hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM

hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BỘ MÔN THÚ Y

GIAO TRÌNH

Food and Animal Toxicology

AN 407C

Ly Thi Lien Khai, PhD

Cần Thơ, 3/2015 HƯỚNG DẪN THỰC HÀNH MÔN ĐỘC CHẤT HỌC ĐỘNG VẬT VÀ THỰC PHẨM

THỰC HÀNH ĐỘC CHẤT HỌC ĐỘNG VẬT VÀ THỰC PHẨM

Unit 1

Bài 1 Detection of the borax residues in fresh meat and animal

products

Xác định sự hiện diện của hàn the trong thịt và các sản phẩm của

thịt

1 Trang thiết bị và dụng cụ

- Lò nung, tủ sấy, tủ lạnh, cân kỹ thuật

- Bình tam giác, đũa thủy tinh, ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong, phểu thủy tinh, đĩa Petri, ống hút, chậu thủy tinh, nhiệt kế, cối, chày, dao, kéo,

và một số dụng cụ khác…

2 Hóa chất: Cồn, nước cất, HCl, H3BO3, H2SO4, CaCl2, CaO, methyl orange, phenolphtalein, malnitol …

3 Mẫu vật thí nghiệm:

Mẫu vật được lấy từ các chợ và siêu thị tại TP Cần Thơ bao gồm: thịt

bò, thịt heo, cá biển, chả lụa

4 Điều chế giấy thử hàn the

- Cắt tờ giấy lọc thành những mãnh có kích thước 6 x 1cm

- Hòa tan 1gram Curcumin vào 100ml cồn 96o lắc mạnh bình tam giác trong 5 phút, sau đó nhúng các mãnh giấy lọc vào dung dịch, sau đó lấy ra đem sấy khô (40oC), ta được giấy thử hàn the

Chú ý bảo quản giấy thử hàn the chỗ tối tránh ánh sáng

5 Tạo bảng so màu ước lượng hàm lượng hàn the (AOAC,1995)

- Pha dung dịch acid boric chuẩn:

+ H3BO3 1%: pha 1gram H3BO3 vào 100ml nước cất

+ H3BO3 2%: pha 2gram H3BO3 vào 100ml nước cất

+ H3BO3 4%: pha 4gram H3BO3 vào 100ml nước cất

+ H3BO3 8%: pha 8gram H3BO3 vào 100ml nước cất

- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: lấy 11 ống nghiệm loại 15ml, đánh số

từ 0-10 Lần lượt hút 0,00ml; 0,5ml; 1ml; 2ml; 2,5ml; 3,5ml; 4,5ml; 5ml

H3BO3 1% cho vào 8 ống nghiệm có số thứ tự tương ứng 0-7, kế đến cho lần lượt 5ml H3BO3 2%; 5ml H3BO3 4%; 5ml H3BO3 8% vào các ống nghiệm 8; 9;10 Sau đó pha loãng đến 10ml tất cả các dung dịch trong ống nghiệm bằng nước cất và cho tiếp vào mỗi ống nghiệm 0,7 ml HCl đặm đặc Các dung dịch này sẽ tương ứng với nồng độ H3BO3 là: 0,00; 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,5%; 0,7%; 0,9%; 1%; 2%; 4%; 8%

Nhúng lần lượt các tờ giấy thử hàn the đã được đánh số từ 0-10 vào trong dung dịch tương ứng với số thứ tự trên từng ống nghiệm Sau đó lấy tờ giấy thử ra để ráo và đem sấy ở nhiệt độ 30-40oC

4 Đọc bảng so màu giấy thử hàn the

Đọc bảng so màu giấy thử hàn the

Hàm lượng “ít” Hàm lượng “vừa” Hàm lượng “nhiều”

0,1-0,4% 0,5-0,9% 1-8%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0,0 0,1 0,2 0,4 0,5 0,7 0,9 1,0 2,0 4,0 8,0

% H 3 BO 3

Bảng so màu ước lượng hàm lượng hàn the

Bảng so màu ƣớc lƣợng hàm lƣợng hàn the theo thang điểm

5 Phương pháp quan sát mẫu theo cảm quan

- Trạng thái:

+ Độ đàn hồi: dùng đầu ngón tay ấn vào bề mặt khối thịt, nếu độ đàn hồi trở lại ngay là thịt tươi, nếu bề mặt thịt từ từ trở lại là thịt bắt đầu ôi, nếu thịt lỏm xuống là thịt ôi

+ Quan sát thịt ướt hay khô

- Màu sắc: thịt tươi thường có màu đỏ hồng, nếu:

+ Màu tái, rỉ nước, nhão, do thịt giết mổ lúc thú sốt

+ Sậm màu, săn cứng, do thịt giết mổ lúc thú mệt

+ Tái, vắt ra nước, do gia súc chết lâu rồi mới sẽ thịt

Picture 1 Beef with borate Picture 2 Beef without borate.

Picture 1 Beef with borate Picture 2 Beef without borate.

Picture 3 Pork with numerous level of borate

Hình 2 Điều kiện bảo quản thịt tại tại siêu thị (15-18°C).

-Mùi vị:

+ Thịt tươi thường có mùi vị bình thường

+ Thịt ôi: có mùi thối, hơi khét

+ Mùi khác thường: thịt có ướp hóa chất, kháng sinh, heo nọc…

Ngoài ra khi chúng ta dựa vào cách thức bảo quản tại cơ sở bán chúng ta cũng có thể đánh giá được phần nào chất lượng thịt

6 Phương pháp phân tích định lượng hàn the

Theo phương pháp bảng so màu ước lượng hàm lượng hàn the (AOAC,1995)

Nêu nhận định về tác hại của hàm lựơng hàn the vừa phân tích đối với sức khỏe người tiêu dùng

Phương pháp xác định hàn the (Borax) trongTP

Cần que thử, cồn 960

, HCl 4N Cách làm: cân 10 g mẫu, nghiền nát thêm 20 ml nước cất và 5 ml HCl 4N Sau đó dùng que thử nhún ngậm sâu vào dd mẫu cần thu63, sấy khô

Đọc kết quả, định lượng dựa vào thang điểm ước lượng hàm lượng hàn the có trong TP

Bài 2 Khảo sát dư lượng kháng sinh trong thịt gia súc, gia cầm,

Sữa

Detection of the anitibiotic residues in fresh meat, poultry and milk

Khảo sát dư lượng kháng sinh trong thịt gia súc, gia cầm,

Dùng phương pháp FPT (Four Plate Test) (Heitzman, 1994)

Các chủng VK: Bacillus cereus, E coli

Môi trường: NA (BHI, hay TSA), PCA

Đĩa petri đường kính 90mm

Mẫu 100g thịt nạc , bảo quản lạnh Nếu chưa xét nghiệm ngay phải bảo quản

Bảng 1 Vi khuẩn nuôi cấy 35o

C/24h, (5x10 4CFU/ml) Kháng sinh

Penicillin B subtilis No 10663, 6,2 30oC/18h

Cách pha chế mt kiểm tra dư lượng kháng sinh:

Môi trường đã pha và hấp vô trùng, nguội 45oC cho 1 thể tích huyễn

dịch vk (bào tử) đổ 5 ml mt vào đĩa petri

Mẫu thịt kiểm tra cắt miếng tròn, nhỏ dày 2mm, đường kinh 8mm bằng

cây gắp mẫu vô trùng chuẩn

Mỗi đĩa đặt 6-8 lát mẫu thịt/ đĩa (Oboegbulem và fidelis, 1996) Ở giữa

đĩa đặt 1 đĩa kháng sinh chuẩn

Ủ đĩa ở nhiệt độ thích hợp và sau 18-24h đọc kết quả: Nếu vòng vô

khuẩn ≥ 2mm kết luận mẫu thịt dương tính: có tồn dư kháng sinh

Bài 3 Phân lập- định danh nấm Aspergillus flavus, A fumigatus có

trong thức ăn gia súc – Khảo sát độc lực của aflatoxin trên vịt con

Isolation of Aspergillus flavus, A fumigatus from feed Aflatoxin

examination in laboratory animal –baby duck

Đĩa KS chuẩn

Mẫu thịt

Khuẩn lạc

Aspergillus

fumigatus

Khuẩn lạc Aspergillus niger

Bào tử

Aspergilus

Khuẩn lạc

Aspergilus flavus

Giống Aspergillus

Hình 2 Khuẩn lạc Aspergillus niger

Khuẩn lạc Aspergillus fumigates

Hình 3 Khuẩn lạc Aspergillus fumigatus

Sau khi xác định thức ăn có nấmđể kiểm tra các nấm Aspergillus quan sát được có

chứa độc tố aflatoxin không dùng mẫu thức ăn nầy cho vịt con ăn xem các biểu hiện bệnh lỳ lâm sàng trên vịt thí nghiệm Theo dõi trong 3-5 ngày Ghi kết quả và so với

triệu chứng ngộ độc nếu có biểu hiện bệnh lý

Bài 4

Khảo sát sự ngộ độc do các chất độc từ thực vật – Nitrate

Determine the nitrate concentration in vegetables, plant for animal feed, and human

Chất độc nitrate thường thấy có hàm lượng nhiều, phổ biến nhất là thực vật hay nước, nước thảy chăn nuôi và hóa chất

Ngộ độc cấp tính khi nitrate chứa trong cỏ ở nồng độ > 1% (cỏ khô) hay 1.500 ppm trong nước

Ở nồng độ 2.000ppm nitrate trong nước cho bò ăn 10% P /17 ngày không gây ngộ độc cấp tính Nhưng liều 3.000ppm cho bò ăn 3 ngày làm bò chết do nhiễm độc cấp tính (Dollahite và Rowe, 1974) Nồng độ 2-4% gây độc cấp tính cho đv nhai lại Triệu chứng: xảy ra 30’-4h sau khi bò uống hay ăn cỏ nhiễm nitrate từ 5-8 ngày Bò chảy nước bọt, ói, tiêu chảy và đau bụng Bò đi tiểu nhiều do nước nhiễm nitrate, thiếu oxy huyết Bò khó thở, mạch ỵếu, máu có màu nâu hay socola Run cơ, suy kiệt, mất điều vận Bò không di chuyển nếu ép buộc mới cử động Vật chết trong 12-24h

Chẩn đóan: máu có màu nâu do tạo ra methemoglobin, trị methylene blue 2mg/1 lb

P, cho uống dung dịch 2-4%

Xét nghiệm nồng độ nitrate từ chất chứa trong dạ dày, dạ cỏ, huyết tương, nước tiểu,

cỏ, nước

Phương pháp kiểm tra nitrate có trong nước hay thực vật là lá rau, cây, cỏ

Cho 0.5g diphenylamine vào 20ml nước

Thêm acid sulfuric cho đến 100ml Làm lạnh và giữ trong chai màu nâu

Hòa Stock solution v/v 80% sulfuric acid chất thử

Nhỏ 1 giọt chất thử trên bề mặt cắt của mẫu cây, lá cần kiểm tra

nitrate

Bài 5 Xác định độc tố vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Bacteria toxins detection by molecular technique

Sample collection : diarrhea feces samling from pilet/poultry

+ Isolation of Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC)

+ Determination of toxic genes STb from ETEC caused piglet diarrhea

by PCR analysis – Electrophoresis

+ Determination of these toxins in animal laboratory-mice

+ Results analysis

Khảo sát vi khuẩn gây bệnh trên gia súc, gia cầm - Vi khuẩn

Escherichia coli

Là nhóm vsv tồn tại trong đường tiêu hóa, trở thành nhân tố gây bệnh cho người và động vật khi có điều kiện thuận lợi

- Qua bài thực tập giúp sinh viên nắm vững kỹ thuật và thao tác mổ khám, định bệnh, xác định nguyên nhân nghi bệnh

- Chẩn đóan chính xác nguyên nhân gây ngộ độc là do độc tố của vsv

- Có thể thực hành đưa ra phát đồ Phòng trị ngộ độc

- Khám bằng ngũ quan, sờ nắn, mổ khám bệnh tích

- Học và nắm vững toxin của vsv gây bệnh và chết trên con vật mổ khám bằng cách lấy mẫu:

+ Nuôi cấy phân lập

+ Định danh xác định chủng VK gây bệnh

+ Xác định các gene độc lực

+ Khi đã phát hiện VK E coli trên mẫu bệnh có độc lực, muốn biết

chính xác độc tố đó đã gây bệnh và làm chết con vật tiến hành thí nghiệm tiếp theo trên động vật thí nghiệm

+Tiêm độc tố vào động vật thí nghiện cảm thụ Do đó cần biết rõ : loại độc tố và động vật cảm thụ, cách tiêm, đường tiên truyền

+ Quan sát diễn tiến bệnh thí nghiện trên động vật thí nghiệm: ghi nhân, hình ảnh minh họa

+ Thu thập mẫu bệnh, tiến hành phân lập để xác định lại xem có đúng

VK tiêm thử nghiệm đã làm động vật thí nghiệm bệnh và chết, cách tiến hành như mẫu bệnh phẩm đã phân tích ở trên

Thực hành trên bệnh tiêu chảy heo/trên gà bệnh do ETEChay (hay bất cứ bệnh nào nhóm thực tập có thể thực hiện được bài thực tập của mình cho kết quả đúng và đủ

1 Lấy mẫu phân heo con tiêu chảy/ gà bệnh sau khi quan sát lâm sàng xác

định do E coli nhóm ETEC

2 Phân lập- Định danh theo qui trình thường qui đã học cho E coli

Mẫu bệnh phẩm là phân, cấy trực tiếp trên MC, quan sát hình thái khuẩn lạc đậc trưng của vk trên MC Định danh bằng phản ứng sinh hóa

Chọn và cấy thuần ≥ 10 khuẩn lạc đề tiến hành bước tiếp theo xác định gene đợc tố

Khuẩn lạc E coli trên môi trường MC

Bang 2 Các phản ứng sinh hóa định danh vi khuẩn E coli (Cowan, 2003)

Vi khuẩn

Đặc tính sinh hóa

KIA

Indole MR VP Citrate DĐ Glu Lac H 2 S Gas

Glu: Glucose Lac: Lactose VP: Voges

proskauer MR: Methyl red DĐ: di động;

(+): dương tính; (-): âm tính

Phản ứng sinh hóa định danh vi khuẩn E coli

3 Xác định gene độc tố của VK, do dùng động vật thí nghiệm là chuột

bạch nên độtc tố gây bệnh có trong E coli nhạy cảm trên chuột là STb

(STa, STb) theo quy trình chi tiết sau:

QUY TRÌNH THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR XÁC ĐỊNH GENE ĐỘC

LỰC (ST: STa, STb) CỦA VI KHUẨN E coli trong nhóm ETEC

1 Tách chiết DNA từ chủng vi khuẩn

Vi khuẩn E coli ETEC sau khi được định danh bằng phản ứng huyết

thanh học được nuôi cấy trên môi trường TSA để tiến hành ly trích DNA

Sau khi tăng sinh vi khuẩn trên TSA ở 37oC, 24 giờ, thu sinh khối cho vào eppendorf chứa 1 ml nước tinh khiết không chứa DNA, hòa tan rồi đun sôi cách thủy ở 100oC trong 10 phút

Tiến hành ly tâm huyễn dịch trong eppendorf sau khi đun cách thủy với vận tốc 10.000 vòng trong 15 phút Sau khi ly tâm, thu lấy dịch trong bên trên phần cặn lắng, đây chính là DNA template cho quá trình PCR Trữ DNA template ở -20o

C

2 Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Để xác định gene mã hóa các độc lực STa, STb của vi khuẩn E coli ,

kỹ thuật PCR được sử dụng để xác định các đoạn gene mã hóa các thành phần này như bảng 1

Bảng 3: Thành phần hỗn hợp cho một phản ứng PCR (Promega, USA)

Đối với mẫu đối chứng âm, thay thế DNA template bằng nước cất vô

trùng; đối với mẫu đối chứng dương: sử dụng DNA template của vi khuẩn E

coli đã xác định dương tính với các gene độc lực trên

Trình tự nucleotide và chu trình nhiệt của các đoạn primer xác định các

gene độc lực Sta, STb của vi khuẩn E coli được trình bày qua Bảng 2

3 Điện di và nhuộm sản phẩm PCR

Chuẩn bị gel agarose 1,5%: cân 1,5 g thạch cho vào 100 ml dung dịch TAE 1X, lắc đều và đun hòa tan thạch Để thạch nguội khoảng 70oC rồi đổ khuôn tạo bản gel

Sau khi gel đã đông đặc, đặt bản gel vào máy điện di có dung dịch đệm TAE 1X, dùng micropipette cho các sản phẩm PCR vào các giếng thạch

Chạy điện di các sản phẩm PCR ở hiệu điện thế 100v trong vòng 60 phút

Sau khi kết thúc điện di, nhuộm bản gel bằng dung dịch ethidium bromide (10 mg/ml) trong 30 phút rồi rữa bằng nước cất trong 15 phút Sau đó, quan sát và chụp ảnh gel đã nhuộm dưới tia UV

Xem xét sự hiện diện của các vạch gene trên ảnh chụp của bản gel để xác định sự hiện diện gene mã hóa các độc lực LT, STa, STb, EAST1, eae

4 Tiêm truyền cho động vật thí nghiệm là chuột bạch theo quy trình hướng dẫn của GVHD của PTN

5 Theo dõi ghi nhân kết quả - Mổ khám hay lấy mẫu phân tiêu chảy nếu chuột không chết đem nuôi cấy phân lập

6 Phân lập -Xác định Vk E coli

13

Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định gene STb (279 bp) của vi khuẩn E coli

ETEC

Giếng 1: Ladder (100bp) Giếng 7: ST62a (+) Giếng 2: Possitive control STb (+) Giếng 8: ST32a (+)

Giếng 3: Negative control STb (-) Giếng 9: ST69a (-) Giếng 4: ST65a (-) Giếng 10: ST61b (+)

Giếng 5: ST68d (-) Giếng 11: ST61g (-)

Giếng 6: ST60-1 (+) Giếng 12: ST65a (-)

(bp) Nhiệt độ ( o C)

Thời gian (phút)

Chu

STa

(estA)

GCTAATGTTGGCAATTTTTATTTCTGTA AGGATTACAACAAAGTTCACAGCAGTAA 190

Franck et al., 1998

94 0:30

25

50 (52) 0:45

70 1:30

70 10 1

STb

(estB)

GCCTATGCATCTACACAATC TGAGAAATCGACAATGTCCG 279

Vu-Khac H et al.,

2007

94 1

30

55 1

72 1

94 0:30

25

50 (52) 0:45

70 1:30

70 10 1

Bảng 4: Trình tự nucleotide và chu trình nhiệt các primer đƣợc sử dụng để xác định các gene

độc lực của E coli ETEC

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12

500 bp

279 bp

14

Phương pháp xác định tính đề kháng với kháng sinh của các chủng ETEC

Kiểm tra tính đề kháng của ETEC với các loại kháng sinh được tiến hành theo phương

pháp khuếch tán trên thạch của Bauer et al (1966)

Tính nhạy cảm kháng sinh được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trên thạch theo phương pháp Bauer (1966), kết quả đo đường kính vô khuẩn dựa trên tiêu chuẩn của viện tiêu chuẩn lâm sàng và phòng thí nghiệm (CLSI, 2012) đối với 7 loại kháng sinh thông dụng trong thú y do công ty Nam Khoa sản xuất

Môi trường MHA thử kháng sinh đồ được đổ vào đĩa petri vô trùng (25ml/đĩa) Bề mặt đĩa được làm khô trong tủ sấy trước khi sử dụng

Huyễn dịch vi khuẩn được chuẩn bị bằng cách cấy ria những khuẩn lạc đã được thử phản ứng sinh hóa và định danh lên môi trường NA ủ ở 37oC/24h, sau đó dùng que cấy chấm một ít khuẩn lạc hòa tan vào 2ml nước muối sinh lý 9o/oo Lắc đều bằng vortex rồi điều chỉnh độ đục vi khuẩn để đạt mật độ 108 CFU/ml (so với ống chuẩn Mc Farland 0.5)

Phương pháp thực hiện kháng sinh đồ (Bauer,1966)

Canh

khuẩn

Bảng tiêu

chuẩn

Ủ 37o

C/24h

Đo đường kính vòng vô khuẩn

Que tăm bông

Môi trường MHA

Đĩa kháng sinh