Pcr và giải trình tự

Pcr và giải trình tựPcr và giải trình tựPcr và giải trình tựPcr và giải trình tựPcr và giải trình tựPcr và giải trình tựPcr vPcr và giải trình tựPcr và giải trình tựPcr và giải trình tựPcr và giải trình tựPcr và giải trình tựPcr và giải trình tựPcr và giải trình tựPcr và giải trình tựà giải trình tự

PCR gi i trình t Gi i trình t gì? DNA c s hóa h c c a gen Phân t DNA m t chu i xo n kép c a hai m ch n c c u t o t lo i nucleotide khác nh base c a chúng, ó là: A (adenine), C (cytosine), G (guanine) T (thymine) Các nucleotide n i k t liên ti p v i theo m t th t xác nh Gi i trình t c a gen t c phát hi n c th t s p x p c a lo i nucleotide phân t DNA Các ph ng pháp gi i trình t gene Ph ng pháp hóa h c gi i trình t DNA Vào n m 1977, Maxam Guilbert phát minh có th gi i trình t m t o n DNA Ngun t c c a ph h t ph i ánh d u m t ng pháp hóa h c ng pháp là: (1) Tr c u c a o n DNA c n ph i gi i trình t b ng m t g c 32 ng v phóng x ( P); (2) X lý o n DNA ã ánh d u v i ch t phospho hóa h c có th làm bi n i DNA Ví d , dimethylsulphate c hi u m t ho c hai lo i base c a nucleotide o n bi n i Guanine b ng thêm m t g c methyl trí nitrogen th (N7), hydrazine làm bi n NaCl c m t ph làm bi n làm bi n i Cytosine, acid v i Thymine Cytosine, hydrazine làm bi n i Guanine Adenine, NaOH i Adenine Cytosine v i Adenine u tiên h n Cytosine Nh v y giai o n này, ph i dùng nh t ng nghi m m i ng nghi m, DNA lý v i m t l ng r t gi i h n c a m t ch t hóa h c nêu cx m i ng nghi m ch có ch a o n DNA mà m i o n DNA ch có m t v trí nucleotide c hi u v i ch t hóa h c b bi n s b l y kh i m ch khung DNA nh ó tách i; (3) Các nucleotide b bi n i ng-phosphate (sugar-phosphate backbone) c a o n c o n m ch n có m t u ánh d u 32P m t u b m t phân t base phân t ã b l y kh i m ch khung (hình 37) (4) Th c hi n i n di m u DNA ã x lý ng nghi m hàng c a m t gel polyacrylamide bi n tính m ch i q trình i n di Nh n m u di chuy n gel khơng b bi n ó, sau hồn t t i n di, m ch t i v trí khác nhau, tùy thu c vào m ch n s b d ng n dài ng n khác nhau, theo hàng d c su t chi u dài c a gel Áp gel ã i n di m t phim nh y tia X, v trí d ng 79 l i c a m ch ub n gel i n di s t o thành v ch phim v trí ánh d u phóng x m ch n u có m t u c ánh d u b ng 32P T v ch phim x ký t ghi (autoradiography), có th c c trình t c a nucleotide c a o n DNA (hình 38) Ph ng pháp hóa h c xác nh trình t DNA c a Maxam Gilbert th c t khơng ph i d th c hi n c n ph i xác ó khó nh t ph i xác nh nh nhi u thơng s t i u cho thí nghi m, c n ng gi i h n nh t c a ch t hóa h c cho x lý m u DNA m i o n DNA ch có m t base b bi n m i v trí c a base b bi n i s có m t m ch Chính s ph c t p này, ph n có u ánh d u P ng pháp Maxam Gilbert hi n thay vào ó nhà khoa h c dùng ph i 32 ng v i c tách c s d ng, mà ng pháp enzyme v i nhi u u i m v t tr i h n M ch n DNA 32 P A p G p C p T p T p T p G p A p G p G p A p C p G p A 32 Các m ch DNA n có u b ánh d u 32P P P 32 P 32 P 32 P 32 Hình 37: Các m ch n có m t u ánh d u v i 32P m t u base Guanine b l y kh i m ch khung b bi n i Các m ch n có chi u dài ng n khác tùy thu c vào v trí c a Guanidine o n DNA GCCCACTTCAGAAGAAAAAGG C T+G G A>C Hình 38: Hình x ký t ghi phim nh y tia X m t gel polyacrylamide sau ã i n di Các v ch v trí n m ch n b d ng l i sau i n di Các v trí g n hay xa kh i i m tu kích th c c a m ch dài hay ng n khác T v ch này, c trình t c a o n DNA m u 80 Ph ng pháp enzyme gi i trình t DNA Ph ng pháp enzyme ngày hơm ph c Sanger c ng s phát minh c ng vào n m 1977, ng pháp ngày c hồn thi n th c hi n d dàng t i phòng thí nghi m Ngun t c chung c a ph ng pháp có th tóm t t nh sau: CATACGTGG CCTTACG m i GGAATGC CATACGTGG t❤ê♠ thêm d*NTP, DNA polymerase, ddCTP d*NTP, DNA polymerase, ddATP CGTAAGG*C*CdA CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA CCTTACG GGAATGC thêm d*NTP, DNA polymerase, ddGTP thêm d*NTP, DNA polymerase, ddTTP CGTAAGG*C*C*A*CdG CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG CGTAAGGdC CGTAAGG*CdC CGTAAGG*C*C*AdC CGTAAGG*C*C*A*C*GdT CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT i n di gel CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA CGTAAGG*C*C*A*C*GdT CGTAAGG*C*C*A*CdG CGTAAGG*C*C*AdC CGTAAGG*C*CdA CGTAAGG*CdC CGTAAGGdC Hình 39: Chi u i n di c chèn vào m t vector t i m t v trí bi t rõ Ph ng pháp Enzyme gi i trình t DNA o n DNA trình t , nh ó có th t ng h p c m ch n có m t u m i, m t u nucleotide c dánh d u 35S, nh v y m ch t n Trong hình nucleotide ánh d u * nucleotide n c ánh d u 81 c h t chèn o n DNA c n ph i xác Tr nh trình t vào m t vector phage hay plasmid t i m t v trí mà trình t chu i c a v trí ã th t c c xác nh rõ Chuy n a vector mang o n chèn DNA vào t bào vi khu n nhân b n vector thành nhi u b n sao, sau ó tách chi t tinh t vector t vi khu n thành vector t Dùng o n m i b sung m t cách c hi u v i trình t c a vector t i v trí chèn o n DNA Thêm vào ng ph n ng men DNA polymerase lo i nucleotide (g i dNTP: deoxynucleotide triphosphate) m t l t ng r t gi i h n nucleotide t n (terminator, ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, c ng nh dNTP, có lo i ddNTP t ng ng v i base A, T, C G) Ph n ng ng, m i ng cho m t lo i ddNTP khác B t polymerase s kéo dNTP vào t ng h p m ch vector, s t ng h p m ch n s b d ng l i t i v trí mà ddNTP dNTP Lý s c th c hi n ut o n m i, men DNA n b sung v i m ch DNA chèn ❆ c kéo vào thay C G T T t ng h p b d ng l i C G ddNTP có c u trúc hóa h c b m t i g c OH t i C A v trí carbon th c a ng deoxyribose, mà G T g c OH t i v trí n i ti p C dNTP k C T c g n vào Nh v y ng ph n ng có m ch t ng A G n DNA có chi u dài khác ng v i v trí trình t C T T A nucleotide o n DNA g c (hình 39) G C gi i trình t , ng i ta dùng ph i n di gel polyacrylamide bi n tính V i ph ng pháp ánh d u m i hay dNTP b ng ng v phóng x G ng pháp G Hình 40: Hình x ký t ghi m t k t qu gi i DNA gel trình t polyacrylamide T k t qu này, c c trình t DNA 32 c ng gi ng nh ph P hay 35S sau i n di, ng pháp c a Maxam Gilbert, ng i ta phát hi n v ch i n di b ng k thu t x ký t ghi, t v ch gi i c trình t c a o n DNA (hình 40) 82 Gi i trình t b ng máy t ng (automated sequencer) Các phòng thí nghi m hi n u dùng ph n ng gi i trình t b ng ph enzyme, nh ng làm gi i trình t th k thu t x ký t ghi nh tr m ch DNA hu nh quang c ây ng dùng máy t th c hi n ng ch khơng dùng c gi i trình t b ng máy t n s n sinh ng ph n ng gi i trình t ph i v ch i n di c a m ch tia sáng laser C u t o c a m t máy t ng pháp ng c ánh d u n phát sáng i qua m t chùm ng gi i trình t g m hai ph n y u, ó là: ph n i n di v i gel polyacrylamide ph n phát hi n v ch i n di Ph n i n M t c m quang Tia LASER A G C T T A C G G A C T A A TGC Màu Màu Máy tính Màu Màu Hình 41: S kh i m t máy t ng gi i trình t dùng b n gel polyacrylamide Máy g m hai ph n: ph n i n di gel polyacrylamide, ph n phát hi n v ch i n di Các v ch i n di c m t c m c m t c m quang truy n v quang phát hi n i qua chùm tia laser phát sáng lên Tín hi u máy tính hi n th thành nh c ng sáng 83 di polyacrylamide có th m t b n gel m t ng mao qu n ch a gel Ph n phát hi n v ch i n di nh ng m t c m quang m t chùm tia laser i qua tr Ngun t c ho t c ng c a máy su t q trình i n di, m i có m t v ch i n di i qua chùm tia laser v ch i n di s phát sáng lên s phát sáng s c m t c m quang CATACGTGG CCTTACG GGAATGC ghi nh n l u l i thành m t nh c ng bi u c a sáng thêm dNTP, DNA polymerase, ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP T bi u nh c ng CGTAAGGCCdA ❈●❚  ●●❈❈❞  CGTAAGGCdC ❈●❚  ●●❈❞❈ CGTAAGGCCACdG ❈●❚  ●●❈❈ ❈❞● CGTAAGGCCACGTdA ❈●❚  ●●❈❈ ❈●❚❞  CGTAAGGdC ❈●❚  ●●❞❈ CGTAAGGCCACGTA TdG ❈●❚  ●●❈❈ ❈●❚  sáng này, máy s so dòng c a nh t v i màu ng ng cu i CGTAAGGCCAdC CGTAAGGCCACGdT CGTAAGGCCACGTAdT phân tích thành trình t c a o n DNA (hình 41) V i máy th h m i sau này, ng th i ta có dùng màu hu nh quang khác ánh d u lo i ddNTP, nh v y ph n ng gi i trình t có th th c hi n c ch *CGTAAGGCCACGTA TdG *CGTAAGGCCACGTAdT *CGTAAGGCCACGTdA *CGTAAGGCCACGdT *CGTAAGGCCACdG *CGTAAGGCCAdC *CGTAAGGCCdA *CGTAAGGCdC *CGTAAGGdC Chi u i n di Hình 42: V i ddNTP ánh d u hùynh quang khác nhau, an trình t t n u s c ánh d u b ng màu hùynh quang khác t ng ng v i nuleotide t n A, hay T, hay C hay G Chính nh v y khơng c n ph i th c hi n ph n ng gi i trình t ng ph n ng m t ng nghi m gi i trình t ch c n i n di m t hàng mà khơng c n ph i hàng khác nh tr c ây (hình 42) N u dùng di n di mao qu n tùy thu c vào s mao qu n có th ch y m t l n mà ng hay Hình 43 s i làm thí nghi m có th có s m u cho m i l n ch y nhi u kh i minh h a cho m t gi i trình t mao qu n (CEQ8000, hay CEQ8800) Tùy thu c vào qui mơ c a phòng thí nghi m v i s m u gi i trình t mà phòng thí nghi m có th trang b gi i trình t hay nhi u mao qu n Ví d v i ABI có nhi u lo i: ch mao qu n, mao qu n, 16 mao qu n, 48 mao qu n, r i 96 mao qu n Phòng thí nghi m R&D c a cơng ty Nam Khoa tr c ây nhu c u gi i trình t khơng nhi u nên ch trang b CEQ8000 có mao qu n (hình 44) Nh ng 84 nhu c u nghiên c u d ch v ngày nhi u nên ã trang b thêm ABI 3130XL có n 16 mao qu n (hình 44) Các th h máy v sau ngày có nh ng ch có th hi n th t ng trình i kèm ch ng nh ng ng ký t hố h c c a trình t DNA mà giúp nhà nghiên c u có th : (1) Phát hi n chi ti t c n thi t trình t nh mã kh i thúc, vùng c m (ORF: Open Reading Frame), trình t u, mã k t c hi u cho enzyme c t gi i h n (restriction enzyme), d u n di truy n mà chi ti t r t c n thi t l pb n gen (2) Phiên d ch trình t vùng ngh a) thành trình t acid amin c a m t protein, nh hay làm c s ban u hi u c m (t c vùng trình t có ý ó có th xác c ch c n ng c a gen (3) T nh, ph ng ốn, ng so sánh trình t DNA thí nghi m hay m t trình t DNA n p vào máy, hay có th trình t acid C m quang amin c a protein, v i trình t khác ã có ngân hàng d cs t t li u phát hi n ng ng v i trình ã bi t, nh xác Mao qu n ✂C ❝c [-] ó làm c s Laser nh gen ch c n ng i n th cao gen Hình 43: S kh i m t máy di n di mao qu n dùng gi i trình t DNA Hình 44✿ Máy gi i trình t CEQ8000 có mao qu n c a Becman Coulter ABI 3130XL có 16 mao qu n c trang b t i phòng thí nghi m R&D c a cơng ty Nam Khoa c a Applied Biosystem ✽✁ PCR cơng c giúp hồn thi n m r ng ph áp d ng k thu t gi i trình t PCR ã óng góp r t nhi u vào cơng ngh gi i trình t làm cho cơng ngh gi i trình t ngày d dàng h n thu n ti n h n Khơng ch v y PCR làm cho gi i trình t có nhi u ng d ng h n khơng ch nghiên c u mà c ch n ốn n a Tr c có PCR ng i ta ch có th gi i trình t o n gene chèn vào plasmid ch có nh v y m i có th nhân b n trình t thành nhi u b n v i s l ng ch y c l p c o n gene mu n gi i c ph n ng gi i trình t Ngồi ra, enzyme polymerase c ng lo i enzyme khơng ch u nhi t nên ph n ng gi i trình t ch th c hi n 37oC, v y mà v n t i u thành ph n c a ph n ng r t khó ng th i hi u qu c a ph n ng gi i trình t c ng khơng cao T có s r tv i c a k thu t PCR k thu t gi i trình t c ng có nh ng ti n b t b c Ch c n dùng PCR có th nhân b n o n gene mu n gi i trình t thành hàng t b n hồn tồn gi ng h t s n ph m khu ch i có th a vào gi i trình t tr c ti p mà khơng c n ph i chèn vào m t plasmid gi i trình t n a S phát minh k thu t nhân b n DNA ng nghi m b ng PCR c ng giúp cho vi c c i ti n ph n ng gi i trình t hi u qu tr polymerase gi i trình t b n v i nhi t c ây tr nên hi u qu h n nh áp d ng enzyme ph n ng gi i trình t c th c hi n qua chu k nhi t gi ng h t PCR, mà ngày g i ph n ng chu k nhi t gi i trình t V i ph n ng chu k nhi t gi i trình t hi u qu ph n ng t t h n r t nhi u, ng th i t i u hóa thành ph n c a ph n ng c ng d dàng h n r t nhi u Có th nói s i hồn thi n k thu t PCR ã giúp t ng t c k thu t gi i trình t khơng nh ng v n hồn thi n nó, mà c v n Gi i trình t b gene ng ph m vi áp d ng i Làm th gi i trình t b gene ng Gi i trình t b gen ng i i t c gi i trình t tồn b th t s p x p nucleotide A, T, C, G c a DNA 23 c p nhi m s c th t bào ng gen ng i c Ti n S James Watson, cha gi a th p niên 1980 i D án gi i trình t b c a phát hi n c u trúc DNA, n tháng 10 n m 1990, d án c ra t i v i kinh phí t M kim HGP (Human Genome Project) c a Vi n Qu c Gia Y T Hoa K lãnh v i s tham gia c a nhi u trung tâm nghiên c u b gen ng ✄☎ o i c a nhi u qu c gia th gi i Do tiên ốn giá tr kinh t mang l i t vi c gi i mã thành cơng b gen ng i s r t l n, nên ã có m t s cơng ty sinh h c chun v b gen ng i ã c hình thành S nh p cu c c a cơng ty t nhân ã t o nên m t b u khơng khí thi ua cho vi c khai phá bí m t v b gen c a lồi ng ngày n ích c c k ngo n m c Trong cu c ch y ua này, nh ng pháp c c k ph i chúng ta, g n n nh ng ã áp d ng m t c áo k t h p gi a cơng ngh PCR, cơng ngh gi i trình t DNA v i cơng ngh tin h c, nên ch v i kinh phí kho ng 200 tri u m kim, Ti n S Crag Venter c a Celera Genomics tr thành ng gi i trình t c g n nh hồn tồn b gen ng id n u thành cơng nh t vi c i Cái khó kh n c a vi c gi i trình t b gene ng i khơng th tách t ng phân t DNA c a t ng nhi m s c th r i em gi i trình t i i phân t DNA ngun v n Các nhà khoa h c c a HGP c ng nh trung tâm khác th gi i nghiên c u v b gen ng i th h di truy n, r i em gi i trình t o n c t DNA này, cu i ng theo b n ng c t i phân t DNA c a nhi m s c th m t cách tìm cách ghép n i chúng l i v i cho úng v trí c a chúng nh i phân t DNA ng pháp òi h i ph i t n nhi u th i gian cơng s c có nhi u o n Ph c t DNA q l n, r t khó gi i trình t c ng nh khó cho k t qu gi i trình t xác Do ó, v i m i m t o n DNA nhà khoa h c ph i th c hi n gi i trình t nh t 7l n mb o l p l i Chính v y, v i cách ti p c n này, nhi u v trí i phân t DNA v n khơng th gi i trình t c mà t ó nhà khoa h c c a HGP có th hồn t t vi c x p úng v trí o n DNA ã gi i trình t i phân t DNA c a nhi m s c th Ti n s Crag Venter ã th c hi n m t ph cách hồn tồn khác h n (hình 45) Tr s c th t bào ng ng pháp gi i trình t b gen ng c h t ơng cho tách chi t tồn b DNA nhi m i r i phá bung m t cách khơng thành m nh DNA nh h n im t nh h ng i phân t DNA em gi i trình t t t c m nh DNA nh Cu i dùng nh ng máy i n tốn c c m nh mà ơng ã h p tác v i cơng ty ABI ch t o ra, dò tìm c a chúng u trùng l p c a m nh DNA nh l p n i vào úng v trí i phân t DNA c a nhi m s c th Chính nh áp d ng chi n l c gi i trình t mà Celera Genomics ã gi i trình t r t nhanh m nh DNA, ch c n l p l i cho m i m nh DNA có l n, ã x p úng g n nh h u h t v trí c a m nh ✆✝ DNA ã gi i trình t i phân t DNA c a nhi m s c th H n th n a, TS Crag Venter c ng tun b cơng ty ã tri n khai m t k thu t m i có th làm cho ph pháp gi i trình t b gen c a cơng ty, v n d ã ph ng ng pháp nhanh nh t r i, tr thành nhanh h n n a Cu i n m 2000, Celera Genomics ã hồn thành vi c gi i trình t b gen c a chu t v i 2.3 t gen ng ký t hóa h c! ó có r t nhi u t ng ng v i b i, nh v y s giúp nhà khoa h c d dàng h n vi c truy tìm ch c n ng c a gen K t qu gi i trình t b gene ng i Sau g n 10 n m nghiên c u th c hi n v i nh ng n m v sau sơi ❉◆✟ t ng khơng khí thi mhi m s c th c phá bung thành nhi u mãnh nh ua s nh p cu c c a cơng ty t nhân, ngày 26 tháng n m 2000, t i Tòa B ch c v i s Các mãnh DNA nh c gi i trình t hi n di n c a T ng Th ng Hoa cag K Bill Clinton, hai khoa h c gia M Ti n S Crag Venter Francis Collins Institute of Health) cơng b m t cách long tr ng ch gi i trình t hồn t t b i c ag c g a g a ca g c g gag c ca gc a t g g g g cggc g ga ca cc a g c ca g g ca t t t tgtac c g a g cg g c g g g a g a c a gc g a g t g ag t cc a c t a t g g c ggc g g a g ca c gagc g g c ccgtcaaccggagtta ng trình gen ng a gc Các mãnh DNA nh c ch ng trình phân tích t ng tìm u trùng l p, nh ó tái hi n c trình t c a i phân t DNA i di n cho Project) c a NIH (NIH: National g g a g ca g c g a g c g g cg g i HGP (HGP: Human Genome g g cggc t t t cc g a ga g gag c ca gc a t di n cho Celera Genomic Ti n S g ca ã acgttct ây m t th i kh c l ch s c c k quan tr ng nh c a nhân lo i, ánh d u ngày nhân lo i ã có tay m tb n b sinh h c c n thi t c vào k ngun m i v i nhi u h a h n thành t u v Hình 45✠ €✡ ♥❣ pháp gi i trình t b gen ng i c a cơng ty Celera Genomics: tr c h t tách chi t tồn b DNA c a nhi m s c th t bào ng i, sau ó phá tung DNA thành m nh nh , gi i trình t t t c m nh nh này, cu i nh ch ng trình vi tính c c m nh n i k t o n DAN nh l i v i b ng cách dò tìm u trùng l p nh v y tái hi n c m ch DNA ngun th y ✞✞ B ng 13 14 trình bày k t qu cho th y s khác bi t gi a vi khu n th t s có s n ph m probiotic so v i k t qu c nhà s n xu t cơng b nhãn B ng 13: K t qu nh danh b ng k thu t PCR gi i trình t th t s có probiotic s d ng ng i ❙★★ ✶ Tên s n ph m 16s rDNA k t qu Tên vi khu n nhãn s n ph m nh l ng vi khu n K t qu PCR gi i trình t 16sDNA Biosubtyl DL Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr Bidisubtilis (gói gi y) Bacillus subtilis 108/gr Bacillus cereus 107/gr Bidisubtilis (gói nhơm) Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr Bio ! Acimin Bacillus subtilis 108/gr Bacillus cereus 107/gr Bacillus pumilus 107/gr Biosubtyl II (gói) Bacillus subtilis 10 /gr Biosubtyl II (viên) Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr Subtyl Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus cereus 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus cereus 10 /gr Bio Baby Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr Bio Vita Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr 10 Medilac ! Vita B ng 14: K t qu nh danh b ng k thu t PCR gi i trình t th t s có probiotic s d ng cho th y s n STT Tên s n ph m 16s rDNA k t qu Tên l ng* vi khu n nhãn s n ph m DT-LACTO Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus Bio-DW Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus Probiotex-one Bacillus subtilis 6 nh l ng* vi khu n nh danh K t qu nh l ng* th c t Bacillus pumilus Khơng tìm th yL acidophilus 10 /gr Bacillus subtilis Khơng tìm th yL acidophilus 10 /gr B megaterium 11 4 Vime-Subtyl Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr Biozyme for fish Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr Novazyme F Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr Subtyl-LA Bacillus subtilis NPV-Prozyme 90 Bacillus pumilus Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 10 /gr ProKura Bacillus subtilis 10 Men g u vàng 10 /gr Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 11 Biobac Bacillus subtilis Bacillus subtilis Khơng tìm th yL acidophilus Bacillus subtilis 10 /gr 10 /gr Bacillus cereus Khơng tìm th yL acidophilus Bacillus pumilus 12 Pond clear Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 10 /gr Bacillus subtilis Khơng tìm th yL acidophilus 105/gr 13 Bio Pond Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 108/gr Bacillus subtilis Khơng tìm th yL acidophilus 105/gr 14 Men Bac Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 15 Microzyme Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 16 Zymmix Lactobacillus acidophilus 17 Lactovet Lactobacillus acidophilus 18 Zeofarm Lactobacillus acidophilus *Ch nêu lên l ng vi khu n mà 11 Bacillus cereus Khơng tìm th yL acidophilus Bacillus subtilis Khơng tìm th yL acidophilus ? 10 /gr Acidovorax sp Clostridium phylofermentant 10 /gr L acidophilus 10 /gr nh danh b ng PCR gi i trình t cho th y k t qu khơng sai l ch ✦✧ Phân tích d ki n trình bày hai b ng trên, th y ph m probiotic dùng cho ng i, s sai bi t v hàm l ng gi a k t qu ki m tra so v i cơng b nhãn khơng nhi u (khơng q 10 l n), nh ng có cơng b khơng úng v i k t qu cereus, vi khu n khơng i v i s n nh danh Th m chí có n 50% tên vi khu n n s n ph m l i s d ng B c phép có m t th c ph m có kh n ng gây tiêu ch y ói m a có th ch a toxin, làm vi khu n tr sinh probiotic dùng cho th y s n, k t qu ki m tra cho th y i v i s n ph m i v i vi khu n B subtilis, có 6/15 m u khơng ph i B subtilis mà B cereus hay B pumilus; ch có m t s n ph m có ch a L acidophilus h u h t khơng tìm th y vi khu n nh cơng b nhãn Hình 49 minh h a m t k t qu gi i trình t gene 16s rDNA xác nh vi Hình 49✪ M t ch ng vi khu n phân l p t m t s n ph m probiotic n u chi d a vào tính ch t khu n l c nhu m Gram khơng th bi t ây khơng ph i B subtilis, nh ng gi i trình t 16s rDNA xác nh c ây B cereus khu n B cereus nhãn s n ph m l i B subtilis Còn v m t hàm l th t th m h i, các s n ph m a s hàm l ng t t gi m t 104 m t ti ng chng báo ng ng c ki m tra th t s có vi khu n nh cơng b n 105 so v i cơng b K t qu c a nghiên c u nhà s n xu t c ng nh c quan ki m tra ch t ✩✩ l ng nên quan tâm ng nv n ch t l ng c a s n ph m probiotic s d ng cho i th y s n hi n ang l u hành t i Vi t Nam; ki m tra c ch t l ng s n ph m probiotic ph i s d ng PCR gi i trình t gene 16s rDNA ch có gi i pháp m i có th nh danh xác vi khu n c s d ng làm probiotic, tránh nh m l n v i vi khu n khơng có tác d ng probiotic hay th m chí có th c h i Hình 50✬ M t phi u lý l ch 16s rDNA c a m t ch ng vi khu n dùng ki m chu n v i thơng tin v tính ch t khu n l c, hình nh Gram, tính ch t sinh hóa c b n, quan tr nh nh t trình t gene 16s rDNA ✫✵✵ c Xây d ng lý l ch 16s rDNA c a ch ng vi khu n dùng ki m chu n Trong n i ki m hay ngo i ki m vi sinh, r t c n thi t ph i dùng ch ng vi sinh có lý l ch nh danh ch ng xác Các phòng thí nghi m vi sinh th ng u c u cung c p ch ng qu c t v i lý l ch xu t phát t nhà cung c p ch ng Hi n r t khó có th t mua ch ng g c qu c t v n nguy c kh ng b sinh h c Chính v y gi i pháp hay nh t hi n s d ng ch ng g c qu c t hi n ang l u gi t i phòng thí nghi m, th m chí s d ng ch ng g c phân l p nh ng ph i có lý l ch d nh danh xác nghi m NK-Biotek n lồi ng tr c c u c u này, phòng thí n v R&D c a Nam Khoa ã xây d ng lý l ch 16s rDNA c a t t c ch ng qu c t ATCC, c ng nh m t s ch ng phân l p c tiêu bi u cho gi ng lo i vi khu n c n cho ki m chu n Hình 50 minh h a m t lý l ch 16s rDNA c a ch ng vi khu n Nam Khoa c phòng thí nghi m NK-Biotek n vi R&D c a cung c p dùng ki m chu n Hình 51✯ M t k t qu nh danh b ng PCR gi i trình t 16s rDNA c a m t ch ng vi sinh cơng nghi p cho th y ây Acrobacterium tumefaciens, vi khu n r t khó nh danh b ng vi sinh kinh i n ✭✮✭ Làm xét nghi m d ch v d nh danh vi khu n C ng v i cơng ngh PCR gi i trình t 16s rDNA c a vi khu n, phòng thí nghi m NK-Biotek danh vi khu n cg i M u n v R&D c a Nam Khoa ã ang th c hi n d ch v c dùng vi sinh cơng nghi m c ng nh vi sinh nơng nghi m n t cơng ty, nhà máy, hay t u c u c a cg i nh n tài nghiên c u nh danh có th ch ng vi khu n c y mơi tr ng ni c y, d ch tách chi t DNA, hay huy n d ch vi khu n Có th nói v i gi i pháp k thu t PCR gi i trình t gene 16s rDNA, vi khu n dù l danh n âu c ng u c nh danh khu n dùng vi sinh cơng nghi m n âu, dù khó nh n lồi Hình 51 k t qu m t ch ng vi c u c u nh danh, k t qu nh danh cho th y ây vi khu n Agrobacterium tumefaciens ng d ng k thu t PCR gi i trình t Trong xét nghi m vi sinh n u s d ng ph nh danh vi n m nh danh vi n m có l m t tr ng i l n nh t ng pháp kinh i n khơng ch phân tích hình thái th , v n d ph c t p cơng phu, mà ph i làm cho h c khác nh th ng hóa Nh n di n c kh o sát sinh v t hóa ng, phân tích ch t bi n d ng có phòng thí nghi m vi sinh làm i th vi ng Chính v y thơng c xét nghi m vi n m c tr ng i k thu t y u này, phòng thí nghi m NK-Biotek n v R&D cơng ty Nam Khoa ã c g ng tìm gi i pháp v gian nghiên c u - th nghi m, ã xây d ng t qua, sau m t th i c m t gi i pháp k thu t ó s d ng PCR gi i trình t gene 28s rDNA Ngun t c c a gi i pháp s d ng b NK FUNGI-DNAPREP n v R&D c a cơng ty Nam Khoa ch t o DNA tồn ph n t m u vi n m hay m u th ch a vi n m c n d ng PCR v i m t c p m i c t tên DNA dài kho ng 260 bps có ch a trình t NK 28s-F NK tách chi t nh danh, sau ó s 28s-R c hi u m t o n c hi u gi ng lồi c a vi n m gene 26s rDNA, sau gi i trình t tr c ti p chi u s n ph m PCR nh danh vi n m qua blast search ngân hàng d li u gene c a NCBI ng d ng gi i pháp k thu t này, phòng thí nghi m NK-Biotek c a cơng ty Nam khoa ang th c hi n r t thành cơng hai d ch v , ó là: ✰02 n v R&D a Phát hi n nh danh vi n m bi n m l y t ph u thu t b nh nhân viêm xoang Tr c ây, b nh ph m bi n m (fungus ball) th h ng g i ng n phòng thí nghi m gi i ph u b nh k t qu th c bác s tai m i ng c nh n v sau tu n nhìn th y vi th s i t n m nghi Aspergillus Hi n v i xét nghi m PCR Penicit rium cit rinum (5%) M alassezia rest ricta (3%) X ylar ia curt a (2%) Rhinocladiella at rovir ens (5%) Neosar to rya f ischeri (3%) A sper gillus niger (7%) Cand id a ort hopsilo sis (2%) A sper gillus f umigat us 23 (40 %) zophyllum cominune (2%) Pichia guilliermondii (2%) Pseud allescheria b oydi (7%) 12: T ng k t k t qu phát hi n nh danh n m b ng k thu t PCR gi i trình t 28s rDNA m u bi n m l y t m viêm xoang b nh nhân Bi u gi i trình t c th c hi n t i phòng thí nghi m NK-biotek nhà lâm sàng s có k t qu sau ngày v i phát hi n Chí Minh g i D ch v nh danh vi n m n lồi Bi u nh danh vi n m bi n m 12 t ng k t k t qu c b nh vi n Tai M i H ng TP.H n th i gian g n ây Có t ng c ng 58 m u nghi m, c 58 b A sper gillus oryzae 11 (19%) A sperg illus f lavus (3%) u phát hi n nh danh cg i n làm xét c vi n m tác nhân gây b nh nh danh vi n m Trên c s c a k thu t PCR gi i trình t gene 28s rDNA, phòng thí nghi m NK-Biotek n v R&D c a cơng ty Nam Khoa tri n khai c xét nghi m d ch v nh danh vi n m v i ngu n m u t cơng ty, nhà máy l nh v c cơng nơng nghi p, t phòng thí nghi m c a tr tâm nghiên c u Có th nói cho i h c hay c a trung n nay, h u nh khơng có m u vi n m g i phòng thí nghi m NK-Biotek khơng có k t qu h a hai k t qu ng nh danh Hình 52 hình 53 minh nh danh n m xét nghi m d ch v Biotek ✱03 n nh danh vi n m c a NK- Hình 52: Vi n m có hình d ng vi th hình h t men nh góc trái cho k t qu PCR gi i trình t 28s rDNA nh bên d i, t trình t k t qu blast search ngân hàng gene NCBI cho k t nh danh Candida tropicalis v i t ng ng 99% qu Hình 53: Vi n m có hình d ng vi th hình que dài nh góc trái cho k t qu PCR gi i trình t 28s rDNA nh bên d i, t trình t k t qu blast search ngân hàng gene NCBI cho k t nh danh Rhinocladiella atrovirens v i t ng ng 99% qu ng d ng PCR gi i trình t phát hi n, nh l ng xác nh genotype HCV Phát hi n, ph i bi t tr phát nh l ng xác c cho ch nh genotype HCV thơng s mà bác s c n nh i u tr i u tr chu n cho b nh nhân có antiHCV [+] Phát hi n HCV-RNA nh b nh nhân ang nhi m HCV, tr c hi u b ng interferon ph i h p v i ribavirin c b t u i u tr làm c s genotype HCV nhân Thơng th nh l giúp bác s ng HCV-RNA xác theo dõi hi u qu i u tr , xác i u tr quy t nh nh l xác ng virus nh c th i gian i u tr cho b nh ng phòng thí nghi m lâm sàng s ph i th c hi n u c u riêng l , ngh a h ph i phát hi n HCV-RNA tr ✲04 c, r i m i nh l ng, cu i m i nh genotype HCV th u c u k nghi m ng ❨✴✉ c thu t nên xét u ph i b t u xác nh genotype HCV ut m u huy t c a b nh nhân Cơng ty Nam Khoa l i s d ng m t ti p c n khác r t m i m , ti n l i, t n h n nh l ng HCV-RNA b ng xét nghi m RT-qPCR s d ng kit NK RT-HCVqPCR phát tri n m t gi i pháp tồn di n th c hi n c u c u c a bác s m t lúc pháp s ó gi i d ng RT real-time PCR phát hi n nh l Xác nh genotype HCV: gi i trình t tr c ti p s n ph m HCVqPCR (#200bp vùng NC) ng HCV-RNA m u huy t b nh nhân sau ó gi i trình t tr c ti p s n ph m real-time PCR xác nh genotype HCV b ng cách so chu i trình t gi i CEQ8000 (8 capillaries) c v i ngân hàng d li u genotype HCV th vi n NCBI th vi n K T QU 24 gi sau nh n m u Los Alamos nh l xác nh genotype HCV, ngồi ABI 3130XL (16 capillaries) ng Ki u gene 37.017 copies/ml 1c lý m t m t xích c a gi i pháp tồn di n nh ã nêu trên, cơng ty Nam Khoa ch n ti p c n gi i trình t có nhi u lý do: (1) N u s d ng kit InoLIPA c a Siemen (Bayer) kit c nhà y h c th a nh n s m t l a ch n t n giá thành c a kit cao, k t qu có khơng phân bi t Hình 54: Qui trình RT-realtime PCR gi i trình t vùng NC phát hi n, nh l ng nh genotype HCV c subtype, v i version c có s nh m l n gi a 6a 1b; (2) N u s d ng k thu t gi i trình t vùng 5#NC c a HCV b ng h th ng gi i trình t kín Trugene c a Siemen (Bayer) dù r t c nhi u nhà y h c th a nh n, nh ng c ng s m t l a ch n t n giá ✳05 thành c a v t li u tiêu hao i kèm theo h th ng r t cao; (3) S d ng ph pháp real-time PCR v i probe c hi u m t ti p c n ng n gi n r ti n nh ng khơng nh y c m cho ch n ốn vùng khu ch vùng c cơng nh n nh y c m nh t cho ch n ốn), khơng có kh n ng phân bi t cao subtype th ng g p khó thi t k nguy c phát hi n chéo khơng hi n i khơng ph i vùng 5# NC (là c probe c hi u mà v n c hi u cl mt n subtype, ng có kh n ng phát ng nhi m Chính lý trên, Phòng thí Nghi m Y Khoa NK-BIOTEK cơng ty Nam Khoa ã nghiên c u xây d ng c ph ng pháp xét nghi m xác nh genotype HCV b ng k thu t gi i trình t vùng 5#NC c a HCV nh ng thay s d ng h th ng gi i trình t kín c a Trugene, s d ng h th ng gi i trình t m c a ABI (máy ABI 3130XL có 16 mao qu n) hay c a Becman Coulter (máy CEQ8000 có mao qu n) Ti p c n ã mang n cho b nh nhân nhà lâm sàng nhi u l i i m: (1) Nh gi i trình t tr c ti p probe c s n ph m PCR t real-time PCR s d ng m i taqman c hi u vùng 5#NC nên k t qu xét nghi m xác k t qu nh l ng HCV-RNA Do v y nhà lâm sàng tr c hi u cho b nh nhân ch c n cho m t ch mà khơng c n cho thêm xét nghi m ốn nh s n ph m ích trình t xác nh genotype ln i kèm v i c quy t nh xét nghi m xác nh l ng (2) t nh i u tr nh genotype HCV c nh y cho ch n gi i nh genotype HCV s n ph m PCR d a vùng ích NC vùng nh t genome HCV nh n nh y c m ốn xác c th a làm ch n nh nh l HCV (3) t xác xác nh genotype HCV c ng Bi u khơng khác bi t v i h th ng gi i 13: Phân b genotype HCV 2000 m u huy t b nh nhân nhi m HCV c g i n xét nghi m t i phòng thí nghi m NK-Biotek n m 2008 trình t kín Trugene nh trình t úng o n ích mà h th ng Trugene s d ng vùng 5#-NC c a gi i genome HCV (4) Nhà lâm sàng hay nghiên c u ✷06 c cung c p thơng tin v trình t vùng 5#NC ã gi i phylogenetic c thơng tin r t q giá nghiên c u v góp ph n nghiên c u ngu n g c nhi m trùng hay nghiên c u ng nhi m HIV/HCV Hình 54 tóm t t qui trình phát hi n, nh l ng nh genotype HCV b ng k thu t RT real-time PCR ích vùng 5# NC c a b gene HCV r i sau ó gi i trình t tr c ti p s n ph m PCR m u xét nghi m xác nh genotype HCV Trong n m 2008, t ng k t 2000 nh genotype HCV th c hi n t i phòng thí nghi m NK-Biotek, chúng tơi nh n th t a s genotype c a HCV nhi m b nh nhân 1b (58%), k (17%) Bi u ó 6a 13 t ng k t s phân b genotype HCV 2000 m u huy t b nh nhân nhi m HCV c g i n xét nghi m t i phòng thí nghi m NK-Biotek n m 2008 Áp d ng PCR gi i trình t phát hi n t bi n kháng thu c c a HBV Hi n t i Vi t Nam, nh ti n b v k thu t sinh h c phân t c HBV làm c s ánh giá hi u qu i u tr ; phát ng c ng nh thu c có kh n ng i u tr b nh viêm gan virus B m n tính ln có s n th tr d dàng l a ch n, nên vi c i u tr nh l ng bác s c hi u cho b nh nhân viêm gan virus B m n tính ã ph bi n h n Tuy nhiên, i u tr c hi u b nh lý viêm gan virus B m n tính b ng thu c kháng virus m t i u tr lâu dài Chính v y nên HBV (virus viêm gan B, hepatitis B virus) có c h i ti p xúc lâu dài v i thu c kháng virus t o t bi n kháng thu c, t y n y sinh u c u ph i có xét nghi m phát hi n t bi n kháng thu c c a HBV, entecavir thu c th phát hi n y c ng c bi t i v i thu c nh lamivudine, adefovir c s d ng hi n t bi n kháng thu c nêu trên, n u ch n ti p c n real- time PCR hay PCR-RFLP ch có th phát hi n c r t t bi n kháng thu c c a HBV có q nhi u bi n th c a HBV ã làm cho vi c thi t k probe phát hi n t bi n hay thi t k v trí nhi u H n n a cho RFLP phát hi n nhi u enzyme c t gi i h n nh n di n b khó kh n r t n hi n nay, y v n ch m i báo cáo có real-time PCR PCR- t bi n kháng lamivudine hai v trí 180 204 ó t bi n n a khơng ch t o cho virus kháng lamivudine, mà c adefovir entecavir n a Ch n ti p c n nh v y ch c ch n s khơng áp ng ✸07 c th c t Do v y phòng thí nghi m NKu c u tìm t bi n kháng thu c c a HBV BIOTEK cơng ty Nam Khoa ã ch n m t ti p c n khác d a ph ng ti n trang thi t b hi n i ang có PCR khu ch i an c hi u 550bps vùng gene preS c a HBV cơng ty, ó ti p c n PCR gi i trình t m t o n DNA dài 550 bps vùng gene preS hi n Tìm t bi n kháng thu c: gi i trình t tr c ti p s n ph m PCR 550bps t vùng gene preS làm xét nghi m phát t Lamivudine, bi n kháng Adefovir Entecavir Xét nghi m d a ti p c n hi n ang ABI 3130XL (16 capillaries) c nhi u KẾT QUẢ (24 sau nhận mẫu) nhà lâm sàng nghiên c u y h c tin c y nh u i m sau: (1) Phát hi n c h u h t v trí t bi n có th x y gây TAATTTGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATC TTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATC AACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGG AAATTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTA GTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAAC ATCTTGAATCCCTTTTTACCGCTGT kháng lo i thu c trên; (2) V i nh y c m c a thi t b gi i trình t hi n (sequencer ABI 3130XL, gi i hai chi u), khơng ch t t c i m t bi n k u c gi i Genotype Phát hi n Kháng Lamivudine I169T V173L L180M A181T T184S M204I V207M/I Q215S n, mà c tình tr ng heterozygote c a t bi n/hoang d i v n c phát hi n; (3) V i trình t gi i c, k t qu xét nghi m cung c p thơng tin m t cách xác v genotype c a HBV mà khơng c n ph i có ch nh xét nghi m Genotype C t bi n KQ K K Có K K Có K K Kháng Adefovir L80V/I S85A V84M A181V/T V214A Q215S N236T KQ K K K K K K K Kháng Entecavir T184G S202I M250V KQ K K K Hình 55: Qui trình xét nghi m phát hi n t bi n kháng thu c xác nh genotype c a HBV b ng k thu t PCR gi i trình t m t an DNA 550 bps gene PreS c a HBV t lâm sàng Hình 55 mơ t qui trình xét nghi m PCR gi i trình t gene preS phát hi n hi n t bi n t bi n kháng thu c xác nh genotype HBV, ó k t qu phát c trình bày m t b ng li t kê v trí ✹08 t bi n t bi n kháng lamivudine, adefovir entecavir ã trí t bi n c nhà nghiên c u ghi nh n t t c v u n m gi i trình c gi i ❄❇❀✻❁ 60 Trong n m 2008, phòng thí nghi m 50 NK-Biotek c a cơng ty Nam Khoa ã th c 40 hi n c 455 xét nghi m PCR gi i trình 30 t vùng gene PreS c a HBV, k t qu cho 20 th y có 10 n 69% tr ng h p thu c 204 207 K t qu v trí hai v trí 204 207, 6.5% ❃❀❄✼ 204+207 ❅❀❇❄ 204+180 204+180+207 KhôngĐB Bi u 14: S phân b t l v trí lamivudine phát hi n c có genotype khác Có 46% phát hi n có 204, 9% ❁❀❂✼ genotype B 31% genotype C, khơng t bi n kháng lamivudine v i 30% ✻✼❀❁✼ 204 180, 0.5% c trình bày bi u t bi n kháng t bi n c 204, 180 14 Áp d ng PCR gi i trình t phát hi n t bi n precore/ promoter genotype HBV Trong q trình ph n ng v i áp ng mi n d ch t b nh nhân, HBV có th b t bi n precore t bi n core promoter t bi n precore t bi n t i v trí nucleotide 1896 t G thành A (G1896A) làm cho codon TGG tr thành TAG m t stop codon t bi n ã làm cho HBV khơng th t ng h p th máu b nh nhân, khơng phát hi n v i HBeAb [+] ây m t c HBeAg Do v y, c HBeAg mà HBV-DNA v n t n l i t bi n r t quan tr ng c n ph i nhân s có nguy c cao vào x gan hay ung th gan, c phát hi n b nh c bi t phát hi n c thêm t bi n core promoter t i hai v trí nucleotide 1762 1764 (A1762T, G1764A) Khi b nh nhân b phát hi n mang HBV có thu c kháng virus su t t bi n ph i i Chính t m quan tr ng c i u tr b ng i v i lâm sàng nh v y nên th i gian qua phòng thí nghi m NK-BIOTEK & cơng ty Nam Khoa ã xây d ng c k thu t PCR gi i trình t vùng gene core bi n precore làm xét nghi m phát hi n t t bi n core promoter khơng ch v y, cho bi t thêm v genotype HBV Hình 56 minh h a qui trình Xét nghi m hi n ang c nhi u nhà lâm sàng nghiên c u y h c quan tâm tin c y Trong n m 2008, phòng thí nghi m NK-Biotek cơng ty Nam Khoa ✺09 ã th c hi n 134 m u xét nghi m t bi n precore core promoter c a HBV b nh nhân b bác s tr nghi ng có i u t bi n precore/core promoter K t qu cho th y có phát hi n bi n khác nhau, có th ch ch promoter, có th PCR khu ch i an c hi u 250bps vùng gene core c a HBV n 73% t bi n v i nhi u ki u precore, có th u c u tìm t bi n precore/promoter c a HBV B nh nhân có HBeAg- HBeAb+, HBVDNA+, ALT b t th ng t Tìm t bi n precore/promoter: gi i trình t tr c ti p s n ph m PCR 250bps t vùng gene core t bi n ❍■❏ t bi n core ABI 3130XL capillaries) hay CEQ8000 (6 capillaries) t bi n c promoter K T QU (24 gi sau nh n m u) core promoter Các thơng tin s r t h u d ng nhà y h c có th nghiên c u sâu h n v m i liên h v i lâm sàng, b nh h c sinh b nh h c Bi u ki u 15 trình bày t l phân b t bi n phát hi n c PCR gi i trình t phát hi n t bi n kháng rifampicine INH c a M tuberculosis T n m 1996, chúng tơi ã b t u Hình 56: Qui trình PCR gi i trình t phát hi n t bi n precore/promoter tri n khai k thu t PCR phát hi n M tuberculosis cho n hi n xét A1762T nghi m PCR phát hi n M tuberculosis chúng tơi phát tri n ã nhà y h c n 1% G1896A 6% A1762T G1896A 36 26% c Khơng t bi n 27 19% c ch p nh n nh nh y c m r t cao so v i kh o sát tr c ti p ni c y V i PCR, k t qu phát hi n M tuberculosis có th n tay nhà G1896A A1762T, G1764A lâm sàng ch 24 gi sau g i m u i xét nghi m Nh 28 20% u i m nhanh chóng 38 28% A1762T, G1764A nh y c m nên có th nói cơng c PCR ã mang Bi u n m t l i ích khơng ❊❊❋ 15: T l phân b ki u t bi n precore/core promoter phát hi n c 134 m u xét nghi m ▲▼❖ 427 Leu Ser Gln Phe Met Asp Gln Asn Asn Pro Leu Ser Gly Leu Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG Pro CCG Leu CTA Val GTC / / Dele Leu TTG (3%) (3%) (9%) (1%) (1%) Tyr TAC Asp GAC Gln CAG Asn AAC Arg CGC Pro CCC Leu TTG Gln CAG Trp TGG Pro CCG (1%) (52%) (28%) Hình 57: Vùng nóng v i t bi n rpoB gene t l th ch i cãi l nh v c ch n ốn lao, v hi n ang kháng sinh ng xãy t qua cơng c vi sinh kinh i n M t v n c nhà y h c quan tâm làm th có th có vi khu n M tuberculosis v i th i gian ng n h n, v i ph c k t qu ng pháp vi sinh kinh i n k t qu kháng ch có th có sinh c sau h n tháng v i tháng c vi khu n m c mơi tr u c u PCR phát hi n MTB Tìm t bi n kháng Rifampicine INH có c ng ni c y tháng có k t qu kháng sinh Thơng tin v kháng sinh PCR khu ch i trình t c hi u ch a t bi n rpoB, katG, inhA PCR phát hi n MTB d a khu ch i trình t 249bp IS6110 mà bác s c n bi t nh t li u vi Gi i trình t phát hi n t bi n rpoB, katG inhA K t qu phát hi n MTB vòng 24gi khu n phân l p b nh nhân kháng v i thu c kháng có lao rifampicin, qu nh t cho khơng hay ch c coi hi u n hi n hay có th ti p t c trì nh cho b nh nhân th c cơng t bi n rpoB L430P S431G Q432K/L 433 ins TTC(phe : F) D435G/A/V 440 ins TCGGGGTTG H445N/D/Q/S/R/L/Y/F S450L L452P I480V kháng lao t bi n katG S315T có t bi n inhA C-15T K t qu kháng sinh MTB 72 gi sau l y m u àm rifampicine Tr c th c t òi h i này, phòng thí nghi m NK-Biotek n v R&D cơng ty Nam Hình 58: Mơ t qui trình PCR gi i trình t phát hi n t bi n kháng rifampicin INH c a vi khu n M tuberculosis tr c ti p t m u àm mà khơng ph i qua ni c y K t qu n tay nhà lâm sàng ch 72 gi sau l y m u àm ❑❑❑ Khoa ã nghiên c u th nghi m m t qui trình PCR gi i trình t khu ch m t vùng nóng c a gene rpoB c a M tuberculosis c t t c t bi n th ng x y t o cho vi khu n kháng có th phát hi n i c rifampicine (hình 57) Ngồi vùng nóng này, chúng tơi c ng ã thành cơng xây d ng m t qui trình phát hi n trí kháng INH b ng k thu t PCR gi i trình t gene katG t bi n th ng g p S315T gene inhA qui trình ã c chúng tơi áp d ng xác nh v trí phát hi n v t bi n C-15T Hi n phát hi n tr c ti p t bi n kháng thu c t b nh ph m mà khơng c n thi t ph i qua ni c y Hình 58 minh h a tóm t t qui trình c phòng thí nghi m NK-Biotek th c hi n ln k t qu kháng sinh ch 72 gi sau l y m u àm t b nh nhân Hi n chúng tơi ang ti p t c nghiên c u hi n Ofloxacin có th có thêm k t qu kháng sinh t bi n kháng thu c kháng lao khác nh có th sàng cu c chi n phát hi n MTB cho áp ng c m t cách y phát ethambutol, PAS, PZA, u c u n t nhà lâm u ch ng l i tình hình lao a kháng ngày tr m tr ng hi n ◗◗❘ [...]... NK 16s-F và NK 16s-R c o n DNA dài 527 bps ch a các trình t giúp phân bi t gi ng và lồi các vi khu n, phòng thí nghi m NK-Biotek và n v R&D c a cơng ty Nam Khoa ã xây d ng thành cơng qui trình PCR cho gene 16s rDNA và qui trình gi i trình t tr c ti p s n ph m PCR này nghi m NK-Biotek và nh danh vi khu n Thành cơng này ã giúp phòng thí n v R&D c a Nan Khoa th c hi n trong các xét nghi m d ch v và nghiên... Entecavir T184G S202I M250V KQ K K K Hình 55: Qui trình xét nghi m phát hi n t bi n kháng thu c và xác nh genotype c a HBV b ng k thu t PCR và gi i trình t m t an DNA 550 bps trên gene PreS c a HBV này t lâm sàng Hình 55 mơ t qui trình xét nghi m PCR và gi i trình t gene preS phát hi n các hi n t bi n t bi n kháng thu c và xác nh genotype HBV, trong ó k t qu phát c trình bày trong m t b ng li t kê các v trí... Có 46% phát hi n có 204, 9% ❁❀❂✼ 0 genotype B và 31% là genotype C, khơng t bi n kháng lamivudine v i 30% ✻✼❀❁✼ 204 và 180, và 0.5% c trình bày trong bi u t bi n kháng t bi n c 204, 180 và 14 Áp d ng PCR và gi i trình t phát hi n t bi n precore/ promoter và genotype HBV Trong q trình ph n ng v i các áp ng mi n d ch t b nh nhân, HBV có th b t bi n precore và t bi n core promoter t bi n precore là t bi... T QU (24 gi sau khi nh n m u) và core promoter Các thơng tin này s r t h u d ng các nhà y h c có th nghiên c u sâu h n v m i liên h v i lâm sàng, b nh h c và sinh b nh h c Bi u ki u 6 15 trình bày t l phân b các t bi n phát hi n c PCR và gi i trình t phát hi n t bi n kháng rifampicine và INH c a M tuberculosis T n m 1996, chúng tơi ã b t u Hình 56: Qui trình PCR và gi i trình t phát hi n t bi n precore/promoter... Tr c th c t òi h i này, phòng thí nghi m NK-Biotek và n v R&D cơng ty Nam Hình 58: Mơ t qui trình PCR và gi i trình t phát hi n các t bi n kháng rifampicin và INH c a vi khu n M tuberculosis tr c ti p t m u àm mà khơng ph i qua ni c y K t qu n tay các nhà lâm sàng ch 72 gi sau khi l y m u àm ❑❑❑ Khoa ã nghiên c u và th nghi m m t qui trình PCR và gi i trình t khu ch m t vùng nóng c a gene rpoB c a M... có hình d ng vi th hình que dài nh góc trên trái cho k t qu PCR và gi i trình t 28s rDNA nh bên d i, và t trình t này k t qu blast search trên ngân hàng gene NCBI cho k t nh danh Rhinocladiella atrovirens v i t ng ng 99% qu 3 ng d ng PCR và gi i trình t phát hi n, nh l ng và xác nh genotype HCV Phát hi n, ph i bi t tr là phát nh l ng và xác c khi cho ch nh genotype HCV là các thơng s mà bác s c n nh... m i m , ti n l i, và ít t n kém h n nh l ng HCV-RNA b ng xét nghi m RT-qPCR s d ng kit NK RT-HCVqPCR phát tri n m t gi i pháp tồn di n th c hi n c các u c u này c a bác s cùng m t lúc pháp s ó là gi i d ng RT real-time PCR phát hi n và nh l Xác nh genotype HCV: gi i trình t tr c ti p s n ph m HCVqPCR (#200bp trên vùng 5 NC) ng HCV-RNA trong m u huy t thanh b nh nhân và sau ó gi i trình t tr c ti p... khá t n kém vì giá thành c a kit này khá cao, k t qu có ơi khi khơng phân bi t Hình 54: Qui trình RT-realtime PCR và gi i trình t vùng 5 NC phát hi n, nh l ng và nh genotype HCV c subtype, và v i version c thì có s nh m l n gi a 6a và 1b; (2) N u s d ng k thu t gi i trình t vùng 5#NC c a HCV b ng h th ng gi i trình t kín Trugene c a Siemen (Bayer) dù r t c nhi u nhà y h c th a nh n, nh ng c ng s là... t , và quan tr ng nh t là ph i bi t h c h i và bi t h p tác gi a chúng ta v i nhau ng d ng cơng ngh gi i trình t t i phòng thí nghi m NK-Biotek Phòng thí nghi m NK-Biotek và n v R&D c a cơng ty Nam Khoa ã ng d ng khá thành cơng k thu t gi i trình t vào các d ch v ch n ốn và nghiên c u D i ây xin a ra m t s thành t u tiêu bi u 1 ng d ng k thu t PCR và gi i trình t Nh phát hi n khu ch i c m t c p m i... n di trên th ch và sau ó ó c nh l Ch ng b ng quang ph GenQuant c a Pharmacia, sau a vào ph n ng gi i trình t 2 chi u s d ng m i xi và m i ng PCR th c hi n trên b thu c th c cc a DTCS cycle sequencing kit! c a Becman Coulter ng trình ln nhi t c a ph n ng gi i trình t v i b thu c th trên là 30 chu k 96oC/20!-50oC/20!-60oC/4# S n ph m c a ph n ethanol, r i sau ó qu gi i trình t ng gi i trình t c t a b