Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống

Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của thực vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường

ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai LỜI MỞ ĐẦU Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ở nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn. Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của thực vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Enzyme protease là nhóm enzyme thủy phân protein được ứng dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất nước mắm ngắn ngày, trong công nghiệp thuộc da, trong công nghiệp sữa và phomat. Đặc biệt trong quá trình sản xuất bia, protease đóng vai trò rất quan trọng trong việc tăng nhanh quá trình sản xuất, tăng hiệu suất trích ly, thủy phân hoàn toàn các chất protein, làm giảm độ nhớt và làm triệt tiêu nguyên nhân làm đục bia. Ngày nay, bia là loại đồ uống không thể thiếu đối với cuộc sống của con người. Bia là loại nước giải khát, có độ cồn thấp, giàu dinh dưỡng. Ngoài việc cung cấp một lượng calori khá lớn, trong bia còn chứa một hệ enzyme phong phú, kích thích tiêu hoá cho cơ thể con người. Hiện nay, các nhà máy bia ở nước ta chưa chú ý tới việc sử dụng enzyme trong quá trình sản xuất. Xuất phát từ những lý do trên em chọn đề tài “Ứng dụng của enzyme protease trong sản xuất bia” với mong muốn những ứng dụng của enzyme này sẽ được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất bia nói riêng. SVTH: Lưu Thị Liên Trang 1 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Chương I TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE 1. Tổng quan về enzyme Protease [2] 1.1. Giới thiệu chung Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự. Nhiều Protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin. Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm phụ: - Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch polypeptit. - Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của mạch polypeptit. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo – peptidase. - Dipeptidhydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit. - Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa .) và động vật (gan, dạ dày bê .) [10]. Trong cơ thể, các Protease đảm nhiệm nhiều chức nǎng sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua màng .[3]. Ngoài ra, các Protease có thể hoạt động như các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thường đó là tǎng sự phân chia tế bào, sinh tổng hợp ADN .[2]. So với Protease động vật và thực vật, Protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ Protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên Protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. SVTH: Lưu Thị Liên Trang 2 Lớp: 08s2 Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai 1.2. Đặc điểm và tính chất của Protease vi sinh vật [5] Các công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các Protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau về nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động thích hợp,… các nhà khoa học đã phân loại các Protease vi sinh vật thành bốn nhóm như sau: P-xerin, P-thiol, P-kim loại, P-acid. Một số tác giả khác chia Protease ra ba nhóm, dựa vào hoạt động ph của chúng bao gồm: Protease-acid, Protease trung tính, Protease kiềm. Trong bốn Protease kể trên, các Protease-xerin và Protease-thiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của aa. Ngược lại các Protease kim loại, Protease acid thường không có hoạt tính esterase của các dẫn suất của aa. Nhiều Protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đối bé, nhất là các P-xerin. Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm Proteinase này ở bảng 1.1 SVTH: Lưu Thị Liên Trang 3 Lớp: 08s2 Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của Tripsin (1 Protease xerin tiêu biểu) Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme Protease ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Bảng 1.1. Một số tính chất của Protease (P) vi sinh vật Nhóm Nguồn E Chất kìm hãm Đặc điểm TTHĐ pH tối thích P-Xerin Bac.subtilis Bac.pumilus Str.griseus Str.fradiae Art hrobacter B22 Asp.oryzae Asp.flavus Asp.sojae E.coli DFP + Xerin Kiềm P-tiol Streplococcus Clostridium histoly-ticum Indoaxeta-mit Ps.cloromer- curbenzoat -SH 7,5 7,0 P-kim loại Bac.subtilus Bac.subtilus NRRL B3411 Bac. Subtilisamy Losaccarilicis Bac. Megaterium Psuedomonasaeruginoa Atreptomeces naraensis Asp. Oryzae Acremonium kiliense Clostridiumhisttolytium EDTA ++ 1,10octa- fenantrolin Kim loại hóa trị hai Trung tính P-Acid Asp.niger Asp.Awamori Sailoi,penicillium Janthinellum Rhizopus chinensis Mucor pucillus Endothia parasilica Dizoaxetil Dlnorlox- inmetil este COOH Acid SVTH: Lưu Thị Liên Trang 4 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai 1.3. Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của Protease [5] Trong TTHĐ của Protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số Protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau: - TTHĐ của Protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số trường hợp còn có cả cofactơ kim loại. + Các Protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21 0 A, có thể phân biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất. + Đối với các Protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể Protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho thấy phân tử các Protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 20 0 A. Khe hở này là phần xúc tác của các E, các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy. - Đối với các Protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide. Mặc dù TTHĐ của các Protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, enzyme - S: Phức chất enzym- cơ chất, P 1 : Là sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P 2 : Là sản phẩm thứ hai của phản ứng. 2. Nguồn thu nhận Protease [3] Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính: Động vật, thực vật và vi sinh vật. Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống [3]. Enzyme Protease từ nguồn động vật và thực vật được loài người khai thác và ứng dụng hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống. Nhưng hiện nay lượng enzyme thu nhận từ thực vật và động vật được thay thế dần bằng enzyme vi sinh vật. enzyme thu nhận từ các nguồn này thường rất khó và hiệu SVTH: Lưu Thị Liên Trang 5 Lớp: 08s2 E + S enzyme – S enzyme – S + P 1 enzyme + P 2 Hình 1.4. Cơ chế xúc tác TTHĐ Enzyme ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai quả kinh tế không cao. Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ thuật sản xuất được liệt kê như sau:  Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm.  Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao.  Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được một lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao.  Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành, kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều.  Vi sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp: Trong sản xuất, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài. Trong khi đó, sản xuất enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy mô công nghiệp được.  Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẽ tiền và dễ kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn về mặt môi trường sống. vi sinh vật không đòi hỏi quá khắt khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trường, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyne. Chính vì thế enzyme được sản xuất từ vi sinh vật thường rẻ tiền hơn enzyme từ các nguồn khác.  Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau [5].  Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh Protease, các enzyme này có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Một số Protease ngoại bào đã sản xuất quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, trong nông nghiệp và trong y học.  Nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme Protease chủ yếu gồm: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn. 3. Phương pháp thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật 3.1. Tuyển chọn giống vi sinh vật cho enzyme Protease có hoạt lực cao Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta có thể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành các biến chủng có khẳ năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu. Có thể thông qua các phương pháp sau: - Phương pháp gây đột biến. - Phương pháp biến nạp. - Phương pháp tiếp hợp gene. - Phương pháp tải. SVTH: Lưu Thị Liên Trang 6 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai 3.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease Để tổng hợp enzyme Protease cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác. 3.2.1. Nguồn cacbon [1],[9] Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào đặc tính của enzyme và nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp. Có nhiều hợp chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp đối với nấm mốc sinh ra enzyme Protease có hoạt lực cao. Các nguồn cacbon có tác dụng đến sinh tổng hợp Protease của Asp. oryzae có thể theo thứ tự: fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→ arabinoza→ galactoza. Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme Protease. 3.2.2. Nguồn nitơ [1]. Nguồn nitơ sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ. Đối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A. oryzae, A. awamori, A. niger, A. flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp Protease axit cao. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme được nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ. Cho thêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ và hữu cơ hoạt lực enzyme Protease tăng 22 - 74%. Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp Protease nói chung. Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất của chúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng đáng kể sinh tổng hợp protease VSV. 3.2.3. Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố kích thích sinh trưởng [1] - Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động vi sinh vật. Ion Mg 2+ có tác dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao. - Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. SVTH: Lưu Thị Liên Trang 7 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai +Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25 - 30 0 C. Trị số pH ban đầu của môi trường (chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành E, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi vi sinh vật. + Độ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy ở môi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, còn ở môi trường bề sâu (môi trường dịch thể), thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc thì việc này cực kỳ quan trọng). Độ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở nuôi cấy bề mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt. + Khi lựa chọn môi trường cần chú ý đến cả thành phần định tính và định lượng sao cho quá trình sinh tổng hợp enzyme mong muốn là cao nhất. 3.3. Nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme Protease bằng phương pháp bề mặt [3] Là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường. Có thể là môi trường lỏng hoặc đặc. Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương đã được nấu chín trộn hạt cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương). Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là trấu. Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH 4 ) 2 SO 4 , (NH 4 ) 2 CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. - Ưu, nhược điểm + Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật. Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme. Chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme. + Tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản dễ thực hiện và dễ dàng xử lý khi bị nhiễm vi sinh vật lạ, có thể thực hiện qui mô gia đình, trang trại cũng như ở qui mô lớn đến 20 tấn/ngày. + Tuy nhiên phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hoá, tự động hoá, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều. Ngoài ra phương pháp nuôi cấy bề mặt có một nhược điểm rất lớn là tốn nhiều diện tích. Do vậy mà phương pháp này dần được thay thế bằng nuôi cấy chìm để nuôi cấy vi khuẩn. SVTH: Lưu Thị Liên Trang 8 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai 3.4. Thu nhận enzyme (E) 3.4.1. Tách và làm sạch chế phẩm enzyme [3] Enzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi là các enzyme nội bào (intracellular enzyme), nhưng nó cũng có thể được các sinh vật tiết ra mơi trường sống. Đó là các enzyme ngoại bào (extracellular enzyme). Enzyme vi sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào. - Các phân tử enzyme nội bào khơng có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các enzyme này, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch. Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa (homogenizator). Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sóng siêu âm, dùng các dung mơi hữu cơ như butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate . và chất detergent. Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ. Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính. + Có một số yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết rút cần lưu ý. Trước hết đó là nhiệt độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vơ hoạt, cần chiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 5 0 C). Các thao tác phải nhanh. Một số chất điện ly làm tăng q trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl 2 , CaCl 2 . Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút. - Để loại bỏ muối khống và các loại đường . là các tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm lỗng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. - Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương pháp khác nhau: phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của mơi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung mơi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel. - Mục đích u cầu: Các chế phẩm enzyme được sử dụng ở các dạng khác nhau theo mức độ tinh khiết (hoạt độ riêng). Trong một số trường hợp, canh trường ni cấy vi sinh vật có chứa enzyme được sử dụng trực tiếp dưới dạng thơ khơng cần tách tạp chất nếu chúng khơng gây ảnh hưởng đáng kể đến sản phẩm và quy trình cơng nghệ sau này (Ví dụ: sản xuất rượu, nước chấm thực vật, da). Cũng có khi người ta cần sử dụng chế phẩm enzyme tinh khiết trong cơng nghiệp dệt, cơng nghiệp mạch nha, y học, nghiên cứu khoa học. Enzyme nói chung rất dễ bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngồi do đó khi tách và tinh chế enzyme để tránh sự biến hình protein ảnh SVTH: Lưu Thị Liên Trang 9 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai hưởng lớn đến hoạt tính enzyme cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp, độ pH thích hợp không có mặt các chất gây biến hình enzyme. - Để trích ly enzyme ra khỏi tế bào trước hết cần phải phá vỡ thành tế bào, màng tế bào và những cấu trúc dưới tế bào bằng những phương pháp lý học hoặc hóa học. Đối với trường hợp enzyme còn nằm trong tế bào (E nội bào nuôi bằng phương pháp bề mặt) thì cần phải giải phóng enzyme bằng cách phá vỡ tế bào thu nhiều cách như: + Nghiền nhỏ, nghiền với cát, nghiền với vụn thủy tinh, nghiền bi. + Để tế bào tự phân hủy. + Dùng tác dụng của siêu âm hoặc tạo áp suất thẩm thấu cao, trích ly bằng muối, dung dịch muối trung tính, dung môi hữu cơ. + Kết tủa enzyme bằng các chất điện ly thích hợp. - Thẩm tích [8] Trong quá trình tinh sạch các enzyme để loại bỏ các phân tử hòa tan nhỏ không mong muốn khỏi dịch trích ly enzyme như amoni sulfat sau khi kết tủa, dùng một muối để khử hấp thụ enzyme trong sắc ký trao đổi ion, hoặc một phối tử cạnh tranh dùng trong sắc ký ái lực… người ta thường dùng phương pháp thẩm tích. Túi thẩm tích được cấu tạo bằng một màng bán thấm, chứa dịch chiết E, được đặt vào trong một dung dịch đệm không được chứa chất hòa tan cần được loại bỏ. Chất hòa tan khuếch tán ra khỏi màng cho đến khi nồng độ chất hòa tan trong túi và bên ngoài dịch đệm sẽ bằng nhau. - Làm đặc [8] Trong quá trình tinh sạch enzyme, có thể phải làm đặc dịch E, nhất là sau khi qua giai đoạn sắc ký dịch chứa enzyme đã bị pha loãng ra nhiều. Làm đặc dịch chứa enzyme bằng cách cho bốc hơi trong chân không, bằng cách thẩm thấu ngược (tạo áp suất thẫm thấu làm cho dung dịch đi qua một màng bán thấm và giữ lại các protein E) hoặc bằng siêu lọc (dung dịch enzyme được dẫn qua một màng có lỗ nhỏ bằng áp suất hoặc bằng ly tâm). SVTH: Lưu Thị Liên Trang 10 Lớp: 08s2 [...]... mối và hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân Khi bổ sung protease B subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và thủy phân ở 500C + Nghiên cứu ứng dụng Protease trong sản xuất Bia, thực hiện trong các năm 1993 - 1994, Thực hiện: TS.Trương Thị Hòa và các công tác viên Viện Công nghiệp thực phẩm Protease của Aps oryzae được dùng để thủy phân protein trong. .. 18 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Chương 2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ THIẾT BỊ I Đối tượng nghiên cứu 1.Giới thiệu nguyên liệu [6] Nguyên liệu chính dùng để sản xuất bia là malt đại mạch, hoa houblon, nước và sử dụng nguyên liệu thay thế là ngô, gạo 1.1 Malt đại mạch 1.1.1 Vai trò của malt trong sản xuất bia Trong công nghiệp sản xuất bia malt là nguồn... công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Protease từ VSV Chính vì thế nhịp độ sản xuất Protease ở quy mô công nghiệp tại các nước phát triển hàng năm tăng vào khoảng 5% - 10% Ngày nay người ta có thể sản xuất các enzyme cố định trên các chất mang không tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần Vì vậy mà việc ứng dụng Protease ngày càng gia tăng[4], [1] Enzyme tinh khiết trong công nghiệp dệt,... giải Protein của Xạ khuẩn Trong hơn 10 năm nay số công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật tăng lên đáng kể nhiều hơn các Protease của động và thực vật Những kết quả đạt được trong lĩnh vực này đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế [9] Trong CNTP, người ta sử dụng Protease để sản xuất phomat từ sữa (Mohanty et al.,1999), xản xuất bánh từ bột mì (Hozova... bã malt Chất béo và lipoid tồn tại trong bia sẽ làm giảm độ bền keo của sản phẩm 1.3.6 Enzyme Enzyme là những hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học rất cao, có cấu tạo phân tử rất phức tạp và giữ vai trò đặc biệt trong công nghệ sản xuất bia Trong hạt đại mạch có chứa một lượng enzyme khá phong phú, chúng được xếp vào hai nhóm: nhóm enzyme thủy phân và nhóm enzyme oxi hóa khử  Nhóm enzyme thủy phân... bền keo và ổn định thành phần sinh học của sản phẩm Trong sản xuất bia người ta sử dụng hoa cái chưa thụ phấn vì hoa đã thụ phấn sẽ tạo hạt làm giảm chất lượng bia Hoa được sử dụng dưới nhiều dạng khác nhau: dạng hoa nguyên cánh, hoa viên, cao hoa,… Tuy nhiên, không sử dụng 100% cao hoa vì sẽ làm cho mùi, vị của bia bị giảm sút Nhà máy sử dụng hoa houblon ở dạng hoa nguyên và dạng viên Sử dụng hoa... sản phẩm trung gian và sản sinh ra nhiệt trong quá trình lên men  Chủng loại nấm men trong sản xuất bia Trải qua quá trình sàng lọc và phân lập rất kỹ lưỡng qua hàng trăm năm, một loại nấm men được lựa chọn để chuyên dùng trong sản xuất bia: đó là chủng nấm men Saccharomyces Cerevisiae, Saccharomysec Carlsbergensis 1.5.2 Lựa chọn chủng nấm men trong sản xuất bia Việc lựa chọn chủng nấm men trong sản. .. ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai 4.2.3 Thu nhận sản phẩm Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme protease, chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzyme thô Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần phải quá trình tinh sạch Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzyme Để sản xuất enzyme tinh... giả, kem đánh răng (Rao et al., 1998) Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme SVTH: Lưu Thị Liên Trang 17 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và Protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%) (Rao et al.,... quan trọng trong quá trình sản xuất malt và bia đặc biệt là phospho vì nó đóng vai trò chủ yếu trong việc hình thành hệ thống đệm của dịch đường 1.3.5 Chất béo và lipid Hàm lượng chất béo và lipoid trong hạt đại mạch giao động trong khoảng 2,5 - 3% lượng chất khô của hạt Chúng tập trung chủ yếu ở phôi và lớp alơron SVTH: Lưu Thị Liên Trang 26 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia . 4 phân nhóm phụ: - Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch polypeptit. - Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên. nhiều chức nǎng sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh học