điều kiện nuôi cấy in vitro

điều kiện nuôi cấy in vitro

MỤC LỤC MỤC LỤC .i PHỤ LỤC i GIỚI THIỆU 1 CHƯƠNG 1: 1 TỔNG QUAN .1 KẾT LUẬN .47 TÀI LIỆU THAM KHẢO .48 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Tra cứu các bảng Bảng 1: Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose đến sự nuôi cấy huyền phù tế bào .46 Phụ lục 2: Tra cứu các hình Hình 1 : 1. Cành đang nở hoa; 2.Quả; 3.Hạt .3 Hình 2: Hạt của cây C.roseus 4 Hình 3: Ba giống C.roseus .5 i Hình 4: Công thức hóa học của leurosidine, vincristine, vinblastine, leurosine, catharine, vinamidine 11 .12 Hình 5: Công thức hóa học của ajmalicin 12 Hình 6: Công thức hóa học của vinflunine .12 Hình 7: Công thức hóa học của vinblastine 12 Hình 8: Công thức hóa học của vincristine 13 Hình 9: Con đường chuyền hóa thành vinblastine và vincristine 14 Hình 10: Con đường sinh tổng hợp Vinblastine .16 Hình 11: Quá trình sinh tổng hợp vincristine từ vinblastine 17 Hình 12: Cơ chế ức chế sự hình thành cấu trúc vi ống của vinca alkaloid 19 Hình 13: Cấu trúc hóa học của vinblastine sulfate 20 Hình 14: Sản phẩm và cấu trúc hóa học của vincristine sulfate .22 Hình 15: Sơ đồ quá trình chiết tách bằng SFE 25 Hình 16: Bình Soxhlet 25 Hình 17: Sơ đồ một bộ chưng cất lôi cuốn hơi nước .26 Hình 18: Sản phẩm mô sẹo và cây mọc từ hạt nhân tạo .42 Hình 19: Sản phẩm rễ tơ .43 Phụ lục 3: Tra cứu các đồ thị Đồ thị 1: Đường cong tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào trong môi trường có bổ sung các nồng độ đường khác nhau .47 ii GIỚI THIỆU Dừa cạn Catharanthus roseus. G. Don thuộc họ Trúc đào Apocynaceae là một trong những loại cây cảnh phổ biến đồng thời cũng là một loại dược thảo dân gian. Người ta đã khám phá ra được khả năng chữa bệnh của loại cây này là nhờ nó chứa nhiều loại hợp chất alkaloid. Từ dừa cạn người ta có thể chiết được chất chữa ung thư như vinblastine, vincristine và chữa cao huyết áp như ajmalicin, serpentin. Hiện nay, nhu cầu về C.roseus trên thế giờ rất cao, nhưng thực tế, trong điều kiện tự nhiên sự nhân giống C.roseus bằng con đường sinh sản hữu tính rất chậm và còn phụ thuộc nhiều vào môi trường. Mặt khác, lượng alkaloid thu được từ tự nhiên là rất thấp nên không đáp ứng được nhu cầu thị trường. Vì vậy em chọn đề tài “Cây dừa cạn Catharanthus roseus và nhóm hợp chất Vinca alkaloid” với mục đích là tìm hiểu về dược tính, cách thu nhận và ứng dụng của nó hiện nay. Nhờ có giá trị dược tính nên C.roseus đã trở thành đối tượng của nhiều nghiên cứu sinh học. Những nghiên cứu này chủ yếu liên quan tới điều kiện nuôi cấy in vitro của những cơ quan, mô và tế bào khác nhau, quá trình tách những indole alkaloid và xác định cấu trúc hóa học của nó cũng như quá trình sinh tổng hợp và hóa tổng hợp của nó. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Catharanthus 1 Giống Catharanthus (thuộc họ trúc đào Apocynaceae) gồm có 8 loài, hầu hết là cây thân thảo lâu năm. Trong số đó chỉ có loài Catharanthus pusillus có nguồn gốc từ Ấn Độ, còn tất cả các loài còn lại có nguồn gốc từ Madagascar. Số lượng nhiễm sắc thể cho tất cả các loài Catharanthus đều là 2n=16. Tám loài thuộc giống này đó là: • Catharanthus coriaceus Markgr. Madagascar. • Catharanthus lanceus (Bojer ex A.DC.) Pichon. Madagascar. • Catharanthus longifolius (Pichon) Pichon. Madagascar. • Catharanthus ovalis Markgr. Madagascar. • Catharanthus pusillus (Murray) G. Don. India subcontinent. • Catharanthus roseus (L) G. Don. Madagascar. • Catharanthus scitulus (Pichon) Pichon. Madagascar. • Catharanthus trichophyllus (Baker) pichon. Madagascar Những giống Catharanthus có nguồn gốc từ Madagascar thường được trồng để làm cảnh. Được biết đến nhiều nhất đó là loài Madagascar Periwinkle hay còn gọi là Vinca nhờ vào khả năng chịu hạn và chịu nóng của nó. Ngoài việc được biết đến như một loại cây cảnh, từ lâu dịch chiết alkaloid từ Catharanthus roseus đã được sử dụng trong y học dân gian như một loại thuốc chống đái tháo đường, lợi tiểu, chữa tiêu chảy, xuất huyết, giúp vết thương mau lành, chống viêm mắt, làm se da….và ngày nay người ta còn tìm ra được một công dụng hết sức quan trọng của loài Catharanthus roseus đó là khả năng trị bệnh ung thư rất hiệu quả.[6] 1.2 Catharanthus roseus (L).G.Don [1] 1.2.1 Tên gọi Tên khoa học: Catharanthus roseus (L) G. Don; Vinca rosea L; Lochnera rosea Reich. 2 Tên khác: bông dừa, hoa hải đằng, trường xuân hoa, phjắc pót đông (Tày), dương giác, Madagascar periwinkle Họ: Trúc đào (Apocynaceae). 1.2.2 Đặc điểm thực vật Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40-60 cm, phân nhiều cành, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Mọc thành bụi dày. Lá mọc đối, thuôn dài, đầu lá hơi nhọn, cuống lá hẹp nhọn, dài 4-6cm, rộng 2-3 cm, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng, mặt dưới nhạt. Hoa trắng hoặc hồng, có mùi thơm. Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn. Quả gồm 2 đại, dài 2-4cm, rộng 2-3cm, mọc thẳng đứng, hơi ngả sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù, trong quả chứa 12-20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột nổi thành đường chạy dọc. Mùa hoa quả gần như quanh năm. Hình 1 : 1. Cành đang nở hoa; 2.Quả; 3.Hạt 3 1 2 3 Hình 2: Hạt của cây C.roseus 1.2.3 Phân bố Chi Catharanthus G.Don có nguồn gốc ở Madagascar. Loài dừa cạn được di nhập sang nhiều nước nhiệt đới ở Nam Á cũng như Đông Nam Á trong đó có Việt Nam và đảo Hải Nam Trung Quốc. Vào giữa thế kỷ 18, dừa cạn được trồng ở Paris, sau đó có mặt ở nhiều vườn thực vật khác ở Châu Âu. Ở Việt Nam, dừa cạn là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên-Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định và Phú Yên. Ngoài ra còn có ở Côn Đảo và Phú Quốc. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Dừa cạn còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc. 1.2.4 Phân loại [6] Catharanthus roseus G.Don. là nguồn giàu alkaloid thuộc chủng loại alkaloid terpenoid indole được cô lập từ 3 giống cây khác nhau: • ‘roseus’ với hoa màu tím hoặc hồng. • ‘albus’ với hoa màu trắng. • ‘ocellatus’ với hoa màu trắng nhụy đỏ. Trong đó hoa màu đỏ tím có hàm lượng vincristine và vinblastine cao nhất. 4 Hình 3: Ba giống C.roseus 1.2.5 Trồng trọt và thu hoạch Dừa cạn là loại cây ưa sáng, ưa ẩm và có khả năng chịu được hạn. Trong điều kiện trồng trọt, khi được cung cấp đầy đủ điều kiện cần thiết, cây sinh trưởng phát triển mạnh, khối lượng chất xanh thu được có thể cao gấp đôi cây mọc từ thiên nhiên. Cây mọc từ hạt trong tự nhiên vào khoảng 40%, nếu được xử lý có thể tăng lên 90% [9]. Cây trồng từ hạt ra hoa sau 4-5 tháng. Trong thời kì sinh trưởng mạnh, nếu bị cắt, cây tái sinh chồi khỏe. Nguồn dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tương đối dồi dào. Trước năm 1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1-3 tấn/năm. Những năm gần đây, lượng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm) thường xuyên hơn, nhưng chủ yếu là từ cây trồng tại Phú Yên. [1] Vào năm 1970, Viện Dược Liệu đã tiến hành nghiên cứu kỹ thuật trồng dừa cạn trên quy mô sản xuất. Cây được nhân giống bằng hạt, mỗi hecta cần gieo 500-700gr hạt trong vườn ươm. Thời vụ gieo hạt vào tháng 9-10 hoặc tháng 1-2. Cần ngâm hạt 3-4 5 giờ, vớt ra để ráo rồi gieo lên luống vườn ươm đã được chuẩn bị kỹ. Sau đó phủ rơm rồi tưới nước. Sau khoảng một tuần, hạt nảy mầm, cần tháo bỏ rơm rạ. Khi cây có 3-4 đôi lá thật (khoảng 40-45 ngày sau khi gieo) đánh đi trồng. Có thể gieo thẳng nhưng cách này tốn công chăm sóc. [1] Dừa cạn ưa đất pha cát, đất phù sa, hơi chịu hạn nhưng kém chịu úng. Đất cần làm kỹ, lên luống cao 20cm, mặt luống rộng 50-60cm, dung 10-15 tấn phân chuồng hoai mục và 120-150 kg super lân để bón lót. Trồng với khoảng cách 30x30cm, sau khi trồng cần tưới ngay để cây mau bén rễ. Tưới thúc cho mỗi hecta 100-200kg ure, tưới 2 lần, cách nhau 1 tháng. Mặc dù cây chịu được hạn nhưng phải giữ đủ ẩm thường xuyên. Chú ý thoát nước nhanh sau khi mưa lớn. Khi mới trồng, cây thường bị sâu bám phá hoại. Cây trong vườn có thể bị Phytophthora làm cho chết hàng loạt. Cần tỉa bớt cho đất thoáng và phun phòng bằng Boxdeaux. [1] Sau khi trồng 3-4 tháng, cây cho thu hoạch, cành mang lá dài 10-15cm được cắt về phơi sấy khô. Ở đất thoát nước và chăm bón tốt có thể thu hoạch nhiều lứa. Trung bình 1 hecta thu được 1-1,2 tấn lá khô mỗi lứa. Ta có thể thu rễ để chiết ajmalicin. 1.2.6 Một số công dụng chủ yếu Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng thân và lá phơi khô sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, làm thuốc điều kinh, tẩy giun, chữa sốt, săn da, chữa bệnh ngoài da. Ở Nam Châu Phi, Ấn Độ, châu Úc, quần đảo Antilles người dân dùng trị bệnh đái tháo đường. Có nơi dùng chữa tiêu hóa kém và lỵ. Chính nhờ thực nghiệm trên chuột mà các nhà khoa học Canada đã phát hiện tác dụng làm giảm bạch cầu của một số chất tách được từ dừa cạn và dẫn đến sự phát hiện ra chất vincaleucoblastin và 3 alkaloid khác cũng có tác dụng chống u là leurosin, leurocristin và leurosidin. Ngoài ra người ta còn phát hiện ra tác dụng tẩy giun khá mạnh, tác dụng lợi tiểu của catharanthin, vindolinin và vindolidin. Những thí nghiệm dùng trên người bệnh được bắt đầu vào những năm 1960 ở Mỹ, Pháp và một số nước khác, tuy nhiên có nhiều 6 ý kiến khác nhau. Mặc dù vậy, vì hiện nay chưa có loại thuốc nào khác tốt hơn, nên như cầu về dừa cạn vẫn cứ tăng lên. Cũng vì mục đích chữa các khối u nên khi mua dừa cạn, người ta đặc biệt chú ý tới hàm lượng alkaloid toàn phần, và trong số alkaloid toàn phần ấy có hàm lượng vincaleucoblastin là bao nhiêu.[1][6] CHƯƠNG 2: CÁC HỢP CHẤT ANKALOID TRONG CÂY C.roseus 2.1 Alkaloid trong loài Catharanthus roseus C.roseus đã thu được rất nhiều sự quan tâm từ công nghiệp dược phẩm, có khoảng 70 loại alkaloid hữu ích đã được phát hiện (G.H.Svobda và cộng sự (1991). Trong đó chiếm nhiều nhất là hai loại alkaloid vinblastine (vincaleukoblastine) và vincristine (leurocristine).[1] 2.1.1 Alkaloid 2.1.1.1 Khái niệm Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, và có tính base. Thường gặp trong nhiều loại thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật. 7 Đặc biệt, alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao đối với cơ thể con người và động vật, nhất là đối với hệ thần kinh. Với chỉ một lượng nhỏ alkaloid là chất độc gây chết người nhưng lại có khi nó là thần dược trị bệnh đặc hiệu. Hàm lượng alkaloid có thể đạt tới 10% trong các loại rau quả thông dụng như khoai tây, chè, cà phê.[7] 2.1.1.2 Phân loại Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử chung của chúng, dựa theo kiểu trao đổi chất được sử dụng để tạo ra phân tử. Khi không biết nhiều về tổng hợp sinh học của alkaloid, thì chúng được gộp nhóm theo tên của các hợp chất đã biết. Ví dụ: do các cấu trúc phân tử xuất hiện trong sản phẩm cuối cùng nên các alkaloid thuốc phiện đôi khi còn được gọi là các “phenanthren”. Hay gọi tên dựa theo nhóm động/thực vật mà từ đó người ta chiết xuất ra các alkaloid ví dụ như các alkaloid chiết từ cây dừa cạn vinca thì được gọi chung là các vinca alkaloid. Khi người ta biết nhiều hơn về một alkaloid cụ thể nào đó, thì việc gộp nhóm thường lấy theo tên gọi của amin quan trọng về mặt sinh học và nổi bật nhất trong tiến trình tổng hợp. Các nhóm ankaloid hiện nay gồm có: • Nhóm pyridin: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpin, cytisin, nicotin, spartein, pelletierin. • Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin • Nhóm tropan: atropin, cocain, ecgonin, scopolamin . • Nhóm quinolin: quinin, quinidin, dihydroquinin, dihydroquinidin, strychnin, brucin, veratrin, cevadin • Nhóm isoquinolin: Các alkaloid gốc thuốc phiện như : morphin, codein, thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin, berberin • Nhóm phenethylamin: mescalin, ephedrin, dopamin, amphetamin • Nhóm indol:  Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin. 8 [...]... ergolin: Các ancaloit từ ngũ cốc/cỏ như ergin, ergotamin, acid lysergic  Các beta-cacbolin: harmin, harmalin, yohimbin, reserpin, emetin  Các alkaloid từ chi Ba gạc (Rauwolfia): reserpin • Nhóm purin: Các xanthin ( caffein, theobromin, theophyllin) • Nhóm terpenoit:  Các alkaloid aconit: aconitin  Các steroit: solanin, samandari (các hợp chất amoni bậc bốn): muscarin, cholin, neurin  Các vinca... chính là vinblastine và vincristine được chiết xuất, nhiều tác giả đã bán tổng hợp được vinblastine từ cathanthin và vindolin có ở dừa cạn và - vincristine (có với hàm lượng thấp) từ vinblastine (có với hàm lượng cao hơn) Mai Ngọc Tâm và cộng sự, 1997 đã chứng minh rễ dừa cạn ở vùng Nha Trang chứa ajmalicin 0,18%, serpentin 0,27%, tetrahydroalstonin, tabersonin, - lochnericin, catharanthin và akuamin Nhiều... 2.2.3 Sinh tổng hợp [6] Vinblastine và vincristine được tạo thành từ sự ghép nối của hai monomer alkaloid: catharanthine (indole) và vindoline (dihydroindole), cả hai đều xuất hiện tự do trong cây Vincristine cũng có cấu trúc tương tự như vinblastine nhưng thay nhóm fromyl bằng một nhóm methyl trên phân tử nitrogen indole của vindoline Hình 9: Con đường chuyền hóa thành vinblastine và vincristine 14... PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO TẾ BÀO C.roseus 4.1 Nuôi cấy mô và ý nghĩa của nuôi cấy mô [2] 4.1.1 Giới thiệu Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường Kĩ thuật nuôi cấy mô tế... catharanthin (alkaloid loại iboga) và vindoline (alkaloid loại aspidosperma) Catharanthine và vindoline là các alkaloid monomeric indole, xuất hiện tự do trong cây 3’,4’-Anhydrovinblastine là chìa khoa trung gian từ sự ghép nối của catharanthine và vindoline và các enzyme liên quan là những peroxidase Sau đó nó được chuyển thành vinblastine 15 Hình 10: Con đường sinh tổng hợp Vinblastine Vinblastine được... mới hình thành hoặc các cành non Đối với nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng rất quan trọng Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokinine hoặc tổ hợp cytokinine với auxin Muốn tạo rễ thì bổ sung các auxin như NAA, IAA, Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus và nhân giống in vitro Nuôi cấy mô phân sinh còn được sử dụng để nghiên cứu quá... catharanthine (indole) và vindoline (dihydroindole) Mặc dù nhu cầu sử dụng vincristine nhiều hơn so với vinblastine nhưng cây lại sản xuất tỷ lệ vinblastine nhiều hơn May mắn thay, giờ đây ta có thể biến đổi vinblastine thành vincristine bằng phương pháp hóa học hay thông qua phương pháp vi sinh học “microbiological N-demethylation” sử dụng Streptomyces albogriseolus 16 Hình 11: Quá trình sinh tổng hợp vincristine... tính điều trị ung thư của vinblastine cũng hiệu quả như hoạt tính của vincristine, song nó lại là một độc tố thần kinh Desacetyl vinblastine (vindesine) được xem như là dẫn xuất của vinblastine được bán tổng hợp bởi Potier và cộng sự Vinorelbine (5’-norhydro Vinblastine), có hoạt tính chống ung thư rộng hơn và giảm phản ứng phụ là gây độc thần kinh Nó là cấu trúc được sửa đổi trên nhân catharanthine,... lượng rất lớn nguyên liệu thô để trích ly Hình 4: Công thức hóa học của leurosidine, vincristine, vinblastine, leurosine, catharine, vinamidine 11 Hình 5: Công thức hóa học của ajmalicin Hình 6: Công thức hóa học của vinflunine 2.2 Các vinca alkaloid chính 2.2.1 Vinbastine 2.2.1.1 Công thức Hình 7: Công thức hóa học của vinblastine Công thức phân tử: C48H58N4O9 Tên hóa học: dimethyl (2β,3β,4β,5α,12β,19α)-... thần kinh, ung thư vú, ung thư cổ và ung thư dạng nấm da Nó cũng được dùng chữa bệnh sacoma limpho, sacoma bạch huyết bào, bệnh da sacoma, chảy máu Kaposi, bệnh sacoma tế bào dưới Một số công thức sự kết hợp của Vinblastine với các thành phần khác: • ABVD (adriamycin, bleomycin, vinblastine, dacarbazine) • ChIVPP/EVA (chlorambucil, oncovin, procarbazine, prenisone , etoposide, vinblastine, adriamycin) . (1R,9R ,10 S ,11 R ,12 R ,19 R)- 11 -(acetyloxy)- 12 -ethyl- 4- [ (13 S ,15 S ,17 S)- 17 -ethyl- 17 -hydroxy- 13 -(methoxycarbonyl)- 1, 11 diazatetracyclo [13 .3 .1. 0 4 ,12 .0 5 ,10 ]nonadeca- 4 (12 ),5,7,9-tetraen-. Catharanthus roseus đó là khả năng trị bệnh ung thư rất hiệu quả.[6] 1. 2 Catharanthus roseus (L).G.Don [1] 1. 2 .1 Tên gọi Tên khoa học: Catharanthus roseus