Tiểu luận real time PCR

A-PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE(PCR): I ĐẠI CƯƠNG: ❖ Việc triển khai ứng dụng sinh học phân tử thường vấp phải trở ngại sổ lượng vật chất di truyền Các phương pháp tạo dòng in vivo giải vấn đề số lượng đòi hỏi thao tác phức tạp thời gian dài Sự đời nhiều phương pháp khuếch đại in vitro có chọn lọc,trong nôi tiếng phải ke đến phương pháp PCR,đã đảo lộn nguyên tắc việc tạo dòng co điển ,mở triển vọng ứng dụng to lớn ❖ Bằng cách sử dụng enzyme DNA polymerase Oligonucleotid tổng hợp nhân tạo mồi primer, đoạn DNA nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần mà không cần đưa vào tế bào vi khuẩn Đó kết tuyệt vời PCR 5' _3' 5' _3'5' _3‘ ❖ PCR (Polymerase Chain Reaction): phản ứng dây5' _3‘ chuyền tồng họp nhờ 3' -5' 3' 5'3' 5' 3* -5* 5' _3' 5' _3'5' _3' 3Ị polymerase 3' -5' - 3' 5’ ° Karry Mullis cộng phát minh vào năm 1985 Từ vi khuân có tính chịu nhiệtPCR Thermus Aquaticus tạimã YelloustonePark), sốngdựa vùng nước kỹ thuật xử lý (được in vitrotìm cácthấy chuỗi hoá di truyền DNA, sở nóng, phản người hợp phânDNA lập polymerase ứng sinh ta tổng theo Taq trình tự sau: cho phép ta khuếch đại đoạn DNA ớ1 Biến thành dây đơn (denature) vùng hệ gen trình tự hai đầu đoạn DNA biết có tính lập lập lại Phản ứng primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã dây sổ lượng tăng lên(gọi theolàhàm mũ anncaling) để có phân tử DNA Kéo dài dây template tiếnsốtrình ❖ Dựa vào trình tự Nu hai đầu đoạn, cặp oligonucleotic tổng hợp nhờ nhânprimer (extension) tạo, oligo tạo liên kết bổ sung với sọi đơn.Chúng sử dụng làm mồi đế Những phản ứng thực nhờ polymerase Taq polymerase thay đổi tổng họp chu kỳ nhiệt cách hợp lý, đặc biệt nhiệt độ cho denature nhiệt độ cho in vitro nhờ enzyme DNA polymerase annealing ❖ Như vậy, PCR kỹ thuật xử lý in vitro chuỗi mã hoá di truyền DNA cáchĨ.DNA polyiĩierase: phát cách đồng loạt enzyme có dâychức đơn DNA.tổng Toàn bộcác tiếndây trình hoàn ❖ triển DNAmột polymerase hợp đơnđược DNA thiện sựkiện biếncho chất củanào DNA tác đầusao cácchép dâyinđơn điều phép đó, cần tiến thiết, trình tông hợpđộng DNA nàyprimer có thêtại DNA vitro ❖ Polymerase phân lập tùThermus aquaticus có khả vật thể ổn định TẮC CỦA PCR nhiệt độ,II.NGUYÊN Taq polymerase vớiPHƯƠNG hai thuận PHÁP lợi chính: • Hồi phục sau phục hồi nhiệt không cần kco dài • Enzyme hoạt động nhiệt độ cao, lúc việc tác động primer ■S PCR chuấn: DNA mục tiêu mớ dây đôi,sau primer tác động hai đầu dây đơn,rồi DNA tông hợp nhò' Taq với deoxiribonucleotide s PCR neo:chỉ cần primer,một đuôi dG nhân tạo gắn vào đầu 3’ DNA mục tiêu,DNA khuếch đại nhiều lần nhờ primer có chuỗi mã biết trước,và primer thứ hai có oligo dc s PCR đảo, người ta dùng để khuếch đại đoạn phân tử kế cận chuồi mã DNA biết trước,phân tử DNA phân cắt nối lại enzyme đế tạo thành vòng tròn có tính chất monomer, sau DNA khuếch đại nhờ primer tương đồng với đầu chuồi mã đựơc biết trước Thiểt kế chu kỳ vói nhỉêt đô tương thích Nhiệt độ sử dụng phản ứng PCR phải xác định xác Mồi chu kỳ PCR có ba nhièt độ cần xác định sau: • Thời kỳ biến tính DNA, tách dây đôi thành dây đơn, nhiệt độ thiết kế 94°c, với nhiệt độ DNA tạo sợi đơn DNA, hoạt động dây (template) cho trình tổng hợp DNA • Thời kỳ lai primer DNA (annealing), nhiệt độ thay đổi 50-60°C Nhiệt độ tuỳ thuộc vào loại marker mà sử dụng, với chiều dài cụ oligonucleotide Chúng ta phải thử bước đế biết nhiệt độ cần thiết kế • Thời kỳ kéo dài dây DNA tổng họp nhò' Taq polymerase (extension),nhiệt độ thiết kế 72°c Giai đoạn annealing quan trọng nhất, giai đoạn này, kiện lai DNA-DNA xảy Neu nhiệt độ cao, không lai DNA; nhiệt độ thấp, việc lai DNA bị nhiều lồi Chính để thiết lập nhiệt độ cho chu kỳ PCR, người ta xác định nhiệt độ nóng chảy Tm với nhóm primer riêng biệt Chu kỳ khuếch đai a Số chu kv Thường dùng 30 chu kỳ cho trình khuếch đại PCR Neu thêm nhiều chu mong muốn Người ta cần có ethanol lần cuối qui trình chuấn bị DNA Với 10% ethanol, chưa có thê gây ảnh hưởng đến hoạt động Taq polimerase ❖ Điều ghi nhận quan trọng là: phải có mM EDTA chất đệm TE, sử dụng để hoà tan DNA.EDTA gắn với Mgí+, đe thể tích DNA mục tiêu không vượt 1/15 thể tích PCR 5.Primer DNA Trong PCR tiêu chuẩn, người ta cần có căp mồi Sự khuếch đại chuyên biệt đoạn DNA cần nghiên cứu, phải tuỳ thuộc vào cặp mồi tương xứng.c ả hai yếu tố: chiều dài primer thành phần C-G có ảnh hưởng quan trọng đổi với nhiệt độ trình tác động đầu dây đơn Nhiệt độ là: 2x (A+T)+4x (G+C) +5°c Neu có 50%G+C, chiều dài primer phải có kích thước tương ứng 18-20 Nu Một qui trình PCR cần thiết đê khuếch đại số lượng lớn chuồi DNA chuyên biệt gồm giai đoạn, giai đoạn có bước nhảy liên tiếp l.Biến tính (denaturation): Bước hệ thống khuếch đại PCR biến tính nhiệt DNA khuôn mẫu tăng nhiệt độ ống nghiệm đến 95°c Thêm vào đó, ống nhiệt (e.g Taq DNA polymerase chịu nhiệt tách biệt từ vi khuẩn Thermus aqaticus), bốn loại deoxyribonucleotide Nhiệt độ nhu cầu tối thiêu giai đoạn HỒỈ tính (annealing): Đối với bước thứ hai này, nhiệt độ hỗn hợp giảm từ từ xuống 55°c Trong suốt giai đoạn này, base mồi bắt cặp với mạch gốc theo nguyên tắc bổ sung Kéo dài (extension) Nhiệt độ tăng đến 75°c, nhiệt độ thuận lợi cho chức xúc tác • Đối vói qui trình chuẩn chu kỳ 25-35 phải thực hiên điều kiện: “Denature” 94-96°C 15 giây (hoặc lâu hơn) “annealing” 55°C(50-56°C) 30giây “extention” 72°c 1,5 phút Chu kỳ đuợc kết thúc “extension”ở 72°c 1,5 phút Sau người ta cho dừng hẳn bàng cách tồn trữ sản phẩm PCR 4°c ^ Phức tạp nhiệt độ giai đoạn “annealing” Chúng ta phải điều chỉnh để có khuếch đại tốt ghi nhận đa hình tốt điện di gel ^ Tóm lại qui trình chuẩn này, cần tuân thủ qui định sau: ■ Phuơng tiện hóa chất: Máy Thermal cycler (PE 9600 Perkin-Elmer) Mẩu DNA ly trích lOOng/pl Dung dịch stock dNTP(mồi dNTP mM) Taq polymerase (5Ư/pl Perkin-Elmer) Dung dịch stock lOxPCR buffer (buffer cuả Perkin-Elmercó 15mM MgCl2, 500mM kCl lOOmM Tris-HCl, pH 8,4, 0,1% gelatin,l% Triston X-100 DNA pl lOxdung dịch buffer 2,5 p Mỗi primer lpl Dung dịch stock dNTP \x\ Taq polymerase 0,1 ịi\ Chu kỳ nhiệt thí dụ Thêm nước cất hai lần, thermal cho cycler đủ 25 tìm jnl đa hình Sacl, clon BS3, 4kb nguời) 94°c phút, theo sau 30 chu kỳ 94 °c 30 giây 60 °Ctrong 30 giây 72 °c phút Giữ mẫu 4°c ■ ■ ■ ■ ■ Hạn chế: Kích thưổc trình tư cần khuếch đai giới hạn đầu tiên: PCR cho kết tốt với đoạn DNA có độ dài nhỏ 1,5 Kb Trong vài trường hợp PCR không hoạt động với nhừng đoạn lớn 3Kb Với độ dài lớn điều kiện tối ưu cho phản ứng phải xác định qua thực nghiệm Mức đỏ ngoai nhiễm cao: nguồn ngoại nhiễm lớn sản phẩm khuếch đại lần thao tác trước: việc mở nắp ống nghiệm sau mồi lần khuếch đại khoảng không gian kín phòng thí nghiệm khiến phân tử khuếch đại thoát khỏi ống nghiệm bay lơ lửng không khí bám vào tường, dụng cụ, thiết bị dễ Trước lần phản ứng kế tiếp, thêm vào dung dịch phản ứng enzyme uracylglycosylase, có tác dụng phân huỷ tất DNA mang dUTP nhiễm từ lần trước đồng thời enzyme bị phân huỷ nhiệt từ lần biến tính Sư trung thưc trình tồng hợp Taa polvmerase : việc tổng họp DNA in vitro nhờ Taq polymerase có độ xác không cao: 2.1CT4.Trong phản ứng với 30 chu kì, tần suất sai sổ tổng thể 0,25% Do trình tự có từ phương pháp PCR cần xác nhận lại bàng cách xác định trình tụ- Taq polymerase biểu tính xác thấp in vitro, làm xuất đột biến ngẫu nhiên bên vùng khuếch đại, đoạn khuếch đại phải xác định trình tụ khó kích thước lớn Ngày nhờ phát triển khoa học công nghệ làm đơn giản hoá phản ứng PCR cho phép sử dụng rộng rãi hầu hết phòng thí nghiệm sinh học phân tử routine proccdure IV THIẾT KẾ CÁC PRIMER Việc chọn lọc primer thử thách quan trọng muốn sử dụng PCR có hiệu độ trung thực cao Nhàm đạt thành công việc khuếch đại PCR, phải có thiết kế xác oligonucleotide primer Sequence primer đuơc chọn xác kích thước, vị trí sản phẩm PCR, nhiệt độ Tm vùng khuếch đại Primer thiết kế giúp tránh tạo sản phẩm PCR không chuyên biệt, giống tượng phân biệt cDNA DNA genome RNA-PCR 4.1.Thông số CO’ băn đế thiết kể prỉmer Mục đích thiết kế primer có cân hai kết quả: chuyên tính hiệu PCR: ❖ Sự chuyên tính xem xét sở xuất lần tượng priming nhầm tông số lần priming (sự lai primer dây template vị trí mục tiêu nó) ❖ Tính hiệu primer làm tiếp cận với lý thuyết kết sản phẩm, mồi chu kỳ PCR, cặp primer khuếch đại sản phẩm tính primer dây template giảm Người ta thường thiết kế primer có độ dài 1824 mer ❖ Mặt khác, primer ngắn, trình quấn đôi primer dây DNA nhanh, tạo thành dây đôi ổn định tổng họp DNA ❖ Thông thường, primer có 28-35 mer cần cho việc khuếch đại sequence có mức độ di hop cao • Có hai khả áp dụng thiết kế chiều dài primer: Khuếch đại nhhừng phần tử có tính đồng dạng (isoform)của protein họ protein loài sinh vật, cloning gen loài khác mà sequence cần thiết cho nhà nghiên cứu (dveksler ctv.1993) Khuếch đại sequence virut HĨV-1, mà biến thiên sequence, có mặt sequence, xác nhận có mặt bệnh virut gây Trong hai trường họp, người ta nhờ phần mềm máy tính đề thiết kế primer, nhằm so sánh tất sequence có liên quan mô tả vùng DNA mục tiêu với số lượng thấp biến thiên chuồi mã Khi chọn lựa primer để khuếch đại DNA từ loài sinh vật khác nhau, nên tránh chuồi mã vùng không giải mã 5’-3’ mRNA Bởi mức độ tương đồng (homology) • Vị trí đầu 3’ primer nên xác định cẩn thận, có tính chất định cho thành công PCR Khi xác định amino acid, hai base codon nó, base trường họp mã hoá codon đơn (methionine tryptophan), base dùng đầu 3’ Những cặp base hoàn chỉnh đầu 3’ primer template cho phép có kết mong muốn giảm thiểu tối đa tượng không tương xứng (mismatches) khoảng 5-6 nucleotide đầu 3’ primer Thông thường, thêm vào sequence liên quan đầu 5’ primer không làm thay đôi trình annealing Trong vài trường hợp, số lượng base nhiều lên có ý nghĩa, base không tương xứng với sequence dây template, thêm vào primer Sự khuếch đại 4-5 chu kỳ hoàn tất, điều kiện nhiệt độ annealing thấp Đối với nhũng primer ngắn hon 20 mer, Sugg ctv (1981) đề xuất công thức tính Tm liên hệ với base: Td=4(G+C)+2(A+T) 4.1.3 Hàm lươnọ GC Tm Primer PCR phải trì hàm lượng GC đến mức Những oligonucleotide có 20 base, với 50% G+C,thường có giá trị Tm khoảng 56620C,tạo điều kiện để trình annealing đạt kết tốt Hàm lượng GC Tm phải khớp với cặp primer thiết kế giá trị Tm lớn, hội cho priming nhầm cao Do thiết kế primer, phải ý đến hàm lượng GC, làm nhiều mẫu, có kinh nghiệm riêng thiết kế primer, việc chuyển đổi sequence RFLP sang STS marker 4.1.4 Chon loc không dưa Computer Primer phải chọn lọc từ vùng cô tả kỹ đầu 3’và đầu 5’của scquence chuyên tính Phương pháp thiết kế primer đơn giản là: chọn vùng có thiếu nucleotide đon đó.Phương pháp chọn lọc primer cách làm giảm hội xay tượng tương đồng primer-primer.một lần nữa, phải thận trọng cân nhắc chiều dài cặp primer, hàm lượng base,đê giá trị Tm primer xê xích vòng 2-3°C 4.2 Sử dung phần mềm đế thiết kế primer Công thức Suggs ctv( 1981 Mà:20Cx(A+T)+4°CxíG+C)đã trở nên phổ biến nhờ tính đơn giản tính xác Hai chương trình sử dụng khác chút cách tính toán, nhung cho primer chọn, nhập vào thông số giốnh Những sai biệt phép tính khác dẫn đến thứ tự ưu tiên tiêu chuấn chọn lọc áp dụng Người ta thực phưong án đổ dự đoán giá trị Tm sở thông số nhiệt động học Trong chương trình khác, người ta mô hình hoá nhiệt độ annealing dựa công thức phát triển từ đoạn phân tử DNA có độ dài 100 nucleotide (MeConaughy ctv 1969).Công trình nghiên cúư Rychlik ctv(1990)cho phép mô hình hoá nhiệt độ annealing tối hảo cặp primer Sau đó, Wu ctv (1991)đã dựa chiều dài primer, hàm lượng GC,để mô hình hoá nhiệt độ tối hảo Hầu hết chương trình nhằm tìm nhiệt độ annealing thích họp cho PCR V.CÁC CHỈ TIÊU ẢNH HƯỞNG ĐẾN PCR 1) DNA mẫu Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy DNA thật tinh nhiều kỳ thuật chẩn đoán PCR đạt kết tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng DNA mẫu sử dụng có khuynh hướng giảm (1 |ig xuống 100 ng) với việc sử dụng polymerase cho hiệu cao Hơn việc, giảm lượng mẫu ban đầu hạn chế khuếch đại “kí sinh” tạo sản phẩm phụ không mong muốn Một ưu diêm khác phương pháp PCR cho phép khuếch đại mẫu DNA không bảo quản tốt, bị phân huỷ phần vết máu lâu ngày, tinh dịch khô, hoá thạch, tóc, móng tay,của người chết 2) Enzyme Enzyme sử dụng đoạn Klenow DNA polymerase I không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp hiệu thấp ( phải thêm enzyme vào phần phản ứng sau lần biến tính enzyme cũ bị phân huỷ nhiệt, nhiệt độ lai thấp khiến khuếch đại ký sinh cao, ) Phương pháp PCR chuyên sang bước ngoặt với phát DNA polymerase chịu nhiệt tách chiết từ vi khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus En zym - Taq polymerase không bị phá huỷ nhiệt độ biến tính xúc tác tông hợp từ đầu đến cuối trình phản ứng Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác đưa thị trường với nhiều chức chuyên biệt hay hoàn thiện Tth polymerase, enzyme chiết tách từ Thermus thermophilus, có khả hoạt động enzyme phiên mã ngược có mặt RNA khuôn ion Mn++; với diện DNA khuôn ion Mg++’ Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại mẫu RNA khuôn thông qua hình thành cDNA 3) Mồi nhiệt độ lai Mồi tiêu quan trọng đổ đạt khuếch đại đặc trung có hiệu cao Việc chọn mồi giai đoạn định phương pháp PCR, phải tuân thủ sổ nguyên tắc: Trong thực tế, người ta không vượt 40 chu kỳ cho phản ứng PCR Sở dĩ phản ứng PCR diễn tiến qua giai đạn, giai đoạn đầu số lượng tăng theo cấp số nhân với tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau hiệu khuếch đại giảm dần nguyên nhân sau: • Sự phân huỷ cạn kiệt thành phần phản ứng • xuất sản phẩm phụ ức chế phản ứng • Các vừa tổng hợp không két hợp với mồi mà bắt cặp với • Số chu kỳ cho phản ứng tuỳ thuộc vào số lượng mẫu ban đầu Ví dụ, số lượng mẫu 10“ cần 25-30 chu kì, số lượng mẫu 102 103 số chu kì phải 35-40, 6) Thiết bị dụng cụ cho phản ứng PCR: Thực chất thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR cần đáp ứng yêu càu thay đổi nhiệt độ thật nhanh xác Các thiết bị cải tiến để tránh tối đa bốc nước trình phản ứng, hay cho phép tiến hành PCR mô tế bào, Tuy nhiên, kiểu thiết bị có đặc điểm khuếch đại riêng nen thí nghiệm nghiên cún cần tiến hành loại thiết bị Hơn nữa, ống nghiệm dùng cho phản ứng nghiên cứu phải thuộc kiểu đặc tính truyền nhiệt ống độ tiếp xúc ống phận tạo nhiệt thiết bị có ảnh hưởng lớn đến trình khuýech đại VI.TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN CHO PHẢN ỨNG PCR Ĩ.Sequence primer Thông thường người ta cần có primer chuỗi dài cỡ 18 nucleotide trở lên, áp dụng cho genome sinh vật thuộc eukaryote, primer ngắn -khoảng 10 nucleotidecho DNA clone hóa cosmid Tuy nhiên tùy theo loại primer tương hợp với mục tiêu lựa chọn marker phân tủ’ xét nghiệm PCR, người ta thường có primer marker có tính ngẫu nhiên RAPD ngắn (10-16 mer), STS marker cần primer có độ dài 20-24 mer Tuy nhiên, nên nhó' rằng, DNA chuồi mã nucleotide cách ngẫu nhiên, mà có đặc tính họ (gene families), máy thermal cycler thiết kế cho phép chung ta đưa vào nhiều nghiệm thức Td đê xác định nghiệm thức hảo Phàn ứng dung dich đêm Một ảnh hưởng có tính chất định nồng độ Mg2+,kề tác dụng chuyên biệt kết PCR.môi trường có tính chất ion làm cho dung dịch đệm trở nên động nhiều, nồng độ Mg2+ cao hay thấp tạo ảnh hưởng khác phản ứng PCR nồng độ cao Mg2+ sè làm cho phân tử DNA dây đôi ôn định hơn, ngăn ngừa biến chất hoàn toàn (sự mớ dây đế cho dây đơn)của sản phấm chu kỳ, làm cho kết PCR Lượng dư thừa Mg2+ làm cho tượng annealing giả xẩy thêm ổn định hơn, vị trí không dây đơn,cho nhửng sản phẩm không mong muốn với số lượng lớn, nhung mức độ chuyên tính thấp (Oste 1989) Ngược lại, nồng độ Mg2+quá thấp (3’ exonuclease Taq 4N polymerase phân cắt đầu 5’ đánh dấu huỳnh quang probe Do chất thị huỳnh quang - reporter phóng thích khỏi bắt cặp chất hấp thụ - quencher tín hiệu huỳnh quang tăng lên Mức độ huỳnh quang tương ứng với số DNA chuyên biệt mong đợi Khác với SYBR Green I, primer dimer sản phẩm DNA khuếch đại không đặc hiệu sê không cho tín hiệu huỳnh quang Như vậy, tín hiệu huỳnh quang ghi nhận giai đoạn kéo dài Độ mạnh tín hiệu huỳnh quang tích lũy tăng dần Tuy nhiên TaqMan probe cần phải đảm bảo J' TT1TTTTT1TTTTTTT1TTTTTTTTTTTT1TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT s @ Taq Phưong pháp miễn dịch Phưong pháp PCR Dựa protein ❖ Nguyên liệu Dựa DNA/cDNA Phân tích End-point, xác định dương tính hay âm tính5 Nguyên5‘liệu thành phâm Test định tính Test định lượng(Real Time v/ứng dụng: Master Không đủ nhạy đặc PCR)cũng ứng dụng vào lĩnh vực tương tự PCR truyền Real - timemix PCR hiệu mầu nhạy,đặc hiệuthu nhận chínhtín xáchiệu huỳnh quang tương ứng với số DNA đích thống.Rất Nhò' khả Không mắc tiền Mắc tiền pha cấp số, Real - time PCR mở rộng thêm nhiều ứng dụng hiệu PCR truyền thống (Applied Biosystems, 2004): Biến tính ❖ Định lượng hàm lượng virus, mức độ nhiễm virus,vi khuấnxhấn đoán viêm gan siêu vi B, phát nhanh vi sinh vật gây bệnh thực phẩm: Virio parahaemolyticus Bắt cặp Vibrio vulniĩicus gây bùng nổ ngộ độc thực phẩm,đặc biệt thủy sản ❖ Nối Nghiên dài cứu biểu gen: +Cho kết gen hoạt động mà định lượng mức Thay độ biểu mạch * IMĨĨT"ĨĨTT1TTT TTTTT m ill H lí \> hiệncủa gen limlli I y r +Tiếp cận phổ biến phối họp với phân tích microarray nhà Phân cắtnghiên Taq Q^ \N^ > cứu muốn địnhhợp lượngichính xác biểu Ihiện tâm khảo sát mô Hoàn tất tống r~i .I I I Hcủa I I Icác H Igen .Iquan IIIH IIIIIIIII r hình biếu nhiều gan thay đôi liên quan đến điều kiện thí Phát r TiIn111111111111111IM1111 í111111111111II1111nI I CÁC GIẢI PHÁP REAL -TIME PCR: ❖ Theo dõi phản ứng PCR xảy ❖ Định lượng nồng độ DNA mẫu trước phản ứng cách so sánh chu kì Ct mẫu với Ct chuẩn biết trước nồng độ.số lượng DNA đích ban đầu nhiều thời điểm (Ct) phát tín hiệu sản phẩm khuếch đại sớm ❖ Dùng Melt Curve để xác định đặc tính khuếch đại:xem sản phẩm Đối với tác nhân gây bệnh virus, Real - time PCR đóng vai trò quan trọng phát định lượng tác nhân gây bệnh Đặc biệt Real-Time PCR có vai trò chẩn đoán viêm gan siêu vi: • Phát định lượng HBV để định điều trị đặc hiệu theo dõi điều trị Phát định lượng HCV đế định điều trị đặc hiệu theo dõi điều trị Vì phải sử dung REAL TIME PCR ? Đây phương pháp PCR định lượng xác Độ nhạy cao Độ đặc hiệu Có thể nhiều loại gen lúc Có thể dùng melt curve để xác định đặc tính sản phẩm khuếch đại Toàn qui trình nhân phát diễn tube kín:rút ngắn thời gian, hạn chế nhiễm chéo VT/ƯU nhuọc điếm: định lượng xác số DNA tham gia phản ứng, quan sát trực tiếp • tiến trình khuếch đại diễn theo chu kỳ phản ứng Real - time PCR xảy Ngoài ra, Real - time PCR thê sô ưu diêm nôi bật: - Không cần điện di sau thực phản ứng Real - time PCR - Quy trình đơn giản, tiến trình thực nhanh, rút ngắn thời gian cho kết quả.,có thể lượng nhiều loại gen lúc thành cao Chẩn đoán phân tử Phân biệt Allelic/SNP ứng dụng hiệu trị liệu thuốc ❖ ❖ ❖ định [...]... sổ lượng DNA đích ban đầu rv/phưong pháp nhận tín hiệu Real -time khi phản ứng PCR đang diễn rai III/Nguyên lý định lưọng của phương pháp Real- Time PCR: ❖ Đê định lượng số bản sao ban đầu của mẫu cần xét nghiệm, khi thực hiện định lượng qua Real - time PCR cần chạy kèm với các chuẩn đã biết chính xác số bản sao ban đầu Khi phản ứng Real - time PCR kết thúc, giá trị chu kỳ ngưỡng của mẫu xét nghiệm... SYBR Green I, Real time PCR phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn ADN FAM,- HEX, TexaslàRed®, Cy™5, chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang Trong phản ứng Real - time PCR, quá trình nhân bản ADN đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp (Newton c R and Graham A., 1997) Real - time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản ADN bằng phản ứng PCR và đo độ... lượng chính xác số DNA tham gia phản ứng, quan sát trực tiếp • tiến trình khuếch đại đang diễn ra theo từng chu kỳ khi phản ứng Real - time PCR xảy ra Ngoài ra, Real - time PCR còn thê hiện một sô ưu diêm nôi bật: - Không cần điện di sau khi thực hiện phản ứng Real - time PCR - Quy trình đơn giản, tiến trình thực hiện nhanh, rút ngắn thời gian cho kết quả.,có thể lượng nhiều hơn một loại gen cùng một... Taq Phưong pháp miễn dịch Phưong pháp PCR Dựa trên protein ❖ Nguyên liệu Dựa trên DNA/cDNA Phân tích End-point, xác định dương tính hay âm tính5 Nguyên5‘liệu và thành phâm Test định tính Test định lượng (Real Time v/ứng dụng: Master Không đủ nhạy và đặc PCR) cũng được ứng dụng vào trong các lĩnh vực tương tự như PCR truyền Real - timemix PCR hiệu và mầu nhạy,đặc hiệuthu và nhận... này được tích lũy Hệ thống Real - time bao gồm máy luân nhiệt có hệ thống chiếu mẫu bàng tia uv và tín hiệu huỳnh quang được thu nhận qua CCD (charge coupled device) camera Ethidium bromide được thêm vào trong mồi hồn họp phản ứng Real - time Khi khoa có sựhọc khuếch số lượng ADN đôiReal ngày càng PCR, tăng, ❖ Ngày nay ,PCR các nhà khôngđại, ngừng cải tiến kỹ sợi thuật - Time đồng thời phát minh ra... PHÁP REAL -TIME PCR: ❖ Theo dõi phản ứng PCR đang xảy ra ❖ Định lượng nồng độ DNA mẫu trước phản ứng bằng cách so sánh chu kì Ct mẫu với Ct của các chuẩn đã biết trước nồng độ.số lượng DNA đích ban đầu càng nhiều thì thời điểm (Ct) phát hiện tín hiệu sản phẩm khuếch đại càng sớm ❖ Dùng Melt Curve để xác định đặc tính khuếch đại:xem trong sản phẩm Đối với tác nhân gây bệnh là virus, Real - time PCR đóng... trọng trong phát hiện và định lượng tác nhân gây bệnh này Đặc biệt Real- Time PCR có vai trò trong chẩn đoán viêm gan siêu vi: • Phát hiện và định lượng HBV để chỉ định điều trị đặc hiệu và theo dõi điều trị Phát hiện và định lượng HCV đế chỉ định điều trị đặc hiệu và theo dõi điều trị Vì sao phải sử dung REAL TIME PCR ? Đây là phương pháp PCR định lượng chính xác nhất Độ nhạy cao nhất Độ đặc hiệu Có thể... thuật PCR phát hiện dấu ấn di truyền đã có những đóng góp rất lớn trong khoa học hình sự 8 PCR vói việc định loại các mô: là một hứa hẹn đầy triển vọng do cho nhiều thống tin hơn phương pháp miễn dịch học B -REAL- TIME PCR (virus) ớ mức độ một phân tử (copy) trên một mẫu trước khi xuất hiện các biếu hiện sinh lý ❖ Vào năm 1992 - 1993, Higuchi và các cộng sự đã tiên phong phân tích PCR kinetic (PCR động)... probe bắt cặp với nhau, SYBR Green I chèn vào DNA sợi đôi Lần đầu tiên tiến hành Real- Time PCR, người ta dùng thuốc nhuộm Ethidium bromide, sau đó người ta dùng SYBR green, Khi mà DNA polymerase kéo dài phân tử thì các phân tử Hình 2.11 Nguyên tắc của Molecular Beacons probe PCR Product-Speciíìc Nucleotides ị 1 1 1 1 Primer 1 PCR Product Primer 2 TTTT^TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTn Khi probe tự do... timemix PCR hiệu và mầu nhạy,đặc hiệuthu và nhận chínhtín xáchiệu huỳnh quang tương ứng với số DNA đích ớ thống.Rất Nhò' khả năng Không mắc tiền Mắc tiền pha cấp số, Real - time PCR được mở rộng thêm nhiều ứng dụng mới và hiệu quả hơn PCR truyền thống (Applied Biosystems, 2004): Biến tính ❖ Định lượng hàm lượng virus, mức độ nhiễm virus,vi khuấnxhấn đoán viêm gan siêu vi B, phát hiện nhanh vi sinh ... nhận tín hiệu Real -time phản ứng PCR diễn rai III/Nguyên lý định lưọng phương pháp Real- Time PCR: ❖ Đê định lượng số ban đầu mẫu cần xét nghiệm, thực định lượng qua Real - time PCR cần chạy kèm... khuếch đại diễn theo chu kỳ phản ứng Real - time PCR xảy Ngoài ra, Real - time PCR thê sô ưu diêm nôi bật: - Không cần điện di sau thực phản ứng Real - time PCR - Quy trình đơn giản, tiến trình... thêm vào mồi hồn họp phản ứng Real - time Khi khoa có sựhọc khuếch số lượng ADN đôiReal ngày PCR, tăng, ❖ Ngày nay ,PCR nhà khôngđại, ngừng cải tiến kỹ sợi thuật - Time đồng thời phát minh chất