Nghiên cứu chiết xuất hóa học, dược lý học hoạt chất có tác dụng diệt tinh trùng và kháng nấm bệnh của quả cây du trà (camellia (sp ) họ theaceae nhằm làm thuốc hạn chế sinh s

Chơng trình nghiên cứu khoa học khoa học công nghệ báo cáo kết nghiên cứu Đề tài: Nghiên cứu chiết xuất hoá học, dợc lý học hoạt chất có tác dụng diệt tinh trùng v kháng nấm bệnh du trà (Camellia (Sp.) họ Theaceae) nhằm làm thuốc hạn chế sinh sản, thuốc phụ khoa góp phần phục vụ mục đích bảo vệ sức khoẻ sinh sản phụ nữ & KHHGĐ Mã số đề tài: 511402 Giai đoạn: 2002-2005 Thuộc chơng trình nghiên cứu KHCBNN Chủ nhiệm đề tài: GS TSKH Phạm Trơng Thị Thọ 6126 29/9/2006 hà nội - 2006 Cán tham gia đề tài 511402 STT Họ tên Phạm Trơng Thị Thọ Học vị Cơ quan GS.TSKH Viện dợc liệu Nhiệm vụ Chủ nhiệm đề tài Phân tích Phân tích Tiêu chuẩn Sinh hoá Bào chế Bào chế Viện phó VDL Theo dõi quản lý đề tài Viện Dựoc liệu Viện Phụ sản Thử tác dụng (test invitro) Viện Phụ sản Viện y học dân tộc Thử tác dụng (test invivo) Độc tính mãn, độc tính sinh sản Viện da liễu TW Thử kháng nấm ĐHSP Hà Nội Đào tạo sinh viên, thạc sỹ ĐHBK Hà Nội Trung tâm KHTN Nghiên cứu CN quốc gia hoá học 10 11 12 13 14 Đinh Thị Thuyết Nguyễn Kim Bích Nguyễn Thị Phơng Nguyễn Minh Phơng Phạm Thanh Trúc Mai Lê Hoa Nguyễn Duy Thuần Nguyễn Minh Châu Trần Thu Hà Nguyễn Thanh Thuỷ Trần Lu Vân Hiền Lê Hồng Vân Nguyễn Thị Hảo Dợc Sĩ CKI Dợc Sĩ Bác Sĩ TS DS TS DS TS DS Thạc Sỹ Y sỹ PGS TS Dợc Sĩ KTV 15 Lê Thị Phơng Bác sỹ 16 17 18 Lê Thị Anh Đào Nguyễn Minh Tú Trần Văn Lộc PGS TS TS ThS 19 20 Đào Đức Thiện Dơng Ngọc Tú Cử nhân TS Mục lục Số TT 10 11 12 13 14 15 Nội dung Lời nói đầu Giới thiệu vấn đề Các kết nghiên cứu A Những nghiên cứu hoá học B Những nghiên cứu dợc lý - Tác dụng hoạt chất Sf lên tinh trùng (Test invitro) - Tác dụng hoạt chất Sf lên tinh trùng (Test invivo) - Xét nghiệm vi thể - Liều độc LD50, liều độc bán trờng diễn - Tác dụng kháng nấm C Thăm dò nghiên cứu dạng bào chế D Các tiêu chuẩn sở - Nguyên liệu - Hoạt chất Sf - Thẩm định tiêu chuẩn hoạt chất Sf viện kiểm nghiệm quốc gia E Các tài liệu khác - Thông báo cục sở hữu trí tuệ chấp nhận đơn đăng ký sáng chế - Nhận xét phản biện - Giấy xác nhận hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học Mã số 511402 khoa học công nghệ - Giấy xác nhận hợp tác công ty dợc Hậu Giang Kết luận Lời cảm ơn Các tài liệu tham khảo Phần phụ lục Bìa sách 101 thuốc với sức khoẻ sinh sản phụ nữ NXB KHKT 2001 Bài báo thứ Contribution to the study on chemistry and biological activity of Saponin extracted from the seed of Du Tra tree growing in Vietnam 10th Asian Chemical Congress, 10 ACC 8th Eurasia Conference on Chemical Sciences Eu As C2S Luận văn sinh viên Phạm Quang Huy ĐHSP 6/2003: Bớc đầu tìm điều kiện tối u để tách saponin từ Sở dầu (Camellia oleifera Abel) Bảo vệ ngày 10/6/2003 ĐHSP HN đạt xuất sắc Luận văn Thạc sĩ ĐInh Ngọc Thức, ĐHSP tháng 11 năm 2003: Bớc đầu nghiên cứu số thành phần hoá học Sở Dỗu Nghệ An (Camellia drupifera (Lour) Pierre Bảo vệ ngày 10/11/2003 ĐHSP HN đạt loại giỏi The biological subsstance extracted from Camellia sp growing in Vietnam.Tạp chí dợc liệu tập số 2004 trang 185-187 Trang -2 -9 10 -22 10 -14 15- 18 19 21 21 -22 22- 26 26- 27 28- 35 36- 40 41 42- 43 44- 46 47 48 49 50 51 52- 57 58 59 60- 63 16 21 Tác dụng hoạt chất Sf từ loài Camellia (sp.) lên tinh trùng ngời Những vấn đề nghiên cứu ttrong khoa học sống Hội nghị toàn quốc 2004 28.10.2004 Học viện Quân Y Bản số liệu gốc phân tích tinh dịch Thử tác dụng Sf (test in vitro) Phân tích tinh dịch; so sánh với tác dụng nớc muối sinh lý; tinh dịch + nớc muối sinh lý; tinh dịch + nớc muối sinh lý +hoạt chất Study of spermicical effect in vitro on human spermatozoa and in vivo locally applied in the vagina of rat and reproductive toxicity of the active product Sf extracted from Camellia sp Theacea growing in Vietnam RSCE 2005 (Regional Symposium on Chemical Engineering) New Trends in Technology Towards Subtainable Development Proceedings, November 30 December 2, 2005 pp 346-353 Nghiên cứu tác dụng diệt tinh trùng độc tính sinh sản hoạt chất Sf tách đợc từ Du Trà Camellia sp họ Theacea mọc Việt nam Báo cáo Hội nghị KHCN kỷ niệm 45 năm ngày thành lập Viện Dợc Liệu 1961-2006 Kết thử LD50 hoạt chất Sf suy dợc liệu 22 Khẳ hạn chế sinh sản động vật thí nghiệm Sf 23 25 Khẳ phục hồi sinh sản chuột sau ngừng dùng hoạt chất Sf Độc tính sinh sản hoạt chất Sf chuột mẹ chuột hệ F1 Kết thử độc tính bán trờng diễn Sf 26 Các phiếu xét nghiệm 27 Quy trình sản xuất viên đặt âm đạo Camellia 28 Quy trình sản xuất kem Camellia 17 18 19 20 24 64- 68 69- 85 86- 118 119128 129132 133135 136141 142 143144 145149 150162 168173 174178 Lời nói đầu I Giới thiệu vấn đề Cho đến nay, có nhiều tài liệu giới thiệu thuốc Việt Nam dới nhiều hình thức phong phú sinh động Song, cha có tài liệu đề cập riêng đến thuốc có tác dụng hạn chế sinh sản cách có hệ thống theo kinh nghiệm dân gian sở nghiên cứu khoa học cha có dạng thuốc hạn chế sinh sản thích hợp, đợc bào chế từ nguồn dợc liệu sẵn có nớc Trên sở kết nghiên cứu đề tài "Sàng lọc thuốc có tác dụng kế hoạch hoá gia đình" Uỷ ban Quốc gia dân số kế hoạch hoá gia đình - năm 1996-1997; Đề tài: "Sàng lọc thuốc hạn chế sinh sản nam nữ" thuộc chơng trình nghiên cứu khoa học nhà nớc năm 1999-2000 phần kết đợc báo cáo Hội nghị Châu lần thứ thuốc, hơng liệu hợp chất thiên nhiên khác (ASOMPS IX) tổ chức Hà Nội năm 1998; Hội nghị khoa học công nghệ hoá hữu lần thứ Quy Nhơn năm 1999; Hội thảo sinh học Quốc tế Hà Nội năm 2001 Một số kết đợc giới thiệu tạp chí nớc Chúng tập hợp kết lại, kết hợp với việc siêu tầm thuốc theo kinh nghiệm dân gian cách chọn lọc tham khảo công trình nghiên cứu nớc ngoài, để biên soạn "101 thuốc với sức khoẻ sinh sản phụ nữ" (NXB KHKT 2002) Từ 101 thuốc, chọn có tính khả thi làm đối tợng nghiên cứu cho đề tài Đó Dutrà(trà mai, chè dầu, sở) tên khoa học Camellia drupifera (lour ) Piere Camellia obifera C Abel họ Theaceac Cây Dutrà vài loại đợc chọn làm đối tợng trồng rừng phòng hộ (trong triệu rừng) để chống xói mòn phủ xanh đồi trọc Cho đến nay, diện tích rừng Dutrà lên đến 7500 ha, tập trung tỉnh Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thanh Hoá, Nghệ An- Rừng khép tán cho thu hoạch Mùa thu hoạch từ tháng 12 hàng năm Một rừng Dutrà vụ cho thu hoạch từ - Một cho khoảng 240 kg dầu béo khoảng 500 kg bã khô dầu Thực tế, đa số ngời trồng rừng cha biết tận dụng khai thác nguồn tài nguyên này, nên đói nghèo, có chặt phá rừng làm ảnh hởng đến môi trờng Nói đến Dutrà ngời ta nghĩ đến việc khai thác dầu béo từ nó, nhng phần bã khô dầu lại sau ép dầu cha đợc tận dụng, có nơi ngời ta vứt bừa bãi bã khô dầu xuống ao hồ để giết cá, điều làm ô nhiễm môi trờng nớc nuôi tôm Theo số tài liệu tham khảo nớc cho biết, dầu béo có chứa lợng Saponin, dầu cần phải xử lý ăn đợc Trong bã khô dầu có chứa hàm lợng Saponin tơng đối cao, nhng cha có tài liệu giới thiệu rõ chứng minh đầy đủ tác dụng hạn chế sinh sản Chính vậy, đề xuất đề tài:"Chiết xuất hoá học, dợc lý học hoạt chất có tác dụng diệt tinh trùng kháng nấm bệnh Dutrà (một loài Camellia- Họ Theaceac) nhằm làm thuốc hạn chế sinh sản, thuốc phụ khoa, góp phần phục vụ mục đích bảo vệ sức khoẻ sinh sản phụ nữ & KHHGĐ Đề tài thuộc chơng trình nghiên cứu KHCBNN - Hớng khoa học tự nhiên Mã số đề tài 511402 - giai đoạn 2002 - 2005 Đề tài khoa học nêu đợc Hội đồng khoa học ngành Hoá học, Hội đồng khoa học tự nhiên đánh giá kết thực loại : Đạt II Các kết qủa nghiên cứu A- Những nghiên cứu hoá học 1- Phân tích sàn lọc sơ hoá thực vật bã khô dầu Dutrà Dùng phản ứng định tính với thuốc thử đặc hiệu để xác định nhóm chất hoá học có bã khô dầu Dutrà Kết ghi bảng Bảng1: Các nhóm chất hoá học bã khô sở Nhóm chất Thuốc thử Kết Ankaloit Dragendoff Flavonoit Xianidin ++ Tanin FeCl3 ++ Cumanrin Axít & Kiềm - Glucozit tim Keller-Kliani - Saponin Tạo Bọt Sterol Liberman-buchardart - ++ - Kết thử định tính cho thấy bã khô sở Dutrà có chứa chủ yếu Saponin, Flavonoit, Tanin 2- Sơ đồ chiết bã khô Dutrà theo độ phân cực dung môi Bã khô dầu Dutrà n-hexan CHCl3 MeOH Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn a/ Khảo sát phân đoạn1: Phân đoạn n-hexan có chứa nhiều lipít nhiều axít béo tự do: Dung dịch làm màu nớc Brôm, chứng tỏ dịch chiết có axít béo không no, điều phù hợp với tài liệu dầu sở gluxrít axít oleic, linoléic, stearic b/ Khảo sát phân đoạn (CHCL3): Phân đoạn đợc xử lý qua sắc kí cột SiO2 Hệ dung môi theo tỉ lệ tăng cực dần phân đoạn thứ 19, Hệ dung môi CHCl3 : MeOH (9:1) thu đợc chất, chất kết tinh lại axêton, màu vàng sáng - điểm nóng chảy đC = 2600 - 2620 * Sắc kí lớp mỏng SiO2 Hệ dung môi CHCl3 : MeOH (3:1) thuốc 1/ Vanilin/H2SO4 2/ Boric acid/oxalic acid Sắc kí đồ vết rõ màu vàng cam Rf = 0,44 - Chất đợc ký hiệu Kf * Sắc ký lớp mỏng SiO2 Xử lý phân đoạn cho qua cột đảo pha với chất mang LH20, dung môi rửa MeOH - Hệ dung môi: CHCl3 : MeOH : H2O (65:35:5) - Hơ nóng màu hồng Sắc ký đổ cho thấy phân đoạn có chứa nhóm chất flavonoit Chất ký hiệu Kf có Rf tơng đơng với nhóm b'/ Xác minh cấu trúc hoạt chất Kf từ phân đoạn CHCl3 bã Dutrà Bằng phơng pháp vật lý đại nh: Hồng ngoại (IR); Phổ tử ngoại (UV); Phổ cộng hởng từ hạt nhân proton (1H NMR); Phổ DEPT-90; Phổ DEPT135 Phổ chiều HMQC HMBC xác định đợc chất Kf chiết đợc từ phân đoạn CHCl3 bã Dutrà flovonol có tên Kaempherol tên IUPAC 3, 5, - Trihydroxy - 2-(4 - Hidroxy phenyl)-4H-1-Benzopyran -4-one Công thức cấu tạo nh sau: C15H10O6 m/z = 286 Theo vài tài liệu tham khảo Kaempherol có khả kháng ung th vú, chống hoại tử nọc rắn độc gây (Phụ lục số 15 trang 60 - 63) c/ Khảo sát phân đoạn 3: Phân đoạn MeOH Phân đoạn đợc xử lý nh sau: Dung dịch MeOH thu hồi MeOH cặn lại hoà tan với Butanol bão hoà nớc cất dung môi đến cạn hoà tan lại MeOH rửa axêton : ête (5:1) thu đợc hỗn hợp Saponin tinh chế saponin ký hiệu S3 * Các phản ứng đặc trng Saponin (S3) chiết xuất từ bã Dutrà 1/ Phân biệt hai loại Saponin: Tritecpen Steroit - Hoà tan mg chất S3 5ml cồn loãng vào ống nghiệm cao 25 cm ống thứ độ pH = 13, ống thứ độ pH = - Lắc mạnh ống nghiệm nh phút - Bọt nhiều bền vững ống thứ (môi trờng axit) chứng tỏ - saponin loại Saponin tritecpen 2/ Chỉ số bọt: Chỉ số bọt Saponin đợc tính theo công thức : Chỉ số bọt = A: biểu thị nồng độ nhỏ dịch chiết tính g/ml lớp bọt bền, không sau phút Kết số bọt S3 : 1 = x10 571 A 1,75 3/ Vòng phá huyết: Đây phần ứng đặc trng Saponin đờng kính vòng phá huyết tỉ lệ với nồng độ Saponin Vòng phá huyết Saponin S3 từ bã Dutrà 4/ Khảo sát hoạt chất Saponin S3từ bã Dutrà Saponin S3 có màu vàng nâu nhạt, tinh thể mịn, sáng đẹp, mùi hắc S3 tan tốt dung môi phân cực: MeOH, EtOH, BuOH, đặc biệt MeOH: H2O (4:1), tan tốt nớc nóng, tan nớc lạnh, không tan ete đầu CHCl3, C6H6, n-hexan Sắc ký lớp mỏng SiO2 Hệ dung môi CHCl3 : MeOH : H2O 65 : 35 : 10 Cho Rf = 0,45 - 0,47 vị trí Rf 0,44 có vết màu vàng kèm theo với thuốc Vanilin/ H2SO4 Sắc đồ cho vết màu lam đậm màu vàng Nhiệt nóng chảy khó xác định Từ 1860 bắt chảy, kéo dài đến 2300 - 2400 phồng lên caramen hoá Điều thể S3 chất mà nhóm chất có nhiều mạch đờng phức tạp dới dạng tritecpen oligoglycosides - Bằng phơng pháp phổ nh 13C - NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy S3 có chứa Cacbon bậc 1, 2, 3, Nh chất phức tạp Việc nghiên cứu cấu trúc hoá học S3 đợc tiếp tục tiến hành với luận án thạc sĩ năm 2006 (Phụ lục số14 trang 59) 5/ Nghiên cứu qui trình chiết xuất hoạt chất có tác dụng sinh học Sf từ bã khô dầu Dutrà Trong nghiên cứu dợc liệu để làm thuốc, việc nghiên cứu cấu trúc hoá học hoạt chất việc làm cần thiết để chứng minh tính khoa học, đại từ góp phần giải thích chất chế tác dụng thuốc Do đó, việc nghiên 25 C- Thăm dò nghiên cứu dạng bào chế Dựa kết qủa nghiên cứu dợc lý tác dụng hoạt chất Sf chiết đợc từ bã khô dầu Du trà (một loài Camellia (sp) họ Theaceae Chúng thăm dò nghiên cứu dạng thuốc đặt, tiêu diệt tinh trùng chỗ (không tiêm, không uống), lấy tên Camellia Qui trình sản xuất viên đặt âm đạo CAMELLIA (Suppositoria Camellia) đợc trình bày phụ lục số trang Hình thức viên đặt CAMELLIA: Dạng viên đạn có hình lỡi, viên chứa mg hoạt chất Sf, viên có màu trắng ngà, không mùi Tính chất- Công dụng: Có tác dụng diệt tinh trùng chỗ - Chỉ định: Tránh thụ thai - Chống định: Ngoại trừ trờng hợp mang thai, chống định Liều cách dùng: Đặt viên vào sâu âm đạo trớc giao hợp Thuốc tác dụng phụ, độ rã thích hợp, không 20 phút Mỗi viên có tác dụng cho lần giao hợp Nếu không đặt thuốc, có thai bình thờng Bảo quản: nhiệt độ dới 20oC, tránh ánh sáng Hạn sử dụng: năm Với khí hậu nóng ẩm nớc ta, dạng viên đặt có nhợc điểm phải bảo quản tủ lạnh, gây khó khăn cho vận chuyển đến vùng xa xôi Dạng kem dễ có điều kiện đến cácvùng sâu vùng xa, xong điều kiện bao bì khó khăn Với thực tế sản xuất nớc, qui trình sản xuất viên nén đặt âm đạo xí nghiệp dợc ổn đinh, nhiều công ty đạt tiêu chuẩn GMP, đó, dạng thuốc CAMELLIA xin phép thử lâm sàng dạng viên nén đặt âm đạo công ty dợc sản xuất 26 Kết luận Qua tất nghiên cứu hoá học dợc lý học, kết luận hoạt chất Sf tách đợc từ bã Du trà (Camellia sp) họ Theaceae) trở thành nguyên liệu đầu để làm thuốc hạn chế sinh sản, thuốc kháng nấm chữnh hng bệnh phụ khoa góp phần phục vụ mục đích bảo vệ sức khoẻ sinh sản phụ nữ kế hoạch hoá gia đình Lời cảm ơn Xin chân thành cảm ơn chơng trình nghiên cứu khoa học nhà nớc tài trợ cho đề tài Xin chân thành cảm ơn Viện Dợc liệu Bộ Y Tế tạo điều kiện để chơng trình đợc hoàn thành Tác giả xin cảm ơn hợp tác bạn đồng nghiệp quan 27 tiêu chuẩn sở Số TC: 04TCI112.05 Bộ Y tế Hạt Du trà Viện Dợc liệu Semen camelii Có hiệu lực từ: Hạt lấy từ chín phơi hay sấy khô Du trà Camellia drupifera Lour Pierre, thuộc họ Chè Theaceae Yêu cầu kỹ thuật 1.1.Mô tả: Hạt hình trứng hình trứng dẹt, số hạt méo mó, cong không đều, đờng kính 1,2 - 2,3 cm, dày 0,7 1,3 cm, màu nâu thâm Ngoài lớp vỏ hạt, sát lớp vỏ hạt lớp ngoại nhũ Phần ngoại nhũ gấp nếp ăn sâu vào nội nhũ, màu nâu Chất cứng, mặt gãy vân hoa đá, lẫn với màu nâu, đầu tù, thấy phôi nhẵn, khô, nhiều dầu, mùi thơm nồng đặc trng dầu Sở, vị đắng, tê lỡi 1.2.Vi phẫu: Ngoài lớp vỏ hạt, tế bào có màng dày, lớp ngoại nhũ sát lớp vỏ hạt, tế bào nhỏ kéo dài theo hớng tiếp tuyến, tế bào chứa chất màu nâu, rải rác có bó mạch, khối tinh thể canci oxalat hình nhiều cạnh phần vỏ Phần ngoại nhũ ăn sâu vào nội nhũ có màu nâu đỏ, tế bào to nhỏ không đều, tế bào nội nhũ chứa hạt tinh bột, giọt dầu 1.3.Bột: Màu nâu xám, mùi thơm hắc dầu, vị đắng, gây tê lỡi Soi kính hiển vi thấy nhiều mảnh nội nhũ có chứa hạt tinh bột, giọt dầu Mảnh vỏ hạt có chứa tinh thể canci oxalat hình nhiều cạnh, rải rác có tinh thể canci oxalat tách rời, giọt dầu Mảnh tế bào ngoại nhũ chứa chất màu nâu Mảnh mạch gặp Tinh bột đa số hạt đơn, đờng kính 20-25 àm, điểm rốn rõ 1.4.Độ ẩm: Không 10% 1.5.Tro toàn phần: Không 5% 1.6.Tro không tan dung dịch acid hydrocloric: Không 2% 1.7.Tạp chất: Hạt lép tạp chất khác; không 2% (DĐVNIII, Phụ lục 9.4) 1.8.Định tính saponin: Bằng phơng pháp sắc ký lớp mỏng(SKLM) Sắc ký đồ phải cho hai vết chính, vết có mầu vàng Rf khoảng 0,2- 0,3; vết có màu tím Rf khoảng 0,3- 0,35 - Phải có số bọt không thấp 400 1.9.Định lợng: Hàm lợng saponin toàn phần tan n-Butanol không đợc thấp 5% 2.Phơng pháp thử 2.1.Mô tả: Quan sát, đo mô tả trực tiếp mẫu dợc liệu 2.2.Vi phẫu: Theo DĐVN III, phụ lục 9.8 2.3.Soi bột: Theo DĐVN III, phụ lục 9.8 2.4.Độ ẩm:theo DĐVN III, Phụ lục 5.6, phơng pháp 2.5.Tro toàn phần:Theo DĐVN III, Phụ lục 7.6 2.6 Tro không tan dung dịch acid hydrocloric: DĐVN III, Phụ lục 7.5 2.7.Tạp chất: Theo DĐVN III, Phụ lục 9.4 2.8.Định tính: 2.8.1.Bằng Phơng pháp sắc ký lớp mỏng : Theo DĐVN III, phụ lục 4.4 - Dung dịch mẫu thử: Cho 1g bột hạt Du trà loại tạp phơng pháp chiết Soxhlet với ether dầu hoả 16 giờ.Sau chiết tiếp với Methanol : Nớc (4 : 1), lần, lần 20 ml Lọc, gộp dịch lọc, thu hồi dung môi đến cạn, cắn hoà với 10 ml nớc, chiết với 20 ml n-Butanol bão hoà nớc, cô dịch lọc cách thuỷ đến cạn Hoà tan cắn với ml Methanol dùng để chấm sắc ký - Chạy sắc ký: Trên mỏng silicagel G Merck đợc hoạt hoá nhiệt độ 1050 C- 1100C thời gian giờ, chấm 20àl dung dịch mẫu thử Triển khai sắc ký với hệ dung môi n-Butanol/ Ethanol/Amoniac dd/Nớc tỷ lệ: (7:2:2:3) Sau kính khai triển cao khoảng 10cm, lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phòng Phun thuốc thử vanilin 1% acid sulfuric đậm đặc - Kết quả:Sắc ký đồ dung dịch mẫu thử phải cho hai vết chính, vết mầu vàng Rf khoảng 0,25- 0,3 vết mầu tím Rf khoảng 0,3- 0,35 2.8.2.Chỉ số bọt : Chỉ số bột số ml nớc để hoà tan saponin 1g nguyên liệu cho cột bọt cao 1cm sau lắc Cách tiến hành: Cân 1g bột nguyên liệu (qua rây số 32), cho vào bình nón tích 500ml chứa sẵn 100ml nớc sôi, giữ cho sôi nhẹ 30 phút, lọc, để nguội thêm nớc cho 100ml Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm đờng kính 16mm, cho vào ống nghiệm lần lợt 1,2,3,10ml nớc sắc, thêm nớc cất vào ống cho đủ ống 10ml Bịt miệng ống nghiệm lắc theo chiều dọc 15 giây, giây lần lắc Để yên 15 phút đo chiều cao cột bọt Chỉ số bọt đợc tính theo công thức: 10x1 A Trong A số gam bột dợc liệu có ống cho cột bọt cao 1cm 2.9.Định lợng saponin toàn phần: Cân xác khoảng 10 g bột hạt Du trà, loại tạp chất béo phơng pháp chiết soxhlet lần lợt với 30ml n- hexan, cloroform, loại 12giờ, sấy khô Thêm 30ml methanol, chiết tiếp 16giờ Thu hồi methanol đến cạn, hoà tan cặn 20 ml nớc, chiết saponin toàn phần với 40; 30; 20;10 ml n- Butanol bão hoà nớc Tập trung dịch chiết n- Butanol vào bình cầu RN 29 sấy 1050C đến khối lợng không đổi Thu hồi dung môi, sấy cắn 1050C đến khối lợng không đổi, cân Tính kết Hàm lựơng saponin toàn phần hạt Du trà đợc tính theo công thức: X= Trong đó: X: P: m: B: P x 10000 m(100 B) Hàm lợng saponin toàn phần (%) Cắn saponin toàn phần thu đợc (g) Khối lợng bột hạt Du trà đem thử (g) Hàm ẩm có 100g mẫu thử 3.Chế biến: Hạt Du trà già, lấy phơi hay sấy khô 50- 600 C 4.Bảo quản: Để nơi khô, ráo, mát Khoa Hoá phân tích- Tiêu chuẩn Cán xây dựng tiêu chuẩn DS Nguyễn Thị Phơng DSCKI Nguyễn Kim Bích Hà nội, ngày 25 tháng10 năm 2005 viện dợc liệu tiêu chuẩn sở Số TC: 04TCI1.13.05 Bộ Y tế B khô dầu hạt Du trà Viện Dợc liệu Có hiệu lực từ: Bã khô dầu hạt Du trà bột khô hạt Du trà(Camellia drupiera Luor Pierre.) thuộc họ chè theaceae sau ép dầu Yêu cầu kỹ thuật: 1.1- Công thức điều chế cho 1000g : Bột hạt Du trà: Một nghìn năm trăm gam: 1500g Hạt du trà đợc nghiền thành bột thô, cho vào máy ép dầu, lấy dầu, lại bã, đem phơi hay sấy khô nhiệt độ 50- 600C, để đạt đợc độ ẩm theo quy định 1.2- Nguyên liệu: Hạt Du trà ( semen camellii): Đạt TCCS 1.3- Chất lợng thành phẩm: 1.3.1.Tính chất:Bã mầu nâu xám, có mùi hôi hạt Du trà 1.3.2.Giảm khối lợng làm khô:Không 9% 1.3.3.Tro toàn phần:Không 6% 1.3.4.Định tính:Saponin : - Bằng phơng pháp sắc ký lớp mỏng(SKLM).Sắc ký đồ mẫu thử phải có vết mầu Rf với sắc ký đồ mẫu đối chiếu - Phải có số bọt không thấp 500 1.3.5 Định lợng: Hàm lợng Saponin toàn phần có bã khô dầu hạt Du trà không đợc thấp 8% Phơng pháp thử: 2.1.Tính chất: Kiểm tra cảm quan, bã khô dầu hạt Du trà phải đạt yêu cầu nêu 2.2 Xác định giảm khối lợng làm khô: Thử theo DĐVN III, phụ lục 5.16, phơng pháp 2.3 Xác định tro toàn phần: Thử theo DĐVN III, phụ lục 7.6 (lợng mẫu thử 2g) 2.6 Định tính: 2.6.1.Định tính SKLM thử theo DĐVN III, phụ lục 4.4 - Dung dịch mẫu thử : Cho 0,5g bã khô dầu hạt Du trà vào bình cầu RN 29, thêm 30ml Methanol 80%, đun hồi lu bếp điện 30 phút, lọc qua giấy lọc Chiết loại tạp lần lợt n- Hexan Cloroform lần 15,10ml dung môi Cô dịch chiết cách thuỷ đến cạn Hoà tan cắn với 5ml nớc, chiết saponin 15, 10, ml n- Butanol bão hoà nớc, cô dịch cách thuỷ đến cạn Hoà tan cắn với 1ml Methanol đợc dung dịch chấm sắc ký - Dung dịch mẫu đối chiếu: Lấy 25mg sản phẩm Sf hạt Du trà hoà tan 1ml Methanol đợc dung dịch chấm sắc ký - Chạy sắc ký: Trên mỏng silicagel G Merck đợc hoạt hoá nhiệt độ 1050 C- 1100C thời gian giờ, chấm điểm a 20àl dung dịch mẫu thử, chấm điểm b 20àl dung dịch mẫu đối chiếu Triển khai sắc ký với hệ dung môi n-Butanol/ Ethanol/Amoniac dd/ Nớc tỷ lệ: (7:2:2:3).Sau kính khai triển cao khoảng 10cm, lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phòng Phun thuốc thử vanilin 1% acid sulfuric đậm đặc - Kết quả:Sắc ký đồ dung dịch mẫu thử phải cho hai vết có màu vàng màu tím màu sắc giá trị Rf tơng ứng với vết sắc ký đồ dung dịch mẫu đối chiếu 2.6.2.Chỉ số bọt: Chỉ số bột số ml nớc để hoà tan saponin 1g nguyên liệu cho cột bọt cao 1cm sau lắc Cách tiến hành: Cân 1g bột nguyên liệu (qua rây số 32), cho vào bình nón tích 500ml chứa sẵn 100ml nớc sôi, giữ cho sôi nhẹ 30 phút, lọc, để nguội thêm nớc cho 100ml Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm đờng kính 16mm, cho vào cac ống nghiệm lần lợt 1,2,3,10ml nớc sắc, thêm nớc cất vào ống cho đủ ống 10ml Bịt miệng ống nghiệm lắc theo chiều dọc 15 giây, giây lần lắc Để yên 15 phút đo chiều cao cột bọt Chỉ số bọt đợc tính theo công thức: 10x1 A Trong A số gam bột dợc liệu có ống cho cột bọt cao 1cm 2.7.Định lợng saponin toàn phần Cân xác khoảng 10g bột bã khô dầu hạt Du trà, loại tạp chiết soxhlet với dung môi n- Hexan, Cloroform (mỗi lần 30ml dung dịch giờ) Sau tiếp tục chiết 30ml Methanol Thu hồi dung môi đến cạn Hoà tan cắn với 20ml nớc, chuyển vào bình gạn, chiết saponin 40, 30, 20ml n- Butanol bão hoà nớc, tập trung dịch chiết nButanol vào bình cầu RN 29 sấy 1050 đến khối lợng không đổi Thu hồi dung môi, sấy cắn 1050C đến khối lợng không đổi Hàm lợng saponin toàn phần bã khô dầu hạt Du trà đợc tính theo công thức: X= Trong đó: P x 10000 m(100 B) X: P: m: B: Hàm lợng saponin (%) Cắn saponin thu đợc (g) Khối lợng bã khô dầu hạt Du trà đem thử (g) Lợng ẩm có 100g mẫu thử Bảo quản: túi nilon, để nơi khô ráo, thoáng mát Khoa hoá Phân tích- Tiêu chuẩn Cán xây dng tiêu chuẩn Nguyễn Thị Phơng DSCKI Nguyễn Kim Bích Hà nội, ngày 25 tháng 10 năm 2005 viện dợc liệu tiêu chuẩn sở Bộ Y tế viên đặt Số TC: 04TCI111.05 camellia Có hiệu lực từ: Viện Dợc liệu Yêu cầu kỹ thuật: 1.1- Công thức điều chế cho viên : Sản phẩm Sf : Một milligam rỡi Polyethylen glycol 400 : Một nghìn trăm hai mơi milligam Polyethylen glycol 4000 : Một nghìn bốn trăm milligam: Nớc cất : Hai trăm tám mơi milligam 1.2- Nguyên liệu: - Sản phẩm Sf : Đạt TCCS Viện Dợc Liệu - Polyethylen glycol 400: Đạt tiêu chuẩn USP 23 - Polyethylen glycol 4000: Đạt tiêu chuẩn USP 23 - Nớc cất: Đạt tiêu chuẩn DĐVN III 1.3- Chất lợng thành phẩm: 1.3.1.Hình thức:Viên đặt mầu trắng đến trắng ngà, không mùi 1.3.2.Độ đồng khối lợng: Khối lợng trung bình viên 5% 1.3.3 Độ rã: Không 30 phút 1.3.4 Độ nhiễm khuẩn: Đạt theo phụ lục 10.7, mức DĐVN III 1.3.5 Định tính: Saponin hạt Du trà 0,0015g 1,1200g 1,4000g 0,2800g Phơng pháp thử 2.1 Xác định hình thức:Bằng cảm quan, viên đặt Camellia phải đạt yêu cầu nêu 2.2 Xác định khối lợng trung bình viên: Thử theo DĐVN III, phụ lục 8.3 2.3 Xác định độ rã: Thử theo DĐVN III, phụ lục 8.5 2.4 Xác định độ nhiễm khuẩn: Thử theo DĐVN III, phụ lục 10.7 2.6 Định tính: saponin sắc ký lớp mỏng thử theo DĐVN III, phụ lục 4.4 - Dung dịch mẫu thử : Lấy 10 viên đặt, cho vào bình cầu, thêm 30ml nớc, đun hồi lu cách thuỷ sôi 30 phút Làm lạnh nớc đá Lọc qua giấy lọc, dịch lọc loaị tạp ether dầu lần lần với 20ml Chiết saponin 20ml n- Butanol bão hoà nớc Cô dịch chiết cách thuỷ đến cạn Hoà cắn với 1ml Methanol đợc dung dịch chấm sắc ký - Dung dịch mẫu đối chiếu: lấy 15mg sản phẩm Sf hoà tan 1ml Methanol đợc dung dịch chấm sắc ký - Chạy sắc ký: Trên mỏng silicagel G Merck đợc hoạt hoá nhiệt độ 1050 C- 1100C thời gian giờ, chấm điểm a 30àl dung dịch mẫu thử, chấm điểm b 30àl dung dịch mẫu đối chiếu Triển khai sắc ký với hệ dung môi n-Butanol/ Ethanol/Amoniac dd/ Nớc tỷ lệ: (7:2:2:3).Sau kính khai triển cao khoảng 10cm, lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phòng Phun thuốc thử vanilin 1% acid sulfuric đậm đặc - Kết quả: Sắc ký đồ dung dịch mẫu thử phải cho vết màu tím có màu sắc giá trị Rf tơng đơng với vết sắc ký đồ dung dịch mẫu đối chiếu Đóng gói, ghi nhn, bảo quản Viên đặt saponin camellia đóng vỉ viên Nhãn ghi rõ ràng, quy chế Bảo quản nhiệt độ từ 150c đến 200c Khoa hoá Phân tích- Tiêu chuẩn Cán xây dựng tiêu chuẩn DS Nguyễn Thị Phơng DS.CKI.Nguyễn Kim Bích Hà nội, ngày 25 tháng 10 năm 2005 viện dợc liệu [...]... dạng thuốc CAMELLIA khi xin phép thử lâm s ng s là dạng viên nén đặt âm đạo do công ty dợc s n xuất 26 Kết luận Qua tất cả các nghiên cứu hoá học và dợc lý học, có thể kết luận rằng hoạt chất Sf tách đợc từ bã quả cây Du trà (Camellia sp) họ Theaceae) có thể trở thành nguyên liệu đầu để làm thuốc hạn chế sinh s n, thuốc kháng nấm chữnh hng bệnh phụ khoa góp phần phục vụ mục đích bảo vệ s c khoẻ sinh s n... nhóm tinh dịch + nớc muối sinh lý 0,9% ( 6 mẫu) 2/ Nhóm tinh dịch + nớc muối sinh lý 0,9 % +hoạt chất Sf (12 mẫu) 3/ nhóm tinh dịch +hoạt chất Sf (14 mẫu) Tất cả gồm 32 thí nghiệm để so s nh Trên s đó biểu diễn theo 3 nhóm x 2 lần thí nghiệm 12 Qua s đồ thấy rõ rằng: ở nhóm thứ nhất: tinh dịch + NaCl 0,9% - Nớc muối sinh lý chỉ có tác dụng hoà tan vào tinh dịch va không có tác dụng gì đến ứu chế s hoạt. .. C- Thăm dò nghiên cứu dạng bào chế Dựa trên các kết qủa nghiên cứu dợc lý về tác dụng của hoạt chất Sf chiết đợc từ bã khô dầu quả cây Du trà (một loài Camellia (sp) họ Theaceae Chúng tôi đã thăm dò nghiên cứu dạng thuốc đặt, tiêu diệt tinh trùng tại chỗ (không tiêm, không uống), lấy tên là Camellia Qui trình s n xuất viên đặt âm đạo CAMELLIA (Suppositoria Camellia) đợc trình bày ở phụ lục s trang... muối sinh lý thành các nồng độ khác nhau, trộn đều với một lợng tơng đơng (0,5 ml) tinh dịch ngời, sau đó dùng kính hiển vi quang học quan s t tác dụng của hoạt chất lên hoạt động của tinh trùng 2- Kết quả thí nghiệm và phân tích s liệu a/ kết quả thí nghiệm: kết quả phân tích tinh dịch theo các chỉ tiêu và mức độ: chỉ tiêu 1: tỉ lệ s ng của tinh trùng% trớc và sau khi tiếp s c với hoạt chất Sf chỉ... cung th sau khi tỏc d ng vi Sf 21 Tuy n tin lit th sau khi tỏc dng vi Sf Nóo th sau khi tỏc d ng vi Sf VI-Thử tác dụng kháng nấm Hoạt chất Sf có tác dụng diệt nấm Candida albicans rất tốt Đây là một loại nấm bệnh có trong phần phụ của phụ nữ, gây viêm nhiễm, hôi hám khó chịu Trong khi đó hoạt chất Sf lại không tiêu diệt nấm Lactobacillus là một loại nấm có tác dụng ổn định độ pH trong phần phụ của phụ... động của tinh trùng ở nhóm thứ 2 gồm tinh dich + NaCl 0.9% và ở nhóm thú 3 gồm tinh dịch +hoạt chất Sf thấy rất rõ vai trò của hoạt chất Sf ở đây - chỉ s A% tiến tới rất nhanh và tiến tới chậm bằng 0 - chỉ s C% không tiến tới bằng 0 - chỉ s D% không di động là 100% Điều đó khẳng định tác dụng mạnh mẽ của hoạt chất Sf (s liệu phụ lục 18 trang 86 -118 ) 13 So s nh tác dụng diệt tinh trùng chuột và. .. thạc s vào cuối năm 2006 9 B- Những nghiên cứu dợc lý I- Tác dụng của hoạt chất Sf lên tinh trùng ngời (test invitro) (thực hiện tại Bệnh viện Phụ s n Trung Ương) Mục đích của thí nghiệm là xác định xem ở nồng độ nào khoảng thời gian nào thích hợp để hoạt chất Sf ức chế đợc tinh trùng, làm cho tinh trùng không tiến tới nhanh, dừng lại tại chỗ, không hoạt đọng đợc và chết Điều đó bảo đảm tinh trùng. .. trớc khi dùng thuốc ( chừng): 0 phút thời gian tiếp s c sau khi dùng thuốc: 1, 5, 10 chỉ tiêu biến đổi hình dạng sang ( %) (xem bản s liệu gốc- phần phụ lục s 7 , trang 40- 5 6) 10 b- phân tích s liệu-vấn đề nghiên cứu là s sai khác giữa s tinh trùng ban đầu cha kịp tiếp s c với hoạt chất Sf, so s nh với tinh trùng sau khi tiếp s c với hoạt chất Sf ở các chỉ tiêu và mức độ xem xét có ý nghĩa thống... Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu a/ Hoạt chất Sf: Hoạt chất Sf chích đợc từ bã khô dầu quả cây Du trà (Camillia (Sf)- họ Theaceae )có tinh thể vô định hình màu nâu nhạt với các chỉ tiêu chất lợng xác định b/ Tinh trùng: tinh trùng đợc lấy từ 17 ngời đàn ông khoẻ mạnh bình thờng, đợc s lý và thí nghiệm theo tài liệu của tổ chức Y tế Thế giới (WHO) c/ Phơng pháp tiến hành: lấy hoạt chất Sf pha loãng... dng u v cht Các kết quả này đã đợc báo cáo tại hội nghị toàn quốc 2004 về nghiên cứu cơ bản trong khoa học s s ng - Định hớng y dợc học- Học viện quân y dợc học- Học viện quân y 28.10.2004- Hà Nội Phụ lục s 16 trang 64 -68 II Chứng minh thêm tác dụng của hoạt chất Sf Để khẳng định thêm tác dụng của hoạt chất Sf lên tinh trùng ngời, chúng tôi tiếp tục thí nghiệm thêm 13 mẫu tinh dich phân theo 3 ... vậy, đề xuất đề tài: "Chiết xuất hoá học, dợc lý học hoạt chất có tác dụng diệt tinh trùng kháng nấm bệnh Dutrà (một loài Camellia- Họ Theaceac) nhằm làm thuốc hạn chế sinh s n, thuốc phụ khoa, góp... dợc s n xuất 26 Kết luận Qua tất nghiên cứu hoá học dợc lý học, kết luận hoạt chất Sf tách đợc từ bã Du trà (Camellia sp) họ Theaceae) trở thành nguyên liệu đầu để làm thuốc hạn chế sinh s n, thuốc. .. tinh dịch Thử tác dụng Sf (test in vitro) Phân tích tinh dịch; so s nh với tác dụng nớc muối sinh lý; tinh dịch + nớc muối sinh lý; tinh dịch + nớc muối sinh lý +hoạt chất Study of spermicical