Đề tài thư viện gen (genomics library)

THƯ VIỆN GEN (GENOMICS LIBRARY) A) Đinh nghĩa: Đó trình chia nhở DNA gen thành phân đoạn nhân dòng chèn chúng vào tế bào chủ gọi lập thư viện gen (còn gọi ngân hàng gen) Một thư viện đầy đủ, theo định nghĩa, chứa tất DNA gen sinh vật nguồn B) Quá trình thảnh lâp môt thư viên gen: I Tách chiết DNA gen, DNA vectơ (như plasmid, phage ) II Cắt DNA gen vectơ sau tách chiết thành đoạn có kích thước định enzyme cắt giói hạn (RE) III Gắn DNA vào vectơ tạo DNA tái tổ họp IV Đưa DNA tái tố họp vào vật chủ (có vi khuẩn E.coli, nấm men .) V Te bào chủ nuôi cấy, hình thành dòng VI Sàng lọc thư viện gen đế nhận dạng trình tự đích I Tách chiết DNA: 1) Nguyên tắc chung: - Lấy mẫu vật (nuôi cấy vi sinh vật, nghiền mẫu mô động vật, thực vật nhiệt độc thấp) - Phá vỡ màng tế bào màng nhân - Loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu chủ yếu protein.(chiết xuất phenol) - Cô đặc DNA lại ethanol hay iso-propanol lạnh -Rửa lại DNA ethanol lạnh đem bảo quản DNA dung dịch TE (ở nhiệt độ thấp) DUNG DỊCH NUCLEIC AXID CÂN TINH SACH PHENOL BÃO HÒA TRONG Phá hủy thành tế bào Dịch trích tế bào f Phân hủy màng tế bào í— * J> Dich trích tế bào 2) Cách tiến hành tách chiết DNA gen ( DNA vi sinh vật, thực Ly tâm DNA, RNA, vật, động vật ) DNA vecto’ có protein tự nhiên (như plasmid, phage ): V ◄- - -Mảnh vỡ tế bào a) Tách chiết DNA total tế bào vi khuẩn Isolation of DNA from Buccal Swabs - Phá vỡ tế bào đế giải phóng thành phần tế bào: Sự phân hủy hóa học nói chung tác nhân công kích phá võ thành tế bào tác nhân khác phá vờ màng tế bào Việc sử dụng hóa chất phụ thuộc vào loại vi khuẩn, nhung với E.coĩi vi khuẩn có Sample quan hệ gần, việc làm suy yếu thành tế bào lysozyme hay ethylene diamin tetra acetate (EDTA) phức hợp hai Lysozyme enzyme có lòng trắng trứng chất tiết nước mắt, nước bọt, tiêu hóa hợp chất polymeric, chất giúp thành tế bào rắn Mặc 400 ụl EtOH khác, EDTA, tạo phức với ion Mg yếu+Bind tố 2cần thiết bảo quảnProtease cấu trúc bên Lyse with 20 ụl ụllysate QIAGEN X 610 màng tế bào, ngăn chặn enzyme celìular phân hủy DNA Trong nhiều trường hợp, vói EDTA hay lysozyme đủ đế phân giải tế bào vi khuẩn, thông thường người ta thêm vào chất tẩy sodium dodecyl sulphate (SDS) Chất tẩy tham gia vào trình thông qua việc rút phân tử lipid gây phá hủy màng tế bào i í X min, 8000 rpm Phá hủy tế bào VVash with X with 500 ụl AW1 X min, 8000 rpm Dry membrane X min, 14000 rpm Elute with 100 ụl AE Ly tâm dịch trích tế bòa để tách cặn không hòa tan Ị min, 8000 rpm i - Phần trích tế bào xử lý để rút thành phần, thu nhận DNA : Ngoài DNA, dịch chiết tế bào vi khuấn chứa lượng đáng kế protein RNA Vài bước quy trình dùng đế loại bỏ chất tạp nhiễm, lại DNA dạng tinh khiết Một cách tiêu chuấn đế loại protein tù’ dịch chiết tế bào cho phenol hỗn hợp tỉ lệ 1:1 phenol cloroíbrm Chất hữu co hòa tan tủa protein giữ lại nucleic acid (DNA RNA) dịch nước, sau qua ly tâm phân tách, tủa protein phân tử nằm lớp giữ dịch nước (DNA, RNA) lớp hữu phenol Dịch nước chứa acid nucleic sau rút trích pipette Loại bỏ tạp nhiễm protein thông qua xử lý phenol Ly tâm ► tách lớp DNA + RNA Proteins Phenol Với nhiều dịch chiết tế bào, thành phần protein nhiều việc trích chiết phenol không đủ đế tinh hoàn toàn acid nucleic vấn đề giải việc xử lý phenol nhiều lần có điều không mong muốn sau lần trộn bước ly tâm gây đứt gãy phân tử DNA Phương pháp xử lý dịch chiết tế bào dùng protease Pronase hay Proteinase K trước xử lý phenol Các enzyme phá gãy polypeptide thành nhũng đơn vị nhở hơn, đế dễ dàng phân tách phenol Các phân tử RNA, đặc biệt RNA thông tin (mRNA), phân tách nhờ xử lý phenol nhung chứa DNA lớp dịch nước Cách hiệu đế tách RNA dùng enzyme ribonuclease Phân hủy nhanh chóng phân tử thành đơn vị nhỏ ribonucleotide - Cô đặc dung dịch DNA thu Phương pháp cô đặc DNA sử dụng phổ biến ethanol precipitation Trong môi trường muối Na+ nhiệt độ -20°c thấp hơn, ethanol nguyên chất kết tủa cách hiệu acid nucleic polymeric Với dịch đặc DNA, ethanol tách lớp phần mẫu, phân tử tủa mặt tiếp xúc Một mẹo sử dụng đũa thủy tinh nhúng xuyên qua dịch ethanol dung dịch DNA, khuấy đũa dung dịch, phân tủ' DNA bám chặt vào đũa kéo khỏi dung dịch dạng sợi dài (hình a) Hơn nữa, dịch ethanol trộn với dịch loãng DNA, kết tủa thu máy ly tâm (hình b) Và sau hòa tan lại vào dung tích nước thích hợp Tủa ethanol có tiến tách rời dung dịch thành phần acid nucleic monomeric - Thu hồi DNA nhờ tủa Ethanol a) Ethanol nguyên chất tách lớp lên phần dịch cô đặc DNA Các sợi DNA tách tù' đũa thủy tinh b) Để dịch cô đặc nhất, ethanol thêm vào (với tỉ lệ 2,5 thể tích ethanol nguyên chất thể tích dung dịch DNA) thu DNA tủa phương pháp ly tâm b) Tách chiết total cell DNA từ sinh vật khác Vi khuẩn sinh vật để trích DNA yêu cầu Total DNA từ thực vật động vật sử dụng mục tiêu dự án kỹ thuật di truyền clone gene tù’ sinh vật khác Mặc dầu bước tinh DNA tương tự sinh vật, biến đổi phải lưu ý để phát nhũng đặc trung đặc biệt nhũng tế bào sử dụng Những hóa chất sử dụng cho việc phá vờ tế bào vi khẩn thường không phù hợp với sinh vật khác:ví dụ lysozyme, không tác động lên tế bào thực vật Các enzyme phân hủy đặc biệt sử dụng cho hầu hết loại thành tế bào thông thường kỹ thuật vật lý nghiền lạnh vật liệu cối chày hiệu Mặt khác, hầu hết tế bào độngvật thành tế bào phân giải cách đơn giản thông qua việc xử lý chất tẩy Một khám phá quan trọng khác thành phần sinh hóa tế bào sử dụng để ly trích DNA Ở hầu hết vi khuẩn, thành phần sinh hóa diện tế bào protein, DNA RNA, phải tiến hành việc chiết tách phenol hay xử lý protease, sau loại RNA ribonuclease, thu mẫu DNA tinh Tuy nhiên, phương pháp không đủ đế tinh tạo mẫu DNA tinh tế bào chứa lượng đáng kế chất sinh hóa khác Đặc biệt, vói mô thực vật phương pháp khó khăn chúng thường chứa lượng lớn carbohydrate, tách xử lý phenol.Thay vào phải sử dụng phương pháp khác Sử dụng chất tay cetyltrimethylammonium bromide (CTAB),tạo thành phức chất không hòa tan với acid nucleic Khi CTAB cho vào dịch chiết tế bào thực vật, phức hợp nucleic acid-CTAB kết tủa, tách rời carbohydrate, protein, chất gây nhiễm dịch Ket tủa sau thu nhận phương pháp ly tâm cho vào dung dịch muối NaCl IM, hòa tan phức chất Các acid nucleic cô đặc nhò' phương pháp ethanol RNA tách nhờ xử lý ribonuclease Phương pháp CTAB cho tinh DNA thực vật c) Tách chiết DNA total từ mô động vật Đe tạo dòng gen (genome) thực lai (Southern hybridization) DNA động vật cần điều chế DNA động vật có phân tử lượng lớn tạp nhiễm Nhung DNA dài thường dễ bị đứt enzyme phân giải tác động giới - vật lý nên điều chế phải sử dụng dụng cụ tiệt trùng tránh hút DNA hút có đầu lỗ nhỏ tránh lắc trộn mạnh Có the điều chế DNA từ mẫu vật đuợc bảo quản điều ché từ vật liệu tổ chức tươi tốt Lượng DNA thu thường phụ thuộc vào loại tố chức nhung thông thường tù’ gam tổ chức thu đuợc khoảng 10 mg DNA 1) Cắt nhỏ tổ chức nguyên liệu kéo đến độ 0,1 g Nếu tổ chức lẫn máu lông rủa truớc dung dịch TNM Trong trường họp mô ung thư thường lẫn nhiều mô hoại tử làm trước cần thiết, cần ý thực nước đá phòng lạnh đế tránh DNA bị phân giải (kế bước tiếp theo) ( Dung dịch TNM chứa Tris-HCl (pH 7,5) 20mM, NaCl 0,1M MgCL l,5mM.) 2) Cho vào gam tô chức 20 ml dung dịch TNM, nghiền nhuyễn (bằng homogenizer, nhu' Porter), quay li tâm 2.000 v/ph phút °c, thu cặn 3) Tráng cặn dung dịch TNE, đổ bỏ nuớc mặt Lại cho ml TNE vào trộn thành huyền dịch bố sung thêm TNE cho đủ 20 ml, trộn đảo ( Dung dịch TNE chứa Tris-HCl (pH 7,5) lOmM, NaCl 0,1M EDTA lmM.) 4) Thêm từ từ SDS 10% vừa thêm vừa trộn đảo nhẹ cho đạt mức 0,3% so tổng luợng Thêm dung dịch proteinase 10 mg/ml cho đạt đến mức % so tống luợng ủ dến qua dêm 60 °c 5) Thêm lượng tương đương phenoĩ, trộn đảo nhẹ khoảng đến đêm 6) Quay li tâm 3.000 v/ph 10 phút, dùng pipet có lồ to hút phần nuớc, tránh khuấy động phần phenol Lại chiết xuất phenol lần chloroíòrm lần 7) Thẩm tích đối lít TE qua ngày đêm có thay TE lần 8) Thêm RNase (DNase-free) mg/mì đến mức 1/50 thể tích, ủ 37 °c 9) Thêm lượng tương đương phenol, trộn đảo nhẹ 10) Li tâm 3.000 v/ph phút, hút lấy lớp nuớc pipet có lồ miệng lớn 11) Thẩm tích đối TE qua đêm có thay ngoại dịch 12) Cho DNA thu vào ống chất dẻo, bảo quản °c Với DNA động vật bảo quản 4-5 năm điều kiện Có nhiều loại vectơ dùng đế thành lập thư viện gen Nhung việc lựa chọn vectơ phụ thuộc vào: Te bào mang DNA tái tổ hợp đặc tính Thời gian biểu cần thiết Kích thước vật liệu di truyền cần thiết Phần nhóm trình bày việc tách chiết vectơ tự nhiên có tế bào vi sinh vật DNA plasmid DNA phage d) Tách chiết DNA plasmid Trong thí nghiệm phân tích gen thường cần luợng lớn plasmid với thí nghiệm sàng lọc dòng (clone screening) luợng nhỏ plasmid dủ Vì vậy, tùy vào mục đích thí nghiệm khác mà vận dụng phương pháp điều chế plasmid khác Nguyên tắc chung việc điều chế plasmid kỹ thuật tái tố hợp nguyên tắc chung việc điều chế plasmid có số phiên lớn (highcopy plasmids) Tiến trình bao gồm: 1) Huyền dịch hóa tế bào vi khuẩn dung dịch đệm, 2) Làm tan tế bào kiềm mạnh (pH cao, cần xử lý enzyme phân giải protein peptidoglycan vách tế bào vi khuấn, đặc biệt vi khuẩn Gram dương), 3) Hạ pH môi trường trung tính axit làm cho protein tế bào biến tính kéo theo DNA nhiễm sắc RNA bị rối lại với thành tủa, DNA plasmid có cấu trúc siêu xoắn nên không bị kéo vào hỗn hợp không tan dó, 4) Khử bỏ RNA sót RNase 5) Tách DNA plasmid tan nước khỏi thành phần không hòa tan li tâm tinh chế DNA ngắn (chiết xuất phenol chloroíbrm, kết tủa isopropyl alcohol, polyethylene glycol 6000, tức PEG 6000, ethanol muối Na, rửa bỏ muối khỏi DNA ethanol 70%) + Điều chế luợng nhỏ DNA plasmid: - Phương pháp Bỉrnboim: Phương pháp Bimboim chế DNA plasmid duợc gọi phuong pháp kiềm Mô tả duới cho việc điều chế DNA plasmid dòng kỹ thuật DNA tái tổ họp 1) Dùng que cấy tam vô trùng lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc trắng (của E.coli mang plasmid, đĩa thạch), cấy vào khoảng - ml môi truờng LB có chứa chất kháng sinh thích hợp (ví dụ ampicillin, 50 mg/ml 28 plasmid pGEMT ) Môi trường LB chứa 10 g tryptone, g yeast extract (cao nấm men), 10 g NaCl, hòa tan lít nước cất, điều chỉnh trung tính NaOH, hấp cao áp tiệt trùng 2) Bồi dưỡng - nhiệt dộ 37 °c 3) Chuyển 1,5 ml sang ống Eppendorf (phần lại nên bảo quản °C), quay li tâm phút với vận tốc 5.000 v/ph 4) Thêm 150 ml dung dịch glucose-lysozyme, trộn dều, đế nhiệt độ phòng phút Đế phút nhiệt độ phòng phút 37 °c Dung dịch glucose-lysozyme: glucose 50mM, Tris-HCl (pH 8,0) 25mM, EDTA lOmM lysozyme mg/ml 5) Thêm 200 ml dung dịch kiềm Trộn cách đảo nhẹ ống nghiệm, ý từ bước trở di không duợc lắc mạnh tránh tổn hại DNA Đế nước đá phút Dung dịch kiềm chứa NaOH 0,2N SDS 1% 6) Thêm 150 ml dung dịch potassium acetate °c, trộn dều, dế phút Dung dịch potassium acetate chứa 60 ml potassium citrate 5M, 11,5 ml acetic acid 28,5 mĩ H20 7) Quay li tâm với vận tốc 12.000 v/ph °c vòng 15 phút, chuyến nuớc mặt sang ống mới, bỏ phần cặn 8) Thêm 400 ml phenol-chloroíorm, trộn dều, quay li tâm phút với vận tốc 12.000v/ph 9) Chuyển phần nước sang ống mới, thêm khoảng 800 ml ethanol, trộn đế phút nhiệt độ phòng 10) Quay li tâm 12.000 v/ph phút, bỏ hết phần dịch lỏng 11) Rửa phần cặn ethanol 70%, hòa tan phần cặn 50 ml TE 12) Thêm 0,5 ml RNase A nồng độ 1,0 mg/ml (DNase-free), đế 37°c 13) Thêm 30 ml dung dịch polyethylene glycol-NaCl, đế giò' °c Dung dịch polyethylene glycol-NaCl chứa polyethylene glycol 6000 nồng độ 20% NaCl 2,5M 14) Li tâm 10 phút với vận tốc 12.000 v/ph Hút bỏ nuớc mặt 15) Rửa kết tủa ethanol 70%, đế khô hoàn toàn thêm 50 ml TE - Phương pháp đun sôi: 1) Thực buớc đầu từ đến phương pháp 2) Hòa phần cặn (vi khuẩn) 200 ml dung dịch STET Dung dịch STET chứa saccharose 8%, Triton X-100 0,5%, EDTA (pH 8,0) 50mM Tris-HCl (pH 8,0) lOmM 3) Thêm 20 ml dung dịch lysozyme Trộn đều, đế phút nhiệt độ phòng Dung dịch lysozyme chứa lysozyme 10 mg/ml, Tris-HCl (pH 8,0) lOmM Dung dịch lysozyme nên pha (chú ý hóa chất bảo quản lạnh, lấy cần đế cân nhiệt độ với nhiệt độ phòng mở nắp tránh đọng nuớc vào hóa chất lạnh), pha chuẩn bị truớc dung dịch glycerol 50% bảo quản -20 °c tốt 4) Đun cách thủy phút 5) Quay li tâm 12.000 v/ph 10 phút Loại bỏ cặn que tăm 6) Thêm vào nuớc mặt 200 ml isopropyl alcohoĩ, trộn, đế nhiệt dộ phòng Ophút 7) Quay li tâm 12.000 v/ph 10 phút °c, loại bỏ hết phần nuớc mặt 8) Thêm 150 ml dung dịch sodium acetate 0,3M (pH 5,0), hòa dều cho tan cho thêm 300 ml ethanol, trộn đế 10 phút -70 °c lâu hon 20 °c để kết tủa DNA 9) Quay li tâm 12.000 v/ph 10 phút °c, loại bỏ hoàn toàn nuớc mặt 10) Tráng cặn ethanol 70%, đế khô hoàn toàn hòa vào 50 ml TE 11) Xử lý RNase A (DNase-free) nồng độ cuối 10 mg/ml 12) Ket tủa ethanol tráng ethanol 70% hòa tan TE ta có DNA plasmid cắt enzyme hạn chế + Điều chế luợng lớn DNA plasmid - Nuôi cấy vi khuẩn 1) Lấy vi khuân từ khuấn lạc trắng que cấy tăm tiệt trùng vào ml môi truờng LB có thêm chất kháng sinh thích hợp (penicillin, chloramphenicol , tùy thuộc vào loại plasmid vector có mang gen kháng thuốc chất kháng sinh hay chất kháng sinh khác) 2) ủ 37 °c 3) Chuyến lứa cấy vi khuấn vào 400 ml môi truờng LB, tiếp tục nuôi cấy 37°c OD600 = ~ 0,8 4) Thêm ml chloramphenicol (dung dịch pha ethanol có nồng độ 34 mg/ml, bảo quản -20 °C), ủ tiếp khoảng - Buớc gây cảm ứng không cần thiết nhiều loại plasmid vector 5) Quay li tâm 5.000 v/ph 10 phút để tập trung tế bào Bỏ nuớc mặt Thêm vào cặn 40 ml dung dịch STE °c, trộn tạo huyền dịch tế bào Dung dịch STE chứa NaCl 0,1M, Tris-HCl (pH 7,8) 10mM EDTA lmM 6) Chuyến sang ống li tâm cỡ 50 ml, quay li tâm 5.000 v/ph 10 phút, loại bỏ nuớc mặt - Chiết xuất DNA 1) Cho vào (ống chuẩn bị bước mục trên) ml dung dịch glucose lysozyme, trộn tạo huyền dịch, để nhiệt độ phòng 10 phút 2) Thêm 14 ml dung dịch kiềm (chứa NaOH 0,2N SDS 1%), làm lạnh nuớc đá, vừa trộn nhẹ nhàng tránh làm đứt DNA, đế lạnh 10 phút 3) Thêm 10,5 mĩ potassium acetate, trộn đều, đế 10 phút băng hay nước đá 4) Quay li tâm 15.000 v/ph 20 phút °c, chuyến dịch sang ống nghiệm 50 mĩ (Faìcon, Corning ) 5) Thêm 0,6 lần isopropyl alcohol, trộn đều, đế 10 phút nhiệt độ phòng 6) Quay li tâm 3.000 v/ph 10 phút °c, loại bỏ hết phần nuớc mặt 7) Rửa cặn ethanol đế khô hoàn toàn (có thể dốc ngược ống giấy thấm, ý đế hở miệng ống cho thoáng khí làm nhanh trình bay ethanoĩ) Không cần làm khô chân không DNA khô khó hòa tan 8) Hòa tan vào TE - Điều chế plasmid li tâm phân đoạn mật độ cesium chloride (CsCl) 1) Cho 3,7 g CsCl (bột tinh thể) vào 3,5 ml dịch plasmid thêm 0,2 ml ethidium bromide 10 mg/ml Trộn cho CsCĨ tan hoàn toàn Lượng vừa đủ cho rotor máy li tâm siêu tốc 2) Chuyến dịch nêu sang ống nhựa chuyên dụng cho máy li tâm siêu tốc, ống chưa đầy hoàn toàn làm đầy CsCl paraTin lỏng, kiếm tra khối luợng ống đế dảm bảo rotor có khối lượng cân đối 3) Hàn ống gài miệng ống theo thiết kế 4) Ráp ống vào rotor máy li tâm, ý cân rotor Quay li tâm 55.000 v/ph 15 °c 15 (dùng rotor RPV 65 T Hitachi, chẳng hạn) 5) Tắt máy li tâm Nhẹ nhàng lấy rotor khỏi máy Tháo ống nhựa li tâm khỏi rotor, thông thường dịch hình thành hai băng tách biệt thấy duới ƯV (hình 6), băng duới DNA plasmid vòng khép kín (closed circular plasmid DNA) Phần duới đáy tập trung RNA Dùng kim tiêm chọc thủng phần ống hàn (hoặc mở nắp ống cài) cho thông khí (không thông khí hút chiết phần dịch phía qua kim tiêm) Giá ống li tâm vào kẹp đặt bên cạnh đèn tử ngoại đế soi, dùng kim tiêm chọc phần duới băng DNA plasmid, hút băng plasmid vào syringe, ý tránh hút phần khác, đặc biệt băng DNA khấc (nick) phân bố lớp Cho vào ống nghiệm cỡ 30 ml (ống Corex ) DNA đưt đoạn ^■:-V:E====|Ị -11 RNA Hình 6: Phương pháp hút chiết băng DNA plasmid sau li tâm dịch chênh lệch mật độ cesium chloride Chú ý mang găng tay, mặt nạ chống uv thực hiện, cấn thận không hút băng bao gồm DNA đứt đoạn phía RNA phía duới 6) Thêm vào lượng tương đương butanol (hoặc propanol), trộn li tâm 3.000 v/ph phút butanol (propanol) ethidium bromide nối lên trên, hút bở lớp lặp lại - lần dế loại bở hoàn toàn thuốc nhuộm (hết màu đuợc) 7) Thẩm tích đối TE để loại bỏ CsCl Nếu không thẩm tích áp dụng buớc sau đế loại trù’ CsCl Thêm hai lần TE, trộn thêm - lần ethanoĩ, quay li tâm 10.000 v/ph 20 phút °c, đố bỏ nuớc mặt, thấm cho nuớc, lại hòa tan 500 ml sodium acetate 3M cho thêm ethanol lần tích dịch ống (1 ml), để phút °c, quay li tâm đế thu tủa DNA plasmid II) Cắt DNA bô gen vả DNA vectơ enzyme cắt giới han (RE) - Enzyme cắt giới hạn: ( Restriction Enzyme ) Các enzyme giới hạn phân lập từ sinh vật prokaryote, có khả phân hủy DNA bacteriophage đế hạn chế khả sinh trưởng chúng vi khuân Hiện nay, người ta tìm thấy 900 enzyme giới hạn khác tù' khoảng 250 chủng vi sinh vật Enzyme giới hạn nhóm endonuclease khám phá vào cuối năm 1960 Stt m Ten en2\ mc EcdRÌ 10 Đầu tạo GIAAĨTC 3 CrTAAÍG 5\ G AATĨC 3\ CTTAA G Hmầ m RE cắt phân 5tử4AGCTT DNA ở3 5\ A vị trí cóAGCTT dãy mã nucleotide định mà chúngBảng có khả 1.1.năng Trình lự nhịn biết biết có khả sồ rn/yrat* cắt hạnthành ché liêu biểu đoạn có 3\ TTCGA A $DNA 3nhận TTOGAtA 5REcua trọng lượng kích thước khác Thuộc tính quan CTGCA G trọng enzyme giới PsA chọn sẵn hạn cho phép cắt DNA5ởCTGC4G vị trí G ACGTC d ACGTC Chính nhờ đặc tính enzyme mà người ta chia làm loại : rtị A nhận biết trình tự, sẽAAC di chuyển phân tử Hpuỉ +Loại ỉ: Khi enzyme 5\ GTT CAAÍ DNA đến vị trí cách TTG khoảng 1000-5000 nucleotide giải phóng vài chục 3\.-CAA nucleotide HpuU +Loại II: Enzyme ÓC OGG (không có hoạt tính nhận biết trình tự 5\ c cắt vị trí GGdC 3\-GGC c methyl hoá) nhận biết trình tự cắt DNA vị trí cách Haeũĩ +Loại III: Enzyme5 Gotoc 5- GG cc 3 khoảng 20 nucleotide 3\ cc GG OCtGG Nhưng thực tế sử dụng RE loại II nhóm BamH\ sử dụng thao tác sinh học tử GATOC 5\ G í^GATCC phân 3\ CCTAG G :fAGtG Bgn $ Vị trì nhặn biết Smu\ Xtnci GA 4GATCT 3 TCTAổtA 5\ A 3\ TCTAG A :[...]... một thư viện gen đặc biệt Neu việc tìm kiếm một gen nguyên vẹn thất bại, thì một thư viện khác có thế được lập ra bởi một RE khác và sàng lọc với mẫu dò ban đầu hoặc mẫu dò dẫn xuất tù' thư viện đầu tiên Mặt khác, như sẽ thảo luận ở phần sau trong chương trình này, các thư viện chứa các phân đoạn DNA lớn hơn gen của sinh vật sơ trung bình có thể được lập ra để tăng khả năng một sổ thành viên của thư viện. .. (vì viện vậy mà các đầy côngđủ ty khôngta thế DNA cáo đíchcủa đặcnhà biệtsản bởixuất vì thư không enzyme thư ng cung cấp luôn dung dịch đệm ) Vấn đề này có thể khắc phục được nhờ tạp ra một thư viện các RE khác nhau Hiện nay, người ta đã biết 3000 loại enzyme với hơn 230 trình tự cắt đặc hiệu + Rõ ràng, số lượng dòng của một thư viện bộ gen phụ thuộc vào quy mô mức độ bao phủ, kích thư c của bộ gen. .. đảm toàn bộ bộ gen, được chứa trong các dòng của thư viện, tống các DNA chèn trong các dòng của thư viện phải nhiều hơn ba lần hàm lượng DNA trong bộ gen VD: Nếu một bộ gen có 4 X 106 bp và kích thư c trung bình của mỗi đoạn chèn là 1.000 bp, thì cần phải 12.000 dòng cho ba lần phủ Đối với bộ gen người 3,3 X 109 bp thì cần khoảng 80.000 dòng nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn, có kích thư c đoạn chèn... hoat tính protein Lai DNA và các phép thử miễn dich họat động tốt cho nhiều loại gen và sản phẩm gen Neu gen đích tạo ra một enzyme mà bình thư ng không được tổng hợp bởi tế bào chủ, một phép thử đĩa trực tiếp (in situ) có thế được tiến hành đế nhận dạng các thành viên của thư viện mang gen đặc biệt mã hóa cho enzyme đó Những gen mã hóa cho a-amylaza, endoglucanaza, P-glucosidase, và nhiều enzyme khác... Thử nghiệm bổ trợ chức năng (di truyền) là một cách ứng dụng khác đế phân lập các gen mã hóa cho enzyme Quy trình bao gồm sự biến nạp tế bào chủ có khiếm khuyết di truyền đặc biệt bằng các plasmid của thư viện DNA được xây dựng từ một sinh vật kiểu dại bình thư ng và chọn lọc các tế bào biến nạp có chức năng bình thư ng Gen nhân dòng có thế bắt nguồn từ cùng một loài hoặc loài khác, sự bổ trợ chức năng... dòng nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn, có kích thư c đoạn chèn là 150.000 bp tạo ra một thư viện với bốn lần phủ kín Ta có công thức xác lập mối quan hệ: N = ln(l - P)/ln(l - f) N: là sổ dòng P: là xác suất tìm thấy của một gen đặc hiệu F: tỷ lệ giữa chiều dài của đoạn chèn trung bình và kích thư c của toàn bộ bộ gen - Một số chú khicác thiết lậpRE một phảnnằm ứngở thủy bởingẫu RE:nhiên một sổ + Cuối... cấp oxi bằng việc lắc với tốc độ 150-250 r.p.m trên trục quay, tế bào E.coli phân chia 20 phút một lần hoặc hơn cho đến khi dịch nuôi cấy đạt được một độ cực đại VI) Sảng loc thư viên gen dế nhân trình tư đích: Sau khi thư viện gen được tạo ra, cần phải nhận dạng các dòng với trình tự đích Các phương pháp thông dụng được sử dụng đế nhận dạng: - Lai DNA với mẫu dò DNA đánh dấu sau đó sàng lọc đế chọn... enzyme khác từ các sinh vật khác nhau được phân lập theo con đường này Trong một số trường hợp, các tế bào của một thư viện bộ gen được cấy lên môi trường có bố sung một cơ chất đặc hiệu; nếu cơ chất được thủy phân, một phản ứng so màu nhận dạng khuẩn lạc mang gen đích Ví dụ, để phát hiện ra một gen lipase vi khuẩn nhân dòng, các tế bào biến nạp được nuôi cấy với sự có mặt của trioleoglyxerol và thuốc nhuộm... màu cam khi soi dưới ánh sáng cực tím Các hệ thống phát hiện khác không dựa trên phản ứng phát quang đế nhận ra các gen đặc biệt Ví dụ, một tế bào biến nạp với gen mã hóa hydrolase axit mật từ Lactobacillus plantarum được phát hiện bằng cách cho sinh trưởng các thành viên của thư viện bộ gen với sự có mặt của muối mật Trong trường hợp này, khuân lạc hydrolase dương tính dễ dàng được nhận dạng do nó bị... trong số nhiều trình tự khả hũu cùng tương ứng với một trình tự amino acid , trình tự oĩigonucĩeotide (thư ng từ 100-1000 nucleotide) nào phù hợp nhất với thực tế Trình tự' này được tống hợp với số lượng lớn và được đánh dấu phóng xạ + Sàng ỉọc bang lai DNA mâu dò với DNA mục tiêu: Thư viện DNA bộ gen thư ng được sàng lọc bằng cách cấy các tế bào biến nạp lên môi trường sinh trưởng của một đĩa gốc và ... trình tự hoàn chỉnh gen đích có mặt thư viện gen đặc biệt Neu việc tìm kiếm gen nguyên vẹn thất bại, thư viện khác lập RE khác sàng lọc với mẫu dò ban đầu mẫu dò dẫn xuất tù' thư viện Mặt khác, thảo... thời gian phản ứng Đế bảo đảm toàn bộ gen, chứa dòng thư viện, tống DNA chèn dòng thư viện phải nhiều ba lần hàm lượng DNA gen VD: Nếu gen có X 106 bp kích thư c trung bình đoạn chèn 1.000 bp,... cho nhiều loại gen sản phẩm gen Neu gen đích tạo enzyme mà bình thư ng không tổng hợp tế bào chủ, phép thử đĩa trực tiếp (in situ) tiến hành đế nhận dạng thành viên thư viện mang gen đặc biệt mã