CÔNG NGHỆ ENZYME

CHƯƠNG CÔNG NGHỆ ENZYME Tài liệu tham khảo 10 Hóa sinh cơng nghiệp- Lê Ngọc Tú Cơng nghệ enzyme- Đặng Thị Thu Cơng nghệ enzyme- Nguyễn Trọng Cẩn Các tài liệu hóa sinh Động học q trình xúc tác sinh học- Trần Đình Toại Food enzymes- Dominic W.S Wong Biotechnology, volume 9- G.Reed and T.W Nagodawithana Food biotecnology- R.D King and P.S.J Cheetham Novel enzyme technology for food applications- Robert Rastall-CRC Press Enzyme in industry- Wolfgang Achle-Wiley VCH NỘI DUNG Khái niệm, tính chất, phân loại Cơ chế phản ứng Ứng dụng Động học enzyme Thu nhận enzyme Enzyme cố định Thiết bị phản ứng enzyme CHẤT XÚC TÁC - Thay đổi tốc độ phản ứng: dương, âm Giúp chuyển hóa lượng lớn chất phản ứng Tỉ lệ chất phản ứng: chất xúc tác lớn Sau phản ứng: không vào sản phẩm cuối, không biến đổi, không thay đổi số lượng H + O2  H2O Đường bốc cháy, không caramel hóa, rắc lên tàn thuốc (một số muối, oxit platine vô cơ) ENZYME- Khái niệm Chất xúc tác sinh học - Do sinh vật tổng hợp Xúc tác phản ứng thể Đặc tính: - Cường lực cao: 1g pepsin, 5kg protein trứng (2h), β-amylase, 4000 glucoside Đặc hiệu Xúc tác mềm= điều kiện bình thường: 30-50 C, pH trung tính, áp suất thường Bản chất: chủ yếu protein Back TÍNH ĐẶC HIỆU Chuyển hóa số chất không tạo sản phẩm phụ Tuyệt đối: chất đònh, vd urease Tương đối= đặc hiệu liên kết hóa học: lipase: liên kết ester Đặc hiệu nhóm= đặc hiệu liên kết + điều kiện Carboxypeptidase: peptide gần –COOH tự Đặc hiệu quang học: đồng phân, L D, cis trans Đặc hiệu môi trường: chymoptrypsin, trypsin BẢN CHẤT ENZYME- Protein  phân tử lượng lớn: 20-1000kDa  không qua màng bán thấm  Cầu tan nước  Có cấu trúc bậc 4 Dễ bò biến tính hoạt tính: nhiệt, acid, kiềm, kim loại  Lưỡng tính: âm, dương, trung hòa tùy pH Catalase Enzyme ENZYME CẤU TỬ ENZYME CẤU TỬ = ENZYME ĐƠN GIẢN = ENZYME PHỨC TẠP = CHỈ CÓ PROTEIN = PROTEIN + PHI PROTEIN (prosthetic coenzyme: kim loại, vitamine .) amylase GỌI TÊN TÊN THÔNG THƯỜNG: amylase, bromelin TÊN THƯƠNG MẠI: vd: neutrase emzyme dùng sx bia hãng Novo Đan Mạch THEO QUI ƯỚC QUỐC TẾ - Phần 1: tên chất đặc hiệu Phần 2: kiểu phản ứng enzyme xúc tác Phần 3: đuôi “ase” Vd: alcohol dehydrogenase= enzyme xúc tác phản ứng làm H rượu 10 a: Chất xúc tác sinh học chuyển S thành P b: Bộ phận chuyển đổi tín hiệu (transducer), chuyển thành tín hiệu điện c: khuếch đại tín hiệu d: xử lý tín hiệu e: biểu kết 172 ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM • • Là công cụ kiểm tra chất lượng thưc phẩm Theo dõi, đo lường nhanh, độ nhạy cao Đo nồng độ cholin Truyền thống: theo dõi phát triển vsv môi trường mẫu  xác, tốn thời gian, đắt tiền Biosensor: cholin oxidase cố đònh điện cực, sp H2O2 Cholin + O2  H2O2 + betain aldehyde betain aldehyde + O2  H2O2 + betain Thời gian 30s, phát 5-160mg/l 173 Điện cực có luciferase phát vi khuẩn thực phẩm ATP + luciferin sp ánh sáng vàng Kiểm tra hàm lượng chloramphenicol thủy sản Điện cực :kháng thể kháng thể chloramphenicol Trộn mẫu với enzyme tạo màu Rửa bỏ phần không gắn Phát nhờ màu xanh sản phẩm 174 ĐIỆN CỰC ENZYME Chất có hoạt tính sinh học enzyme Cố đònh E: - màng bán thấm, cho chất cần phân tích qua Gắn cộng hoá trò hấp phụ thiết bò chuyển tín hiệu E phải có tính đặc hiệu cao, ổn đònh điêu kiện bảo quản thường, thời gian phản ứng ngắn, sử dụng lại nhiều lần 175 ĐIỆN CỰC ENZYME PHỔ BIẾN Chất xác đònh Enzyme Sản phẩm Glucose Glucooxidase, catalase H O ,O 2 Saccharose Invertase, glucooxidase H O 2 Lactose β-galactosidase, glucooxydase H O 2 Ethanol Alcol oxidase H O 2 Urease NH +, CO2 Penicillase H Ure Penicillin 176 + 177 Enzyme ΔH (kJ/mol) Cholesterol oxidase 53 Chymotrypsin - 16 Glucose oxidase 80 Catalase 100 Penicillinase 67 Peptides Trypsin 10 - 30 Starch Amylase  8 Sucrose Invertase 20 Urea Urease 61 Uric acid Uricase 49 Chất phát Cholesterol Esters Glucose Hydrogen peroxide Penicillin G 178 TRIỂN VỌNG XU HƯỚNG NGÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME 179 XU HƯỚNG CÔNG NGHỆ ENZYME Tìm kiếm chọn lọc thêm nguồn enzyme từ tự nhiên Tận dụng triệt để enzyme vào công nghiệp Thiết kế, tạo enzyme nhờ vào kỹ thuật di truyền Dựa vào hiểu biết enzyme để tổng hợp chất xúc tác hữu Sử dụng kết hợp lúc nhiều enzyme để tăng hiệu 180 KỸ THUẬT DI TRUYỀN VÀ CÔNG NGHỆ ENZYME • Các enzyme từ vsv nguy hiểm, từ động vật, thực vật thời gian nuôi trồng tạo dòng vào vsv • Tạo E dễ sử dụng sản xuất Vd: gluco-isomease nhạy cảm với Ca • 2+ Chủng vsv tổng hợp enzyme hiệu suất cao nhờ mang nhiều copy gen mã hóa 181 BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC ENZYME Dùng kỹ thuật di truyền biến đối có đònh hướng Enzyme Thay đổi hoạt tính, v phản ứng, động học, enzyme dễ thu hồi hơn, phù hợp với điều kiện sản xuất (pH, nhiệt, ion .) Biến đổi vài aa mấu chốt E thay đổi lớn hoạt tính, tính chất enzyme 182 SỬ DỤNG CƠ CHẤT PHI TỰ NHIÊN Vận tốc phản ứng dùng chất phi tự nhiên cao thông thường ứng dụng: thay chất khác để sản xuất sp -( Vd: glucooxidase oxi hóa đường khử, oxi thường chất nhận e không đặc hiệu) thay oxi benzoquinon sp: hydroquinon (một chất hữu q-ngành ảnh, nông nghiệp, dược)  v cao benzoquinon tan tốt nước oxi 183 ENZYME NHÂN TẠO (synzyme) Thiết kế tâm hoạt động: vùng gắn chất, vùng xúc tác Synzyme tuân theo mô hình Michaelis-Menten, dễ bò biến tính, oxi hóa, thủy phân Nhiều tiềm chưa thực dược hòan toàn (thiếu thông tin cấu trúc không gian) Một vài enzyme nhân tạo dược tổng hợp thành công 184 TÁI TẠO COENZYME Coenzyme: phân tử hữu nhỏ, phi protein, không gắn chặt chẽ với enzyme, cần cho hoạt động enzyme Coenyme đắt, khó tái tạo Giải quyết: cố đònh coenzyme với enzyme (thường dùng thiết bò dạng màng, lỗ màng nhỏ coenzyme) chất mang (thường có M lớn, tan nước) Hiệu suất thấp, không ổn đòmh 185 AN TOÀN KHI SỬ DỤNG ENZYME TRONG THỰC PHẨM • Phần lớn enzyme không độc hại • Bản chất protein gây dò ứng tránh hít phải, tiếp xúc qua da thường chế phẩm dạng lỏng nếu phải dạng bột đóng gói vào capsule Enzyme dùng thực phẩm: nguồn gốc từ động thực vật, chủng vsv hại Nếu từ chủng có hại, cần phải kiểm tra trước đưa vào sử dụng 186 [...]... E khớp với S mềm dẻo 26 TÂM ĐIỀU HÒA Allosteric site Trên enzyme Khác vò trí tâm hoạt động Điều hoà hoạt động của enzyme Kết hợp với chất điều hòa thay đổi cấu trúc enzyme thay đổi hình thể tâm hoạt động thay đổi khả năng xúc tác của enzyme Chất điều hòa: kiềm hãm hoặc hoạt hóa 27 cartoon 28 29 HOẠT TÍNH ENZYME Là mức độ hoạt động của enzyme cần xác đònh hoạt tính 3 phương pháp: - Đo S mất đi... DỤNG CỦA ENZYME Trong phân tích - Cơ chất sản phẩm phát hiện - Phủ enzyme lên điện cực phát hiện 6 Độ nhạy cao (10 phương pháp hóa học) Sản xuất và đònh lượng kháng sinh - Kháng sinh bán tổng hợp: bền, ít độc, hoạt tính mạnh, không dò ứng Vsv kháng sinh enzyme kháng sinh bán tổng hợp Vd: penicillin (do Penicillin chrysogenum) penicillinase, acylase penicillinic acid 33 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME Một... hoạt hóa: 18 kcal/mol - Có xúc tác hóa học platin: 11,7 kcal/mol - Có enzyme: 5,5 kcal/mol Năng lượng hoạt hóa giảm tốc độ phản ứng tăng lên 19 20 CƠ CHẾ PHẢN ỨNG 3 giai đoạn E + S Giai đoạn 1: ES bằng liên kết yếu - Tạo phức enzyme- cơ chất (ES)  đứt liên kết đồng hóa trò + E Giai đoạn 3: Giai đoạn 2: - Biến đổi cơ chất - Kéo căng - Enzyme kết hợp với cơ chất P - Tạo sản phẩm (P) - Giải phóng E tự do... HOẠT TÍNH ENZYME Hoạt độ của một chế phẩm enzym: số UI trong 1ml hoặc 1mg Hoạt độ riêng phân tử: số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi 1 phân tử E Xác đònh hoạt tính E cần chú ý: - [S]: thích hợp, đủ nhưng không quá cao Cho chất hoạt hóa, chất làm bền vào trước, loại chất kiềm hãm pH thích hợp, ổn đònh Nhiệt độ: thấp hơn nhiệt tối ưu Thời gian:5-30phút Quá dài cần chất diệt vsv 31 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME. ..PHÂN LOẠI LỚP (class) LỚP PHỤ cùng tính chất đặc trưng cho phản ứng do enzyme xúc tác 6 lớp cùng lớp nhưng tác động lên nhóm chức hoặc liên kết khác (subclass) NHÓM cùng lớp phụ, cơ chất khác (section) 11 6 LỚP ENZYME EC 1: Oxyreductase: oxi hóa khử EC 2: Transferase: chuyển nhóm chức EC 3: Hydrolase: thủy phân EC 4: Lyase: tách nhóm chức không... penicillinase, acylase penicillinic acid 33 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME Một số ngành công nghiệp khác: - Thuộc da: protease làm mềm, tách lông, da Giặt tẩy Mỹ phẩm Giấy Giải quyết vấn đề năng lượng - Hydrolase, năng lượng mặt trời - Chuyển H2O thành H2  Chuyển năng lượng mặt trời thành năng lượng dự trữ - H2 tạo năng lượng không ô nhiễm 34 ĐỘNG HỌC ENZYME 35 VẬN TỐC PHẢN ỨNG • nA + mB  pC + qD Vận tốc phản ứng v=?... tách nhóm chức không cần nước EC 5: isomerase: đồng phân hóa EC 6: ligase: tạo liên kết có ATP tham gia 12 OXYREDUCTASE: oxi hóa khử Có 4 nhóm • - Dehydrogenase: Tách H trực tiếp từ cơ chất + + Có các coenzyme: NAD , NADP , Có vai trò trong sinh tổng hợp Vd: alcohol dehydrogenase, chuyển rượu thành aldehyd CH3CH2OH + NAD +  CH3CHO + H + Oxidase - Chuyển e đến Oxi oxi có khả năng kết hợp với proton... đoạn 2: - Biến đổi cơ chất - Kéo căng - Enzyme kết hợp với cơ chất P - Tạo sản phẩm (P) - Giải phóng E tự do - Xảy ra nhanh, cần ít năng lượng 21 TRUNG TÂM HOẠT ĐỘNG • • - Là một phần rất nhỏ của phân tử enzyme Gồm: Tâm xúc tác: tham gia vào hoạt động xúc tác Miền xúc tác: tham gia tạo liên kết với cơ chất 22 TRUNG TÂM HOẠT ĐỘNG • Tâm hoạt động có thể là: - Các nhóm chức của phần protein - Các nhóm ngoại... acid amin sang α-ketoacid acid amin mới Phospho-transferase (kinase): chuyển gốc phosphat từ ATP đến –OH của alcohol hoặc đường 15 HYDROLASE Xúc tác phản ứng thủy phân, luôn có nước tham gia Không cần coenzyme Quan trọng trong quá trình tiêu hóa - Peptihydrolase: thủy phân liên kết peptide Lipase (esterase): thủy phân liên kết ester trong dầu mỡ Glycoside hydrolase: thủy phân glucoside trong tinh bột, ... - Tạo phức enzyme-cơ chất (ES)  đứt liên kết đồng hóa trò + E Giai đoạn 3: Giai đoạn 2: - Biến đổi chất - Kéo căng - Enzyme kết hợp với chất P - Tạo sản phẩm (P) - Giải phóng E tự - Xảy nhanh,... volume 9- G.Reed and T.W Nagodawithana Food biotecnology- R.D King and P.S.J Cheetham Novel enzyme technology for food applications- Robert Rastall-CRC Press Enzyme in industry- Wolfgang Achle-Wiley... sinh cơng nghiệp- Lê Ngọc Tú Cơng nghệ enzyme- Đặng Thị Thu Cơng nghệ enzyme- Nguyễn Trọng Cẩn Các tài liệu hóa sinh Động học q trình xúc tác sinh học- Trần Đình Toại Food enzymes- Dominic W.S