % sống sót tế bào thường HEL-299 nồng độ thử IC50, thực Khoa Dược, Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc, $ thực Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam # Hơn nữa, xử lý với hợp chất 18 22, kết cho thấy số lượng tế bào siêu lưỡng bội (hypodiploid cells) giai đoạn G1 tăng lên theo thời gian xử lý Họ protein Bcl-2 chia thành loại: Bcl-2 protein ức chế trình tự chết Bax tiền protein trình tự chết Bax kích thích trình tự chết tế bào thông qua giải phóng Cytochrome c từ ty thể Ngược lại, Bcl-2 ức chế trình giải phóng Cytochrome c Trong trình tự chết, giải phóng cytochrome c dẫn đến cắt (phân giải) Caspase-9, sau phân cắt Caspase-3 PARP Bởi vậy, với mục đích nghiên cứu chế gây nên trình tự chết tế bào, kiểm tra độ biểu protein liên quan tới trình Khi xử lý với chất hợp chất 18 (9,0 µM) 22 (8,7 µM) 24 h 48 h, quan sát thất thay đổi biểu protein liên quan tới trình tự chết tế bào, ví dụ như: tăng cường biểu Bax, giảm độ biểu Bcl-2, phân cắt Caspase PARP Những kết cho thấy hợp chất 18 22 gây nên trình tự chết tế bào thông qua làm thay đổi mức độ biểu protein liên quan tế bào HL-60 Con đường tín hiệu PI3K/AKT điều hòa sống, tăng trưởng trình tự chết tế bào Đặc biệt, AKT dạng hoạt hóa tham gia vào trình sống tăng trưởng tế bào ung thư thông qua protein c-myc C-myc thường biểu 22 mạnh nhiều dạng khối u Nhằm tìm hiểu xem đường tín hiệu nội bào bị ảnh hưởng hợp chất 18 22, phân tích trình photphorin hóa AKT độ biểu c-myc thí nghiệm Western-blot Kết cho thấy, sau xử lý với hợp chất 18 22, trình photphorin hóa AKT bị giảm đi, dẫn tới tế bào tự chết Hơn nữa, mức độ biểu c-myc đồng thời thấp Đây chứng cho thấy tác dụng làm tế bào chết theo trương trình hợp chất 18 22 thông qua giảm mức độ biểu pAKT c-myc 4.2.3 Kết thử hoạt tính kháng viêm hợp chất Ở nồng độ 30 µM, hợp chất 1, 3, 8, 12, 13 gây giảm mạnh sản sinh NO thấp chất đối chứng dexamethasone Kết cho thấy hợp chất gây ức chế sản sinh NO đại thực bào RAW 264.7 điều kiện bị kích thích LPS, giá trị IC50 hợp chất 0,01 µM; hợp chất 1, 8, 12 13 ức chế đáng kể sản sinh NO với giá trị IC50 0,39, 0,32, 0,10 0,42 µM Bảng 4.26 Tác dụng ức chế NO đại thực bào Hợp chất IC50 (µM) Hợp chất IC50 (µM) 10 11 0,39 12 >30 13 0,01 14 3,1 15 17,06 16 6,20 17 0,32 18 12,1 20 >30 22 >30 Dexamethasone 0,10 0,42 14,7 >30 16,3 >30 1,21 1,84 3,21 0,80 KẾT LUẬN Từ na biển (Annona glabra) phân lập xác định cấu trúc hóa học 22 hợp chất bao gồm • hợp chất mới:  hợp chất diterpenoid ent-kaurane: 7β,16α,17-trihydroxy-ent-kauran19-oic acid (1), 7β,17-dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-βD-glucopyranoside ester (2), 7β,17-dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester (3), 16α-hydro-ent-kauran-17,19dioic acid 17,19-di-O-β-D-glucopyranoside ester (4); 23  hợp chất megastigmane: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-D-glucopyranoside (13) • 17 hợp chất biết:  hợp chất diterpenoid ent-kaurane: paniculoside IV (5), 16α,17dihydroxy-ent-kaurane (6), 16β,17-dihydroxy-ent-kaurane (7), 16β,17dihydroxy-ent-kauran-19-al (8), 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (9), annoglabasin E (10), annoglabasin B (11), 19-nor-entkauran-4α-ol-17-oic acid (12);  hợp chất megastigmane: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid 3′-O-β-D-glucopyranoside (14), cucumegastigmane I (15), blumenol A (16), icariside B1 (17);  hợp chất phenolic: icariside D2 (18), icariside D2 6′-O-β-Dxylopyranoside (19), 3,4-dimethoxyphenyl 1-O-β-D-glucopyranoside (20), 3,4-dihydroxybenzoic acid (21);  hợp chất acetogenin: squamocin M (22) • hợp chất lần đầu phân lập từ chi Annona (5, 14, 15, 17-20), hợp chất lần đầu phân lập từ loài A glabra (6, 21); Đã tiến hành sàng lọc đánh giá hoạt tính gây độc tế bào từ dịch chiết methanol, phân đoạn n-hexane, dichoromethane, ethyl acetate nước loài na biển (A glabra) hai dòng tế bào ung thư biểu mô KB ung thư phổi LU-1 Kết cho biết dịch chiết methanol loài na biển (A glabra) thể hoạt tính gây độc tế bào hai dòng tế bào LU-1 KB với giá trị IC50 khoảng 12,57 ± 3,62 ÷ 38,19 ± 1,23 µg/mL Hai phân đoạn dichloromethane nước từ thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 khoảng 1,08 ± 0,14 ÷ 3,70 ± 0,98 Đây sở quan trọng cho nghiên cứu thành phần hóa học Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư LU-1, MCF-7, SK-Mel2 KB 22 hợp chất, hợp chất khung ent-kaurane 3, thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 khoảng 0,65 ÷7,39 µM; hợp chất megastigmane 14 15, phenolic 18 acetogenin 22 thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 khoảng 2,79 ÷11,17 µM dòng tế bào ung thư Hợp chất 18 22 thể hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào ung thư HL-60 với giá trị IC50 9,02 8,72 µM, đồng thời độc tính dòng tế bào thường HEL-299 Nghiên cứu chế gây chết tế bào ung thư hai hợp chất ngày hai hợp chất gây chết theo chương trình 24 Đồng thời nghiên cứu chuyên sâu western blot cấp độ phân tử nghiên cứu với hợp chất 18 22 Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sản sinh NO điều kiện đại thực bào hợp chất Kết phát hợp chất 1, 3, 8, 12, 13 ức chế sản sinh NO mạnh chất đối chứng dexamethasone, với giá trị IC50 khoảng 0,01 ÷ 0,42 µM KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học na biển (A glabra), nhận thấy: Các hợp chất 3, với khung ent-kaurane có hoạt tính ức chế tốt phát triển dòng tế bào ung thư thực nghiệm (LU-1, MCF-7, SK-Mel2 KB) Vì vậy, cần thêm nghiên cứu sâu chế, tác dụng dược lý hợp chất Trong thí nghiệm chúng tôi, hợp chất 1, 3, 12 thể hoạt tính ức chế mạnh (hơn đối chứng dương) sản sinh NO RAW 264.7 kích thích LPS với giá trị IC50 khoảng từ 0,42 - 0,01 µM Kết này, góp phần khẳng định lớp chất diterpene ent-kaurane đóng vai trò định đến tính chất kháng viêm loài thực vật Do vậy, cần nghiên cứu thêm thí nghiệm kháng viêm hợp chất 1, 3, 12 để định hướng cho thực nghiệm in vivo 25 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyen Xuan Nhiem, Nguyen Thi Thu Hien, Bui Huu Tai, Hoang Le Tuan Anh, Dan Thi Thuy Hang, Tran Hong Quang, Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Wonmin Ko, Seungjun Lee, Hyuncheol Oh, Seung Hyun Kim, and Young Ho Kim New ent-kauranes from the fruits of Annona glabra and their inhibitory nitric oxide production in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2015, 25, 254-258 Hoang Le Tuan Anh, Nguyen Thi Thu Hien, Dan Thi Thuy Hang, Tran Minh Ha, Nguyen Xuan Nhiem, Truong Thi Thu Hien, Vu Kim Thu, Do Thi Thao, Chau Van Minh and Phan Van Kiem ent-Kaurane Diterpenes from Annona glabra and Their Cytotoxic Activities Natural Products Communications, 2014, 9, 16811682 Nguyen Thi Thu Hien, Nguyen Xuan Nhiem, Duong Thi Hai Yen, Dan Thi Thuy Hang, Bui Huu Tai, Tran Hong Quang, Hoang Le Tuan Anh, Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Eun-Ji Kim, Seung Hyun Kim, Hee Kyoung Kang, and Young Ho Kim Chemical constituents of the Annona glabra fruit and their cytotoxic activity Pharmaceutical Biology, 2015, 53 (11), 1602-1607 Nguyễn Thị Thu Hiền, Phạm Hải Yến, Dương Thị Dung, Đan Thị Thúy Hằng, Nguyễn Xuân Nhiệm, Trần Minh Đức, Ninh Khắc Bản, Hoàng Lê Tuấn Anh, Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm Các hợp chất đitecpenoit phân lập từ Na biển Annona glabra (Phần 1).Tạp chí Hóa học, 2015, 53 (3), 392-395 Nguyễn Thị Thu Hiền, Đan Thị Thúy Hằng, Dương Thị Dung, Nguyễn Thị Cúc, Dương Thị Hải Yến, Hoàng Lê Tuấn Anh, Nguyễn Xuân Nhiệm, Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm Các hợp chất đitecpenoit phân lập từ loài Na biển Annona glabra (Phần 2) Tạp chí Hóa học, 2015, 53 (4), 526-530 [...]... sự sản sinh NO mạnh hơn chất đối chứng dexamethasone, với giá trị IC50 trong khoảng 0,01 ÷ 0,42 µM KIẾN NGHỊ Từ các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây na biển (A glabra) , chúng tôi nhận thấy: Các hợp chất mới 3, 4 với khung ent-kaurane có hoạt tính ức chế tốt sự phát triển của 4 dòng tế bào ung thư thực nghiệm (LU-1, MCF-7, SK-Mel2 và KB) Vì vậy, cần thêm các nghiên. .. Phan Văn Kiệm Các hợp chất đitecpenoit phân lập từ quả cây Na biển Annona glabra (Phần 1).Tạp chí Hóa học, 2015, 53 (3), 392-395 5 Nguyễn Thị Thu Hiền, Đan Thị Thúy Hằng, Dương Thị Dung, Nguyễn Thị Cúc, Dương Thị Hải Yến, Hoàng Lê Tuấn Anh, Nguyễn Xuân Nhiệm, Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm Các hợp chất đitecpenoit phân lập từ quả loài Na biển Annona glabra (Phần 2) Tạp chí Hóa học, 2015, 53 (4), 526-530... chi Annona (5, 14, 15, 17-20), 2 hợp chất lần đầu phân lập từ loài A glabra (6, 21); 2 Đã tiến hành sàng lọc đánh giá hoạt tính gây độc tế bào từ các dịch chiết methanol, các phân đoạn n-hexane, dichoromethane, ethyl acetate và nước của quả và lá loài na biển (A glabra) trên hai dòng tế bào ung thư biểu mô KB và ung thư phổi LU-1 Kết quả cho biết dịch chiết methanol của quả và lá loài na biển (A glabra) ... thể hiện độc tính trên dòng tế bào thường HEL-299 Nghiên cứu về cơ chế gây chết tế bào ung thư của hai hợp chất ngày đã chỉ ra hai hợp chất này gây chết theo chương trình 24 Đồng thời các nghiên cứu chuyên sâu western blot ở cấp độ phân tử cũng đã được nghiên cứu với hợp chất 18 và 22 5 Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm thông qua sự ức chế sự sản sinh NO trong điều kiện đại thực bào của các hợp chất... Hợp chất IC50 (µM) 1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 0,39 12 >30 13 0,01 14 3,1 15 17,06 16 6,20 17 0,32 18 12,1 20 >30 22 >30 Dexamethasone 0,10 0,42 14,7 >30 16,3 >30 1,21 1,84 3,21 0,80 KẾT LUẬN 1 Từ cây na biển (Annona glabra) đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 22 hợp chất bao gồm • 5 hợp chất mới:  4 hợp chất diterpenoid ent-kaurane: 7β,16α,17-trihydroxy-ent-kauran19-oic acid (1), 7β,17-dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic... from the fruits of Annona glabra and their inhibitory nitric oxide production in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2015, 25, 254-258 2 Hoang Le Tuan Anh, Nguyen Thi Thu Hien, Dan Thi Thuy Hang, Tran Minh Ha, Nguyen Xuan Nhiem, Truong Thi Thu Hien, Vu Kim Thu, Do Thi Thao, Chau Van Minh and Phan Van Kiem ent-Kaurane Diterpenes from Annona glabra and Their Cytotoxic... 64,61 8,72 >100 93,25 >100 94,69 6,8 * % sống sót của tế bào thường HEL-299 tại nồng độ thử IC50, thực hiện tại Khoa Dược, Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc, $ thực hiện tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam # Hơn nữa, khi xử lý với hợp chất 18 và 22, kết quả cho thấy số lượng các tế bào siêu lưỡng bội (hypodiploid cells) ở giai đoạn... độc tế bào mạnh với giá trị IC50 trong khoảng 1,08 ± 0,14 ÷ 3,70 ± 0,98 Đây là cơ sở để lựa chọn cho các nghiên cứu về thành phần hóa học 20 Bảng 4.24 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết và các phân đoạn từ lá và quả loài na biển (A glabra) IC50 (µg/mL) Dịch chiết LU-1 KB Bộ phận na biển Lá Quả Lá Quả 32,43 ± 2,12 14,59 ± 3,16 38,19 ± 1,23 12,57 ± 3,62 Dịch chiết MeOH 25,15 ± 2,70 16,15... trúc các hợp chất Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 22 hợp chất được phân lập từ quả loài na biển, trong đó có 5 hợp chất mới và 17 hợp chất đã biết * Cấu trúc hóa học và tên gọi của 22 hợp chất phân lập được từ loài na biển (A glabra) được trình bày trong hình 4.60 và bảng 4.23 dưới đây: 15 H H OH OH OH H H OH H COOH H COOGlc 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-entkauran-19-oic... chất 4 Hình 4.31 Phổ HMBC của hợp chất 4 Hình 4.32 Phổ COSY của hợp chất 4 Hình 4.33 Phổ NOESY của hợp chất 4 4.2 Kết quả thử hoạt tính sinh học 4.2.1 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn Kết quả cho biết dịch chiết methanol của quả và lá loài na biển (A glabra) đã thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên cả hai dòng tế bào là LU-1 và KB với giá trị IC50 trong khoảng 12,57 ± 3,62 ÷ 38,19 ... đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học hoạt tính sinh học na biển (Annona glabra L), lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Na biển (Annona glabra L.)" Đối tượng nghiên. .. nhiệm vụ nghiên cứu luận án CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần tổng quan tài liệu trình bày nghiên cứu nuớc quốc tế vấn đề: 1.1 Giới thiệu chi Na (Annona) 1.2 Giới thiệu loài na biển (Annona glabra) ... Đối tượng nghiên cứu nội dung luận án Đối tượng nghiên cứu luận án loài na biển Annona glabra Nội dung luận án: Phân lập hợp chất từ loài na biển (A glabra) phương pháp sắc ký; Xác định cấu trúc