Phương pháp kẹp miếng Phương pháp kẹp miếng Bởi: ĐH Bách Khoa Y Sinh K50 Giới thiệu Để làm rõ kênh ion hoạt động cần kiểm tra yếu tố ảnh hưởng đến việc đóng mở kênh đo lượng dòng Đôi khi, khó khăn việc cô lập vùng diện tích màng nhỏ chứa vài (hoặc độc nhất) kênh ion, việc đo lường dòng ion nhỏ Hai nhà sinh lý học tế bào, Edwin Neher Bert Sakman Viện Max Planck (Gottingen, Đức) thành công việc phát triển kỹ thuật cho phép họ đo dòng màng kênh ion đơn lẻ Họ sử dụng vi điện cực kính , gọi micropipette, có đường kính loại µm Người ta nói tình cờ họ đặt điện cực gần với màng tế bào đến mức mà liên kết chặt chẽ với màng tế bào Trở kháng mạch đo sau lên đến khoảng 50 GΩ (Neher Sakman, 1976) Sự thay đổi dòng gây kênh ion đơn lẻ tế bào đo phương pháp kẹp điện áp Thiết bị biết đến “kẹp miếng” kiểm tra hoạt động “miếng” màng; tạo thành cấu hình “kẹp không gian” tốt Phương pháp kẹp miếng phát triển cao để đo điện dung màng tế bào (Neher Marty,1982) Vì điện dung màng tỉ lệ theo bề mặt màng nên việc kiểm tra thay đổi nhỏ diện tích bề mặt màng thực Đặc trưng chứng tỏ hữu ích nghiên cứu trình kích thích tiết Các tế bào thần kinh, tế bào sản xuất hoocmon tế bào bảo vệ (giống tế bào lớn), sản sinh chất khác Chúng tích trữ bọc bao quanh màng Khi tế bào bị kích thích, bọc di chuyển tới bề mặt tế bào Màng tế bào bọc chảy ra, chất giải phóng Tế bào lớn sản sinh hixtamin chất làm tăng phản ứng kích thích cục khác Các tế bào lõi tuyến thượng thận giải phóng hoocmon adrenalin (hoocmon stress) tế bào bêta tuyến tụy giải phóng insulin Neher làm sáng tỏ các trình kích thích tiết loại tế bào thông qua phát triển kỹ thuật giúp ghi lại kết hợp bọc với màng tế bào Neher nhận thức rõ tính chất điện tế bào thay đổi diện tích bề mặt tăng lên, ghi lại trình kích thích tiết thực tế Thông qua việc phát triển cao thiết bị tinh vi này, với độ phân giải cao cho phép ghi lại kết hợp bọc với màng tế bào Năm 1991, Neher Sakman nhận giải Nobel cho công trình họ 1/7 Phương pháp kẹp miếng Kỹ thuật đo kẹp miếng Phần thảo luận nguyên lý kỹ thuật đo kẹp miếng (Sakman Neher,1984; Neher Sakman, 1991) Chúng ta không trình bày chi tiết kỹ thuật chúng có tài liệu gốc (Hamill et al 1981;Sakman Neher, 1984) Có bốn phương pháp : • • • • Cell-attached recording Whole cell recording Outside-out configuration Inside-out configuration Bốn cấu hình minh họa rõ hình 4.27 thảo luận chi tiết phần 2/7 Phương pháp kẹp miếng 3/7 Phương pháp kẹp miếng Biểu đồ minh họa phương pháp kẹp điểm khác (A) cell-attached recording, (B) whole cell configuration, (C) outside-out configuration, and (D) inside-out configuration (Chỉnh sửa từ Hamill et al., 1981.) Nếu vi điện cực kính đánh bóng nhiệt, gọi micropipette, có đầu mở khoảng 0,5-1 µm đưa vào tiếp xúc khít với màng tế bào làm enzym, tạo thành miếng bịt (seal) loại 50 MΩ Mặc dù trở kháng cao, phạm vi kích thước micropipette miếng bịt lỏng lẻo, dòng chảy qua micropipette bao gồm dòng rò vào quanh miếng bịt (tức dòng mà không chảy xuyên qua màng ) che dòng xuyên màng kênh ion mong muốn ( nhỏ) Nếu lực hút nhỏ đặt vào micropipette,miếng bịt tăng lên theo hệ số khoảng 100-1000 Điện trở qua miếng bịt 10-100 GΩ Miếng bịt này, gọi “gigaseal”, làm giảm bớt dòng rò tới điểm nhọn, nơi mà đo đươc tín hiệu mong muốn- dòng ion qua màng diện tích micropipette Cell-attached recording Trong hình thức cell-attached recording, micropipette đưa vào tiếp xúc với màng tế bào, miếng bịt kín tạo hút vùng ngoại vi lỗ micropipette, mô tả Sự hút thường giảm miếng bịt hình thành, tất dòng micropipette loại bỏ ngoại trừ dòng chảy qua chỗ màng mô tả Kết trao đổi ion micropipette xảy qua kênh ion nằm đoạn màng Xét kích thước nhỏ, có kênh nằm miếng màng quan sát Khi kênh ion đơn lẻ mở ra, ion di chuyển qua kênh; dịch chuyển tạo thành dòng điện, ion mang hạt mang điện Whole cell recording Trong whole cell recording, màng tế bào phạm vi micropipette phương pháp cell-attached recording bị đứt với nhịp hút ngắn Bây micropipette gắn kết trực tiếp vào bên tế bào, gigaseal trì Vì ngăn chặn dòng rò Ngược lại điện trở điện khoảng 2-10 MΩ Ở trạng thái vi điện cực đo dòng tổng kênh ion toàn tế bào Trong thời gian mà gigaseal giữ nguyên, trạng thái tương tự với thâm nhập vi điện tử thường Kỹ thuật áp dụng chuyên biệt cho tế bào nhỏ có đường kính khoảng 5-20 µm tạo ghi tốt tế bào nhỏ tế bào hồng cầu 4/7 Phương pháp kẹp miếng Outside-out configuration Outside-out configuration phương pháp gần giống với whole cell recording Trong phương pháp này, sau màng tế bào bị đứt với nhịp hút, micropipette kéo khỏi tế bào Trong trình rút ra, cầu nối tế bào chất bao quanh màng kéo trước tiên từ tế bào Chiếc cầu ngày trở nên hẹp chia tách micropipette tế bào tăng lên, bị gãy, để lại đằng sau tế bào nguyên vẹn miếng nhỏ màng bị cô lập gắn với phần cuối micropipette Kết miếng màng gắn vào, đó, mặt tế bào bên mặt tế bào bên micropipette Với phương pháp này, thấy mặt màng tế bào với dung dịch “tắm” khác Do sử dụng để nghiên cứu tỉ mỉ hoạt động kênh ion đơn lẻ hoạt hóa receptor ngoại bào Inside-out configuration Trong phương pháp inside-out configuration, micropipette kéo từ trạng thái cellattached mà không đứt màng với nhịp hút Cũng phương pháp outside-out trình rút ra, cầu nối tế bào chất bao quanh màng bị kéo khỏi tế bào Chiếc cầu ngày trở nên hẹp cuối bị gãy, tạo thành cấu trúc khép kín bên pipette Cái túi không thích hợp cho phép đo điện Tuy nhiên phần màng bên pipette bị bẻ gãy tiếp xúc thời gian ngắn với không khí, mặt phẳng tế bào chất màng bị hở (chỉ đảo ngược outsideout configuration) Các miếng inside-out thu mà không tiếp xúc trực tiếp với không khí việc rút thực môi trường Canxi tự Với cấu hình này, cách thay đổi mật độ ion dung dịch “tắm”, ta kiểm tra hiệu việc thay đổi nhanh mật độ mặt phẳng tế bào chất màng Do phương pháp sử dụng để nghiên cứu điều chỉnh tế bào chất kênh ion Sự hình thành miếng outside-out hay inside-out kéo theo xếp lại cấu trúc màng Những ảnh hưởng cách ly đặc tính kênh xác định số trường hợp Những ứng dụng phương pháp kẹp miếng Từ kỹ thuật kẹp miếng, phương pháp cell-attached configuration làm xáo trộn cấu trúc môi trường màng tế bào Phương pháp cung cấp phép phân tích dòng theo vài bậc độ lớn có phạm vi rộng phương pháp đo dòng trước Điện màng tế bào thay đổi mà không cần vi điện cực nội bào Cả kênh truyền hoạt hóa điện hoạt hóa nghiên cứu môi trường ion bình thường Hình 4.28 biểu diễn ghi dòng điện rò kênh ion đơn lẻ cuối thần kinh sợi ếch 5/7 Phương pháp kẹp miếng Trong phương pháp whole cell configuration, đường dẫn nhỏ có điện trở thấp (2-10 MΩ) hình thành micropipette mặt tế bào Khi phương pháp áp dụng cho tế bào lớn, giúp nhà nghiên cứu đo dòng điện màng, phương pháp vi điện cực thường làm Nhưng áp dụng cho tế bào nhỏ, cung cấp thêm vào điều kiện để thực phép đo điện miếng chất lượng cao Các ghi điện áp miếng hoàn thành với phương pháp toàn tế bào cho tế bào nhỏ tế bào hồng cầu Nhiều loại tế bào khác nghiên cứu điện áp miếng với điều kiện đầu theo cách Trong tế bào nhuộm crom nặng, tế bào nút tâm nhĩ cô lập tim thỏ, tế bào tuyến tụy, tế bào tim nuôi sinh tế bào hạch có lông Một tế bào nhuộm crom đường kính 10 µm đáp ứng để minh họa thông số điện gặp Tế bào có điện đầu vào trạng thái nghỉ vài GΩ dòng hoạt động khoảng vài trăm pA Nếu điện cực có điện trở nối tiếp Rs khoảng MΩ , đại diện cho điện trở nối tiếp không đáng kể cấu hình phép đo Điện dung màng Cm khoảng pF số thời gian τm = RS•Cm khoảng 25 µs Do phép đo điện áp miếng thực đơn giản cách đặt điện áp vào micropipette đo dòng điện theo quy ước Outside-out configuration phương pháp đặc biệt phù hợp cho thí nghiệm kiểm tra kênh ion điều khiển receptor ngoại bào Dung dịch ngoại bào biến đổi dễ dàng, cho phép kiểm tra ảnh hưởng chất truyền khác nhau, thấm ion Cấu hình sử dụng để đo phụ thuộc độ dẫn kênh AChR tế bào hình thành ion thấm Những miếng outsideout sử dụng để cách ly cổng truyền kênh Cl- màng thân nơ-ron dây cột sống, nơ-ron Aplysia màng Ascaris Inside-out configuration phương pháp thích hợp cho thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng thành phần nội bào kênh ion Việc điều khiển thành phần dung dịch hai mặt màng thực khứ với kỹ thuật phức tạp, phương pháp kẹp miếng với inside-out configuration cách đơn giản để đạt mục đích Hầu hết nghiên cứu có liên quan đến vai trò Ca2+ nội bào Cấu hình sử dụng cho nghiên cứu tính thấm , cho việc làm lộ bề mặt màng dễ bị kích thích điện tới tác nhân loại bỏ kênh Na+ không hoạt động 6/7 Phương pháp kẹp miếng Sự ghi lại dòng chảy qua kênh ion đơn lẻ cuối thần kinh sợi ếch với phương pháp kẹp miếng 7/7 ... số trường hợp Những ứng dụng phương pháp kẹp miếng Từ kỹ thuật kẹp miếng, phương pháp cell-attached configuration làm xáo trộn cấu trúc môi trường màng tế bào Phương pháp cung cấp phép phân tích... hình minh họa rõ hình 4.27 thảo luận chi tiết phần 2/7 Phương pháp kẹp miếng 3/7 Phương pháp kẹp miếng Biểu đồ minh họa phương pháp kẹp điểm khác (A) cell-attached recording, (B) whole cell configuration,... bào nhỏ tế bào hồng cầu 4/7 Phương pháp kẹp miếng Outside-out configuration Outside-out configuration phương pháp gần giống với whole cell recording Trong phương pháp này, sau màng tế bào bị