I. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PECTINASE 1.1. Enzyme pectinase là gì? Hình 1. Enzyme petinase Hệ enzyme pectinase là nhóm enzyme xúc tác sự phân cắt các hợp chất pectin thành các hợp phần nhỏ hơn, nó có khả năng xúc tác và có tính đặc hiệu cao, vì vậy chúng có thể làm biến đổi nhanh chóng về mặt cấu trúc hoá học phân tử pectin trong nguyên liệu mà không gây ảnh hưởng gì tới các chất khác có trong thành phần nguyên liệu đó. Hơn nữa, các cơ chất chủ yếu có trong thành phần của quả không ở dạng hoà tan được lại là cơ chất mà các enzyme này rất dễ tác dụng để chuyển hoá thành nguyên liệu hoà tan. Vì vậy, phương pháp sử dụng enzyme pectinase để làm biến đổi hoặc loại bỏ pectin trong chế biến nước quả đã được ứng dụng rất rộng rãi, trở thành một phương pháp quan trọng trong vài thập kỷ qua. Nhiệm vụ của chúng như một chất xúc tác sinh học dưới điều kiện pH nhẹ và nhiệt độ, nồng độ xác định. 1.2. Lịch sử phát triển của hệ enzyme pectinase Từ thập kỉ 60 của thế kỷ XX, người ta đã tìm ra cấu trúc phân tử và cơ chế hoạt động của loại enzyme này, và lập tức ứng dụng nó trong việc sản xuất nước quả. Và ngay bước đầu tiên, pectinase đã được nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất nước quả trong và nước quả cô đặc bằng phương pháp thử và sai. Theo danh pháp cũ, các enzyme phân giải pectin có tên gọi là pectaza và pectinase. Năm 1840, E.Freming đã phát hiện ra enzyme pectaza trong nước ép cà rốt, và sau đó G.Betrand và A.Mullevre lại tìm được enzyme này trong nước ép cà chua. Vào khoảng năm 1898, E.Bourquelot và H.Heisey tiếp tục phát hiện được enzyme pectinase trong đại mạch nảy mầm. Cho tới ngày nay người ta đã biết hệ enzyme pectinase có rất nhiều loại và đặc biệt một số loại đã được nghiên cứu rất kĩ lưỡng. 1.3. Cơ chất của enzyme pectinase Hợp chất pectin là cơ chất của enzyme pectinase. Đó là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, do các axit galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết glicozit - l,4 tạo nên. Trong thực vật, pectin thường tồn tại dưới ba dạng: pectin hoà tan, axit pectinic và protopectin. - Protopectin: là hợp chất có cấu tạo hoá học rất phức tạp và không hòa tan trong nước, protopectin tạo cho quả xanh có độ cứng nhất định. Thành phần của protopectin bao gồm các chuỗi axit polygalacturonic, các phân tử xenluloza, các ion Ca ++ , Mg ++ , các gốc axit photphoric, axit axetic và đường; khi thuỷ phân bằng enzyme sẽ giải phóng ra pectin hoà tan. - Pectin (pectin hoà tan): là hợp chất có chứa chuỗi polygalacturonic mà độ metoxyl hoá ở vị trí C6 rất cao (trong pectin tự nhiên có khoảng hai phần ba nhóm cacboxyl được este hoá bởi metanol). Khi độ metoxyl hoá tăng thì khả năng tạo gel của pectin càng lớn, khả năng này là lớn nhất trong dung dịch đường nồng độ 65% và môi trường axit. - Axit pectinic: là hợp chất bao gồm các chuỗi axit polygalacturonic có độ metoxyl hoá thấp (số nhóm cacboxyl được este hoá bởi metanol chỉ chiếm dưới một phần ba trong tổng số). Do độ metoxyl hoá thấp nên axit pectinic ít có khả năng tạo gel, song nó lại dễ tạo kết tủa với Ca ++ . 1.4. Phân loại Gồm 2 nhóm: Pectinmetylesterase (Pectinhydrolase) và Polygalacturonase (Polygalacturonit-glucanhydrolase). 1.4.1. Pectinesterase (Pectinhydrolaza) - Kiểu phản ứng: Thủy phân liên kết este giữa gốc rượu và gốc axit trong phân tử pectin hoặc axit pectinic. - Sản phẩm: Methanol và axit polygalacturonic. - pH tối ưu: 5,0 – 8,5 (nguồn thực vật), 4,5 – 5,5 (nguồn vi sinh vật) - Nhiệt độ tối ưu: 30 – 45 0 C, bị vô hoạt ở 55 – 60 0 C (nguồn nấm mốc). 1.4.2. Polygalacturonase (Polygalacturonit-glucanhydrolase) 1.4.2.1. Polymethylgalacturonase (PMG) Enzyme thủy phân các este methylic của axit polygalacturonic. - Phân loại: Dựa vào vị trí phân cắt liên kết 1-4-glycozit ở trong hay ở cuối và đầu mạch, chia làm 2 nhóm: + Endoglucosidase-polymethylgalacturonase I (Endo – PMG – I) Enzyme có tính chất dịch hóa, pectin có mức độ metoxyl hóa càng cao (nhiều gốc metoxyl – OCH 3 ) thì bị thủy phân càng nhanh và triệt để. Trong môi trường khi có mặt pectinesterase thì enzyme này càng bị giảm hoạt lực. Phổ biến trong các loại nấm mốc: A.Niger, A.Awamori, Botrytiscinezea, Neurispora crassa. + Exoglucosidase-polymethylgalacturonase III (Exo – PMG – III) Enzyme có tính chất đường hóa, có khả năng cắt từng gốc monome axit galacturonic ra khỏi mạch băt đầu từ đầu không khử có nhóm metoxyl (-OCH 3 ) - Sản phẩm: axit galacturonic. - pH tối ưu: 4 – 4,5 - Nhiệt độ tối ưu: 40 – 50 0 C - Các enzyme thường gặp: pectin lyase, pectat lyase. - Kiểu phản ứng: Phân cắt liên kết 1-4-glycozit của phân tử polygalacturonic. - Cơ chế phản ứng: chuyển hydro của C3-C4 của một đơn vị axit galacturonic sang C1 của một axit galacturonic khác và tạo nối đôi giữa C4-C5. 1.4.2.2. Polygalacturonase + Endoglucosidase-polygalacturonase II (Endo – PG – II) Là enzyme có tính chất dịch hóa, chit thủy phân cơ chất khi có mặt nhóm – COOH tự do. Hoạt độ của enzyme tăng lên nhiều khi cơ chất được xử lý trước bằng pectinesterase (để tạo ra nhiều gốc –COOH tự do). Được tổng hợp bởi nấm mốc và vi khuẩn. + Exoglucosidase-polygalacturonase IV (Exo – PG – IV) Thủy phân các lien kết gắn với nhóm –COOH tự do ở đầu hay cuối mạch. 1.5. Các nguồn thu nhận enzyme pectinase Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ vi sinh vật (thường là nấm mốc: A.wamori, A.niger). Có 2 phương pháp sản xuất pectinase: - Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt - Thu nhận chế phẩm enzyme từ canh trường bề sâu + Phương pháp hiếu khí + Phương pháp yếm khí 1.6. Ứng dụng của enzyme pectinase trong côngnghệ thực phẩm Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm sau: - Sản xuất rượu vang; - Sản xuất nước quả và nước uống không có cồn; - Sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt nhừ, mứt đông,… - Sản xuất nước giải khát; - Sản xuất cà phê và cà phê hòa tan. II. ỨNG DỤNG ENZYME PECTINASE TRONG SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ 2.1. Các chế phẩm enzyme pectinase Để quy định các yêu cầu phù hợp với đặc điểm nguyên liệu rau quả và phù hợp với mục đích sử dụng có thể phân chia các chế phẩm enzyme thành 6 nhóm: - Các chế phẩm dùng để sản xuất nước quả không trong để tăng hiệu suất thu hồi và tăng khả năng trích ly. - Các chế phẩm dùng để sản xuất nước quả trong chứa pectin để tăng hiệu suất thu hồi và tăng khả năng trích ly, đảm bảo thuỷ phân hoàn toàn các chất protein và pectin. - Các chế phẩm gây rữa mô quả làm tăng hiệu suất thu hồi và tăng độ đồng hoá của nước quả với thịt quả. - Các chế phẩm dùng để sản xuất bán thành phẩm rượu vang quả trong suốt, tăng hiệu suất thu hồi và tăng khả năng trích ly của bán thành phẩm đó. - Các chế phẩm có khả năng ngăn cản quá trình oxy hoá và cản trở sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí trong nước quả, trong rượu vang và trong nước uống không cồn. - Các chế phẩm xúc tác quá trình hoàn nguyên của xiro đường trong sản xuất xiro thương phẩm và thức uống không cồn. 2.2. Cơ chế tác động của enzyme pectinase 2.2.1. Enzyme pectinesterase (PE) Sự phân huỷ chỉ xảy ra ở liên kết este liền kề với nhóm cacboxyl tự do. Như vậy số liên kết este trong phân tử pectin và axit pectinic có thể bị thuỷ phân hoàn toàn hay một lần. Hình 2 . Cơ chế tác dụng của PE 2.2.2. Polygalacturonase ( polygalacturonit-glucanhydronase) 2.2.2.1. Polymetylgalacturonase a. Endoglucosidase-polymetylgalacturonase I Xúc tác sự thuỷ phân liên kết glucozit nội mạch của các phân tử axit polygalacturonase được este hoá ở mức độ cao. Hoạt tính của enzim này bị giảm khi có mặt enzyme pectinesterase trong môi trường. Hình 3. Cơ chế tác dụng của Polygalacturonase b. Exoglucosidase-polymetylgalacturonase III Xúc tác sự thuỷ phân liên kết glucozit ở đầu mạch, tách từng gốc axit galacturonic ra khỏi phân tử pectin, bắt đầu từ đầu không khử. Enzyme này có ái lực với gốc axit galacturonic đã metoxyl hoá. Hình 4. Cơ chế tác dụng của Exoglucosidase-polymetylgalacturonase III 2.2.2.2. Polygalacturonase a. Endoglucosidase-polygalacturonase II Vị trí đứt mạch của cơ chất được xác định bởi sự có mặt của nhóm cacboxyl tự do. Hình 5. Cơ chế tác dụng của Endoglucosidase-polygalacturonase II b. Exoglucosidase-polygalacturonase IV Xúc tác sự thuỷ phân các liên kết glucozit ở cuối mạch cả phân tử axit pectic hoặc axit pectinic nhưng bên cạnh đó không được chứa nhóm metoxyl (tức là liên kết đầu mạch gắn với nhóm cacboxyl tự do). Hình 6. Cơ chế tác dụng của Exo-glucosidase-polygalacturonase IV 2.3. Hiệu quả và những bất lợi của việc sử dụng enzyme pectinase 2.3.1. Những bất lợi khi sử dụng enzyme Nước quả được sử dụng enzyme có nhiều ưu điểm, tuy nhiên việc sử dụng enzyme cũng có những nhược điểm như xảy ra những biến đổi bất lợi về VSV. Nếu xử lý trong thời gian ngắn, quá trình oxy hóa và sự nhiễm VSV không thành vấn đề lớn. Nhưng nếu xử lý enzyme trong thời gian dài sẽ xảy ra quá trình oxy hoá và sự nhiễm VSV. Người ta ngăn ngừa quá trình oxy hoá trong nước quả bằng cách sử dụng một trong ba chất sau: Axit ascorbic axit, Anhydric sulfur, Enzyme glucose oxidase. Để hạn chế sự phát triển của VSV trong tường hợp sử dụng enzyme để xử lý nước quả, người ta thường áp dụng những biện pháp sau: Sử dụng sorbic axit, ascorbic axit, benzoat natri; sử dụng anhydric sulfurơ; xử lý nhiệt. 2.3.2. Tác dụng của việc sử dụng enzyme Đã có nhiều nghiên cứu và kết quả áp dụng trong sản xuất nước quả cho thấy khi sử dụng enzyme pectinase cho hiệu suất và chất lượng nước quả rất cao. Khi tiến hành ứng dụng enzyme trong sản xuất nước quả, người ta đặc biệt quan tâm đến hai yếu tố có tính chất quyết định đến hiệu quả enzyme: - Nguyên liệu: Không phải tất cả các loại quả đều cho hiệu suất cao khi xử lý enzyme. Khi sử dụng enzyme trong chế biến nước quả và rượu vang người ta phải đưa ra độ chín kỹ thuật cho phù hợp. Khái niệm này hoàn toàn khác với khái niệm độ chín kỹ thuật khi trong côngnghệ người ta không sử dụng enzyme. Độ chín kỹ thuật để sản xuất nước quả là giai đoạn chín của quả, đảm bảo tách dịch quả được tốt với sự tích tụ tối đa các chất có giá trị dinh dưỡng cao và hương vị thích hợp. Tuy nhiên, cũng cần biết rằng, phần lớn nguyên liệu, hiệu suất dịch quả cao không trùng hợp với sự tích tụ các chất có giá trị dinh dưỡng. Chính vì thế, từng loại quả, người ta phải tiến hành phân loại và xác định độ chín kỹ thuật riêng, sao cho phù hợp với việc sử dụng enzyme và thu hồi dịch quả. - Khả năng làm nhỏ nguyên liệu: Làm nhỏ nguyên liệu là khâu kỹ thuật rất quan trọng, nó quyết định đến hiệu quả tác động của enzyme và hiệu suất sản xuất dịch quả cũng như chất lượng dịch quả. Tùy theo tính chất cơ lý và đặc điểm cấu tạo của từng loại quả người ta chọn những phương pháp xử lý quả thích hợp như nghiền cắt, chà hay xé nhỏ. Khi thực hiện một trong những phương pháp cơ học trên, một số tế bào bị phá hủy, mất tính chất bán thấm, do đó việc chọn phương pháp cơ học làm nhỏ quả phù hợp với từng loại quả rất có ý nghĩa công nghệ. 2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tác dụng của chế phẩm enzyme pectinase 2.4.1. Ảnh hưởng của chất lượng pectin Chất lượng pectin ảnh hưởng nhiều tới sự tạo độ nhớt của dịch quả và khả năng thuỷ phân enzyme. Pectin có độ nhớt càng cao thì hiệu quả tác dụng của polygalacturonase càng thấp. Tính chất đặc trưng của dung dịch pectin là độ nhớt tăng lên nhanh gấp nhiều lần so với mức tăng nồng độ pectin. Bởi vậy, nếu chỉ căn cứ vào nồng độ pectin trong nguyên liệu thì không thể đánh giá được sự cần thiết phải tác dụng bằng các chế phẩm enzyme. 2.4.2. Ảnh hưởng của đường và axit Đường và axit trong quả tạo với pectin thành gel, làm độ nhớt của dung dịch pectin tăng lên. Độ nhớt của nước quả, ngoài phụ thuộc vào số lượng và chất lượng của pectin, còn phụ thuộc vào dạng đường trong nguyên liệu và số lượng các đường đó. Độ nhớt của chúng sau khi xử lý bằng các chế phẩm enzyme thì hầu như bằng nhau. Do đó, sự khác nhau về độ nhớt ban đầu (tuỳ thuộc vào sự có mặt của các dạng đường khác nhau trong nước quả) không ảnh hưởng tới sự có mặt của enzyme pectinase. Người ta đã chứng minh được rằng, với nồng độ ion H + như nhau trong dung dịch pectin, axit xitric ức chế enzyme pectinase mạnh hơn so với axit tartric. Tính chất ức chế của các axit là yếu tố rất quan trọng, nhiều khi là yếu tố quyết định để ứng dụng các chế phẩm enzyme pectinase nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi và trích ly nước quả. 2.4.3. Ảnh hưởng của pH môi trường Các enzyme pectinase từ các nguồn khác nhau có độ pH tối ưu khác nhau. Như các enzyme khác, hoạt tính của enzyme pectinase cũng phụ thuộc vào pH. Enzyme này có khoảng hoạt động khá rộng và hoạt tính của nó tuỳ thuộc vào nguồn gốc, chủng loại enzyme. Hầu hết dịch quả đều có tính axit. Hoạt tính của enzyme tăng tỷ lệ với chiều tăng của pH. Giá trị pH tối ưu của enzyme pectinase nằm trong khoảng 4 - 4,5; khi pH môi trường lớn hơn 4,5 mặc dù pectin vẫn bị thuỷ phân nhưng quá trình làm trong không thể xảy ra, ở đó protein mang điện tích âm dẫn đến quá trình kết khối protein - pectin không xảy ra. 2.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian Cũng như các phản ứng hoá học, vận tốc xúc tác của các enzyme tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên, do bản chất của enzyme là protein nên chúng không bền dưới tác dụng của nhiệt. Khi nhiệt độ tăng thì hoạt tính của enzyme tăng, song nếu vượt quá một giới hạn nào đó thì hoạt tính của enzyme giảm dần và khi nhiệt độ lớn hơn 70 0 C thì enzyme pectinase hoàn toàn bị mất hoạt lực. Nhiệt độ ứng với hoạt lực lớn nhất của enzyme là nhiệt độ tối ưu, nhiệt độ này không phải là hằng số mà phụ thuộc vào những yếu tố khác, đặc biệt là thời gian tác dụng. Thời gian càng dài thì nhiệt độ tối ưu của enzyme càng thấp. Mặt khác, thời gian kéo dài làm cho chất lượng quả bị giảm sút và trong nhiều trường hợp, sản phẩm có thể quả bị hỏng do kết quả của quá trình oxy hoá và nhiễm tạp vi sinh vật. Ngoài ra, nhiệt độ tối ưu của enzyme còn phụ thuộc vào nồng độ enzyme và dạng tồn tại của enzyme. 2.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme pectinase Khi lựa chọn nồng độ chế phẩm enzyme, nên chọn phương pháp tối thiểu nồng độ mà vẫn đảm bảo được các biến đổi cần thiết, với thời gian mà công nghệ của dạng nước quả cho phép. Nếu enzyme được bổ sung ở nồng độ nhỏ thì lượng enzyme sẽ không đủ để phá vỡ hết các mô tế bào khiến cho các chất dinh dưỡng cũng như các sắc tố, các chất thơm trong quả không thoát ra được nhiều dẫn đến hiệu suất trích ly thấp; ngoài ra, do nồng độ enzyme nhỏ nên phải kéo dài thời gian chế biến khiến cho sản phẩm dễ bị nhiễm tạp vi sinh vật và sẽ dễ hỏng trong quá trình bảo quản. Nếu nồng độ enzyme lớn thì có thể tăng được hiệu suất trích ly và chất lượng dịch quả, song vì giá thành của enzyme rất cao nên giá thành của sản phẩm cũng sẽ cao. Hiệu quả tác dụng của chế phẩm enzyme hoàn toàn phụ thuộc vào thành phần các enzyme và đặc điểm của nguyên liệu chế biến. Do vậy, chỉ có thể xác định một cách chính xác lượng chế phẩm enzyme bổ sung bằng cách thử tác dụng của mỗi chế phẩm riêng rẽ tới nguyên liệu quả trong những điều kiện xử lý khác nhau. 2.5. Một số enzyme pectinase sử dụng trong công nghiệp sản xuất nước quả 2.5.1. Pectinex Ultra SP-L Là chế phẩm enzyme pectinase hoạt tính cao được dùng để xử lý quả nghiền. Enzyme này được sản xuất từ một chủng chọn lọc của nhóm A.niger. Enzyme này chứa chủ yếu pectinase và một loại hoạt tính của hemixenlulase. Nó có khả năng phân huỷ màng tế bào thực vật. Pectinex Ulta SP-L ở dạng dung dịch lỏng, sẫm màu, có mùi thơm nhẹ đặc trưng của sản phẩm lên men và có pH = 3,5 - 4,5. Hoạt tính của enzyme này là 2.600 UI/ml (pH = 3,5) và hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 35 - 40 0 C. Pectinex Ultra SP-L được sử dụng để xử lý quả nghiền và ngâm mô tế bào thức vật. Pectin hoà tan và không hoà tan cũng như polysaccarit làm đục đều bị phân huỷ. Nó được thêm vào quả nghiền nát dẫn đến sự tăng mạnh mẽ hiệu suất ép và sản lượng nước quả cao hơn. 2.5.2. Pectinex 3XL Pectinex Ultra 3XL là một enzyme có hoạt tính pectinase cao. Pectinex Ultra 3XL là dung dịch mầu sẫm với hương vị thơm nhẹ, đặc trưng của sản phẩm lên men. Enzyme này thuỷ phân liên kết este trong phân tử pectin làm giảm độ metoxyl hoá, tạo ra các nhóm cacboxyl tự do. Khi đó với sự có mặt của ion Ca ++ có trong dịch quả hoặc được bổ sung từ ngoài vào dưới dạng CaCl 2 thì kết tủa pectatcanxi được tạo thành, nhờ đó mà pectin được loại ra khỏi dịch quả. III. MỘT SỐ SẢN PHẨM NƯỚC QUẢ SỬ DỤNG ENZYME PECTINASE Một số sản phẩm nước quả sản xuất có sử dụng enzyme pectinase là: Nước quả thanh trùng uống ngay từ quả táo và quả vả, nước quả uống ngay từ dâu tây, anh đào và phúc bồn tử, nước mận, nước nho, nước ổi, nước chanh dây, nước nhãn. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Đức Lượng (2004), “Công nghệ enzyme”, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP.HCM 2. Lê Ngọc Tú (chủ biên) (2002), “Hóa sinh công nghiệp”, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật 3. Ngô Xuân Mạnh (2013), “Bài giảng Côngnghệ enzyme” 4. http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-ung-dung-cua-he-enzym-pectinase-9947/ 5. http://s4.zetaboards.com/BioFood_Tech/topic/8512041/1/ 6. http://luanvan.net.vn/luan-van/ung-dung-cac-che-pham-enzyme-pectinex-de- nang-cao-hieu-suat-trich-ly-21915/ . (2004), Công nghệ enzyme , Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP.HCM 2. Lê Ngọc Tú (chủ biên) (2002), “Hóa sinh công nghiệp”, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật 3. Ngô Xuân Mạnh (2013), Bài giảng Công nghệ. phẩm enzyme từ canh trường bề sâu + Phương pháp hiếu khí + Phương pháp yếm khí 1.6. Ứng dụng của enzyme pectinase trong công nghệ thực phẩm Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công. ra, nhiệt độ tối ưu của enzyme còn phụ thuộc vào nồng độ enzyme và dạng tồn tại của enzyme. 2.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme pectinase Khi lựa chọn nồng độ chế phẩm enzyme, nên chọn phương