Tiểu luận real time PCR

Toàn bộ tiến trình được hoàn thiện do sự biến chất của DNA cần thiết, sự tác động của primer tại đầu các dây đơn PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hoá di truyền DNA, dựa trên c

A-PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE(PCR):

không cần đưa vào tế bào vi khuẩn Đó là kết quả tuyệt vời của PCR

❖ PCR (Polymerase Chain Reaction): phản ứng dây chuyền tồng họp nhờ polymerase

do Karry Mullis và các cộng sự phát minh vào năm 1985 Từ một vi khuân có tính chịu

nhiệt Thermus Aquaticus (được tìm thấy tại YelloustonePark), sống ớ vùng nước nóng,

người ta đã phân lập được Taq polymerase cho phép ta khuếch đại một đoạn DNA

vùng bất kì trong hệ gen khi trình tự hai đầu đoạn DNA đã biết có tính lập đi lập lại

lượng tăng lên theo hàm số mũ

❖ Dựa vào trình tự Nu ở hai đầu đoạn, các cặp oligonucleotic được tổng hợp

mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng sọi đơn.Chúng được sử dụng làm mồi đế

in vitro nhờ enzyme DNA polymerase

❖ Như vậy, PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hoá di truyền DNA bằng cách

phát triển một cách đồng loạt trên các dây đơn DNA Toàn bộ tiến trình được hoàn thiện

do sự biến chất của DNA cần thiết, sự tác động của primer tại đầu các dây đơn

PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hoá di truyền DNA, dựa trên cơ sở phản

ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 trình tự sau:

1. Biến thành dây đơn (denature)

2. Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây

template (gọi là tiến trình anncaling) để có phân tử DNA mới Kéo dài dây

primer (extension)

Những phản ứng này được thực hiện nhờ polymerase như Taq polymerase và sự thay đổichu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho denature và nhiệt độ cho annealing

nhiệt độ, đó là Taq polymerase với hai thuận lợi chính:

• Hồi phục sau khi phục hồi nhiệt không cần kco dài

• Enzyme này hoạt động ở nhiệt độ cao, lúc đó việc tác động của các primer ở

■S PCR chuấn: DNA mục tiêu mớ dây đôi,sau đó 2 primer tác động ớ hai

đầu

dây đơn,rồi DNA mới tông hợp nhò' Taq với 4 deoxiribonucleotide

s PCR neo:chỉ cần một primer,một đuôi dG nhân tạo được gắn vào đầu 3’

của

DNA mục tiêu,DNA được khuếch đại nhiều lần nhờ một primer có chuỗi mã đã

biết trước,và một primer thứ hai có oligo dc

s PCR đảo, người ta dùng nó để khuếch đại đoạn phân tử kế cận chuồi mã

2. Thiểt kế chu kỳ vói nhỉêt đô tương thích

Nhiệt độ sử dụng trong phản ứng PCR phải được xác địnhchính xác

Mồi chu kỳ của PCR có ba nhièt độ cần được xác định nhưsau:

• Thời kỳ biến tính DNA, tách dây đôi thành dây đơn,

nhiệt độ được thiết kế là 94°c, với nhiệt độ này DNA sẽ tạo ra

sợi đơn DNA, hoạt động như dây nền (template) cho quá trình

cần được thiết kế là bao nhiêu

• Thời kỳ kéo dài dây DNA mới được tổng họp nhò' Taq polymerase

(extension),nhiệt độ được thiết kế là 72°c

Giai đoạn annealing là quan trọng nhất, bởi vì trong giai đoạn này, sự kiện sự lai

DNA-DNA xảy ra Neu nhiệt độ quá cao, không lai được DNA; nếu nhiệt độ quá

lai DNA sẽ bị nhiều lồi Chính vì thế để thiết lập nhiệt độ cho chu kỳ PCR, người ta xác

định nhiệt độ nóng chảy Tm với từng nhóm primer riêng biệt

3. Chu kỳ khuếch đai

a Số chu kv

Thường dùng là 30 chu kỳ cho quá trình khuếch đại PCR Neu thêm nhiều chu

mong muốn Người ta cần có ethanol trong lần cuối của qui trình chuấn bị DNA Với

10% ethanol, nó vẫn chưa có thê gây ảnh hưởng đến hoạt động của Taq polimerase Điều ghi nhận quan trọng là: phải có một mM EDTA trong chất đệm TE, trong

nhiệt (e.g Taq DNA polymerase chịu nhiệt được tách biệt từ vi khuẩn Thermus aqaticus),

và bốn loại deoxyribonucleotide Nhiệt độ là nhu cầu tối thiêu trong giai đoạn này

2. HỒỈ tính (annealing):

Đối với bước thứ hai này, nhiệt độ của hỗn hợp giảm từ từ xuống 55°c Trong suốt

giai đoạn này, nhưng base mồi sẽ bắt cặp với mạch gốc theo nguyên tắc bổ sung

3. Kéo dài (extension)

Nhiệt độ tăng đến 75°c, ở nhiệt độ này thuận lợi cho chức năng xúc tác của

• Đối vói một qui trình chuẩn thì chu kỳ 25-35 phải thực hiên trong điều kiện:

“Denature” 94-96°C 15 giây (hoặc lâu hơn)

có khuếch đại tốt nhất và ghi nhận được đa hình tốt nhất khi điện di trên gel

^ Tóm lại trong qui trình chuẩn này, chúng ta cần tuân thủ các qui định sau:

■ Phuơng tiện và hóa chất:

■ Máy Thermal cycler (PE 9600 Perkin-Elmer)

■ Mẩu DNA ly trích lOOng/pl

■ Dung dịch stock của dNTP(mồi dNTP là 5 mM)

■ Taq polymerase (5Ư/pl Perkin-Elmer)

■ Dung dịch stock của lOxPCR buffer (buffer cuả Perkin-Elmercó 15mM MgCl2,

500mM kCl lOOmM Tris-HCl, pH 8,4, 0,1% gelatin,l% Triston X-100

được xác định qua thực nghiệm

2. Mức đỏ ngoai nhiễm cao : nguồn ngoại nhiễm lớn nhất là các sản phẩm

những lần thao tác trước: việc mở nắp các ống nghiệm sau mồi lần khuếch đại trong

khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm khiến các phân tử đã được

ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí sẽ bám vào tường, dụng cụ,

Trước lần phản ứng kế tiếp, thêm vào dung dịch phản ứng enzyme uracylglycosylase,

có tác dụng phân huỷ tất cả các DNA mang dUTP nhiễm từ lần trước đồng thời

bị phân huỷ bởi nhiệt ngay từ lần biến tính đầu tiên

3. Sư kém trung thưc của quá trình tồng hợp bởi Taa polvmerase : việc tổng

biểu hiện tính chính xác khá thấp in vitro, làm xuất hiện các đột biến ngẫu

vùng khuếch đại, vì thế đoạn được khuếch đại phải được xác định trình tụ

phân tử như là một routine proccdure

IV THIẾT KẾ CÁC PRIMER

Việc chọn lọc primer nào đó là một thử thách cực kỳ quan trọng khi chúng ta muốn

sử dụng PCR có hiệu quả và độ trung thực cao

Nhàm đạt được thành công trong việc khuếch đại của PCR, chúng ta phải có một

thiết kế chính xác về oligonucleotide primer

Sequence của primer đuơc chọn chính xác kích thước, vị trí của sản phẩm PCR, cũng

như nhiệt độ Tm vùng được khuếch đại Primer được thiết kế đúng có thể giúp chúng ta

tránh tạo ra những sản phẩm PCR không chuyên biệt, giống như hiện tượng phân biệt giữa

cDNA và DNA của genome trong RNA-PCR

4.1.Thông số CO’ băn đế thiết kể prỉmer

Mục đích của thiết kế primer là có được một cân bằng giữa hai kết quả: sự

và sự hiệu quả của PCR:

❖ Sự chuyên tính được xem xét trên cơ sở xuất hiện bao nhiêu lần hiện tượng priming

nhầm trên tông số lần priming (sự lai giữa primer và dây template tại vị trí mục

tính giữa primer và dây template sẽ giảm Người ta thường thiết kế primer có độ

• Có hai khả năng áp dụng trong thiết kế chiều dài của primer:

Khuếch đại nhhừng phần tử có tính đồng dạng (isoform)của protein hoặc một họprotein trong cùng một loài sinh vật, cũng như cloning một gen của loài khác mà sequence

của nó rất cần thiết cho nhà nghiên cứu (dveksler và ctv.1993)

Khuếch đại những sequence của virut như HĨV-1, mà sự biến thiên của

có mặt của sequence, sẽ xác nhận sự có mặt của bệnh do virut gây ra

Trong cả hai trường họp, người ta đều nhờ phần mềm của máy tính đề thiết kế primer,

nhằm so sánh tất cả các sequence có liên quan và mô tả vùng của DNA mục tiêu với số

lượng thấp nhất sự biến thiên của chuồi mã

Khi chọn lựa primer để khuếch đại DNA từ những loài sinh vật khác nhau, chúng

tránh chuồi mã ở vùng không giải mã được 5’-3’ của mRNA Bởi vì nó có thể không

cứ một mức độ tương đồng nào (homology)

•Vị trí đầu 3’ của primer nên được xác định cẩn thận, vì nó có tính chất quyết định

tryptophan), thì 2 hoặc 3 base đầu tiên này được dùng như đầu 3’

Những cặp base hoàn chỉnh giữa những đầu 3’ của primer và template cho phép

4.1.3. Hàm lươnọ GC và Tm

Primer của PCR phải duy trì được hàm lượng GC đến mức có thế được Nhữngoligonucleotide có 20 base, với 50% G+C,thường có giá trị Tm trong khoảng 56-620C,tạo

ra điều kiện để quá trình annealing đạt kết quả tốt Hàm lượng GC và Tm phải khớp với

một cặp primer sẽ được thiết kế nếu giá trị Tm càng lớn, cơ hội cho priming nhầm càng

cao

Do đó khi thiết kế primer, chúng ta phải chú ý đến hàm lượng GC, đôi khi do làm nhiềumẫu, chúng ta sẽ có những kinh nghiệm riêng trong thiết kế primer, nhất là việc

sequence của RFLP sang STS marker

4.1.4. Chon loc không dưa trên Computer

Primer phải được chọn lọc từ những vùng được cô tả rất kỹ ở đầu 3’và đầu 5’của mộtscquence rất chuyên tính nào đó Phương pháp thiết kế primer đơn giản ở đây là: chọn

những vùng có thiếu một nucleotide đon nào đó.Phương pháp chọn lọc primer như

4.2 Sử dung phần mềm đế thiết kế primer

Công thức đầu tiên của Suggs và ctv( 1981 Mà:20Cx(A+T)+4°CxíG+C)đã trở nên phổ biến

nhờ tính đơn giản và tính chính xác của nó

Hai chương trình sử dụng hơi khác nhau một chút về cách tính toán, nhung cùng cho ra

một primer được chọn, nếu chúng ta nhập vào những thông số cơ bản giốnh nhau.Những sai biệt do phép tính khác nhau dẫn đến thứ tự ưu tiên trong tiêu chuấn chọn lọc đã

chiều dài primer, hàm lượng GC,để mô hình hoá nhiệt độ tối hảo này

Hầu hết các chương trình đều nhằm tìm một nhiệt độ annealing thích họp cho PCR

V.CÁC CHỈ TIÊU ẢNH HƯỞNG ĐẾN PCR

thấp khiến sự khuếch đại ký sinh rất cao, ) Phương pháp PCR chuyên sang một bước

ngoặt mới cùng với sự phát hiện một DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ

chuyên biệt hay hoàn thiện hơn Tth polymerase, một enzyme chiết tách từ Thermusthermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA

khuôn và ion Mn++; nhưng với sự hiện diện của DNA khuôn và ion Mg++’ Tth pol

tác phản ứng khuếch đại bản mẫu là RNA khuôn thông qua sự hình thành cDNA

3) Mồi và nhiệt độ lai

Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất đổ đạt được một sự khuếch đại đặc trung và có hiệu quả

cao Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phải tuân thủ một

sổ nguyên tắc:

Trong thực tế, người ta không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR Sở dĩ như vậy

là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng

theo cấp số nhân với tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm

những nguyên nhân sau:

• Sự phân huỷ cạn và kiệt các thành phần của phản ứng

một nghiên cún cần được tiến hành trên cùng một loại thiết bị

Hơn nữa, ống nghiệm dùng cho phản ứng của cùng một nghiên cứu phải thuộc cùng mộtkiểu vì đặc tính truyền nhiệt của các ống này cũng như độ tiếp xúc giữa ống và bộ

nhiệt của thiết bị có ảnh hưởng lớn đến quá trình khuýech đại

VI.TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN CHO PHẢN ỨNG PCR

Ĩ.Sequence của primer

Thông thường người ta cần có primer chuỗi dài cỡ 18 nucleotide trở lên, áp dụng cho

genome của những sinh vật thuộc eukaryote, và primer ngắn -khoảng 10 nucleotidecho

những DNA được clone hóa như cosmid Tuy nhiên tùy theo loại primer tương hợp

primer có độ dài 20-24 mer

Tuy nhiên, chúng ta nên nhó' rằng, DNA không phải là chuồi mã của nhữngnucleotide một cách ngẫu nhiên, mà nó còn có đặc tính của những họ (gene families),

những máy thermal cycler được thiết kế cho phép chung ta đưa vào nhiều nghiệm thức Td

đê xác định nghiệm thức tôi hảo

3. Phàn ứng dung dich đêm

Một trong những ảnh hưởng có tính chất quyết định là nồng độ Mg2+,kề cả về tác dụngchuyên biệt và kết quả PCR.môi trường có tính chất ion như vậy làm cho dung dịch

quả PCR và sự chuêyn tính mong muốn

Môi trường đệm KC1 đã và đang được áp dụng rộng rãi, cũng có thế là buffer

dụng cho kỳ thuật PCR Tuy nhiên trong một vài loci, người ta thấy môi trường đệm

khó dùng cho khuếch đại sản phấm, chỉ trừ Mg2+ đã được lựa chọn

PCR của những loci giàu GC cho thấy: mức độ chuyên tính gia tăng khi

này đủ đê kiêm soát sự chuyên tính của phản ứng khuêch đại.

Chúng ta không nên sử dụng nồng độ cao hơn 2,5nM của enzym

locus nào đó cần được khuếch đại

Những protocol trước đây khuyến cáo primer ở nồng độ 3pM, nhưng với nồng

như vậy không những không cần thiết mà còn tạo ra bất lợi, vì quá thừa primer, dẫn

hình thành hiện tượng primer dimer, và hiện tượng priming

7. Chất ổn đinh hoat đông của enzvme

Những hoạt chât ôn định hoạt động của enzyme (enzyme stabilizers) cũng được

chú ý Nhiều nhà sản xuất hóa chất đã xem xét gelatin hoặc Triston x-100 là 1 trong những

buffer đễ tồn trữ enzyme Có trường hợp người ta sử dụng cả hai làm dung dịch đệm.Nhằm bảo quản và ôn định enzyme trong quá trình xử lý nhiệt của PCR, mỗi dung dịch

đệm trong phản ứng đều chứa gelatin ở nồng độ 0,01% và Triston X-100 ở nồng độ 0,1%

(v/v)

8.SỐ lưong DNA

Phân tử DNA ở đây hiếu theo nghĩa “DNA template” (dây nền)

Thí dụ genome của người, DNA có 125 ng/25pl được sử dụng Điều này tưng

Nguyên lý của kĩ thuật xét nghiệm băng PCR:tông hợp và nhân bản sao một đoạn DNA đặc

hiệu HIV từ một tế bào nhiễm nhờ phát hiện đirợc bằng điện di gel thạch

quả nhạy và đặc hiệu

Có thể chẩn đoán sớm nhiễm HIV ở giai đoạn tiềm tàng, phát hiện HIV ở trẻ sơ sinh và bà

mẹ bị nhiễm

2. PCR sản xuất đột biến: dùng PCR đề xóa đi hoặc cấy ghép một đột biến

tử DNA mục tiêu; giúp nghiên cứu chức năng tương lai của các protein cuối cùng

3. Trong clonỉng tái tố họp: chỉ cần một vài tế bào đích ban đầu có thể dùng

sao các đoạn DNA giống hệt nhau mà không cần phải li trích

5. Phát hiện vi sinh vật gây bệnh: bàng cách khuếch đại đoạn nucleotidc đặc

kết hợp nhiều phương pháp loại trừ ngoại nhiễm (phương pháp nội tại)

ó.Trong tiến hóa: nghiên cứu tiến hóa dựa trên cấu trúc phân tử của

(virus) ớ mức độ một phân tử (copy) trên một mẫu trước khi xuất hiện các biếu hiệnsinh lý.

Vào năm 1992 - 1993, Higuchi và các cộng sự đã tiên phong phân tích PCR kinetic

FAM, HEX, Texas Red®, Cy™5,

Real - time PCR là phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn ADNchuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang Trong phản ứng Real - time PCR,

quá trình nhân bản ADN đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp

(Newton c R and Graham A., 1997)

Real - time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản ADN bằng phản ứng

PCR và đo độ phát huỳnh quang, độ phát quang này tỷ lệ thuận với số lượng đoạn Dna

tạo thành (Nguyễn Thái Thủy, 2003)

Máy luân nhiệt

im imktầliMMI

-Hình 2.8 Hệ thống Real - time PCR

sáng huỳnh quang này sẽ qua bộ kính lọc phát sáng Kính lọc này sẽ chọn lọc các ánh

III/Nguyên lý định lưọng của phương pháp Real-Time PCR:

Đê định lượng số bản sao ban đầu của mẫu cần xét nghiệm, khi thực hiện định

❖

lượng

qua Real - time PCR cần chạy kèm với các chuẩn đã biết chính xác số bản sao ban đầu

Khi phản ứng Real - time PCR kết thúc, giá trị chu kỳ ngưỡng của mẫu xét nghiệm

giữa nông độ huỳnh quang đo đuợc và sô chu kỳ Tại vị trí căt này, tín hiệu huỳnh quang

vượt qua tín hiệu nền rõ rệt Chu kỳ ngưỡng của mẫu và chuẩn được xác định tại vị trí đó

❖ Đường chuẩn được hình thành dựa vào chu kỳ ngưỡng (đã được xác định ở

đổi ra sổ bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm

❖ CHƯ KÌ NGƯỠNG Ct (Treshold Cycle):nơi mà tín hiệu huỳnh quang cao hơn tín

hiệu nền một cách thấy rõ.Chu kì ngưỡng tương quan chặt chẽ với sổ lượng DNA đích

ban đầu

rv/phưong pháp nhận tín hiệu Real -time khi phản ứng PCR đang diễn rai

SYBR Green I chèn vào DNA sợi đôi

Lần đầu tiên tiến hành Real-Time PCR, người ta dùng thuốc nhuộm Ethidium bromide, sau

đó người ta dùng SYBR green, Khi mà DNA polymerase kéo dài phân tử thì các

huỳnh quang sáng gấp 50 đến 100 lần so với khi không gắn kết vào DNA

Hạn chế của SYBR Green I trong phát hiện sản phẩm PCR khuếch đại là sự phát hiện

DNA không đăc hiẽu Do mọi phân tử DNA đôi hiện diện trong phản ứng đều được định

lượng, bao gồm các sản phấm PCR không đặc hiệu và primer- dimer

2/ Molecular Beacons prohe:

Molecular Beacons probe được đánh dấu íluorophore (F-chất chỉ thị huỳnh