Phương pháp kẹp điện áp (1)

Phương pháp kẹp điện áp Phương pháp kẹp điện áp Bởi: ĐH Bách Khoa Y Sinh K50 Mục đích phép đo kẹp điện áp Để mô tả định lượng chế trình hoạt hóa, phải đo dòng ion cấu thành nên dòng màng tổng Trong mục này, mô tả cách hoàn thành việc phương pháp đo kẹp điện áp Các thành phần dòng sau xuất sợi thần kinh bị kích thích đầu điện áp dòng điện màng xung truyền dây thần kinh đo vùng ngoại biên: Các dòng điện dọc trục trình truyền xung thần kinh: • Io = tổng dòng điện dọc bên sợi trục thần kinh • Ii = tổng dòng điện dọc bên sợi trục thần kinh Lưu ý rằng: Io = - Ii Dòng xuyên màng im đơn vị chiều dài có từ đặc tính thân màng liệt kê sau: • • • • • Thành phần dòng điện dung imC đơn vị chiều dài Thành phần dòng điện ion imI đơn vị chiều dài bao gồm: Dòng natri imNa đơn vị chiều dài Dòng kali imK đơn vị chiều dài Dòng clo (hay dòng rò) iL đơn vị chiều dài Mục đích ta chọn lọc đo dòng ion một, đặc biệt dòng Na+ K+ Chú ý ta xét dòng ion suốt trình truyền xung thần kinh, nên trở kháng màng (rm) số; nên biểu diễn ký hiệu tượng trưng biến trở Bất kì phép đo dòng màng tế bào với trình truyền xung thần kinh cho tổng dòng Dòng màng tổng (như hình 4.1) thỏa mãn phương trình 3.48 mà viết dạng sau: 1/11 Phương pháp kẹp điện áp (4.1) Trong đó: im = dòng xuyên màng tổng đơn vị chiều dài (µA/cm chiều dài sợi trục) imI = thành phần dòng ion xuyên màng đơn vị chiều dài (µA/cm chiều dài sợi trục) cm = điện dung màng đơn vị chiều dài (µF/cm chiều dài sợi trục) Vm = điện áp màng (mV) t = thời gian (ms) ri = trở kháng dọc trục nội bào đơn vị chiều dài (kΩ/cm chiều dài sợi trục) ro = trở kháng kẽ đơn vị độ dài (kΩ/cm chiều dài sợi trục) x = khoảng cách (cm) Bằng cách đo Vm(t) vận tốc trình truyền xung Θ, ta tính Vm(t – x/ Θ) từ tìm im nhờ phương trình 4.1 Mặc dù việc xác định im hiển nhiên, độ xác phụ thuộc vào đồng mẫu hiểu biết thông số ri, ro, Θ Một phương pháp thỏa đáng dựa khử dòng dọc trục Bằng qui ước điện áp xuyên bào Vm điện nội bào Φi, điện ngoại bào Φo có quan hệ với nhau: Vm = Φi - Φo Ngoài dòng xuyên bào hướng dương chọn lựa hướng ngoại (đi từ bên bên tế bào) Những quy ước thể phương trình 4.1 Hơn nữa, để trì tính quán cách vẽ mạch điện truyền thống mạch tương đương màng tế bào, điểm cuối tham chiếu, chọn để làm điểm đầu cuối mô tả tín hiệu đo bên tế bào, làm điểm bên tế bào Trong hình vẽ sau minh họa thích hợp cho màng tế bào theo chiều dọc, bên màng định vị mặt bên trái bên màng định vị mặt bên phải màng tế bào 2/11 Phương pháp kẹp điện áp Nguyên lý đo dòng điện màng tế bào truyền xung động thần kinh (A) Nó tính toán mà sóng truyền bắt đầu bên trái có vận tốc không đổi nơi điện áp đo Để nhận dòng điện xuyên màng ta sử dụng phương trình 4.1; việc thực yêu cầu đo vận tốc truyền lan ²Vm/ x² = (1/ Θ²) ²Vm/ t² ước lượng (B) Một phần phương pháp lõi dây dẫn thẳng (the linear core conductor model), (tính toán giới hạn môi trường ngoại bào) phản ánh phương pháp vật lý (Chú ý xét dòng ion suốt trình dẫn truyền xung động thần kinh, trở kháng màng rm không đổi; biểu diễn tượng trưng biến trở Để đánh giá nồng độ ion thay đổi theo thời gian Em biến đổi theo thời gian) Các quy ước giải thích Kẹp không gian Với thiết bị đo thích hợp kích thích đồng thời toàn chiều dài sợi trục thần kinh Khi điện áp màng tức thời biến đổi đồng dọc theo toàn chiều dài sợi trục thần kinh Trạng thái tạo nên cách lồng vào điện cực kích thích mỏng dọc theo trục toàn bộc chiêu dài sợi thần kinh bị cắt ra, đặt điện cực khác chiều dài kim loại có hình trụ bao bên sợi dây thần kinh Điều làm cho điện thay đổi theo phương bán kính trục, phát sinh dòng điện tỏa tròn Hơn nữa, tất nguyên tố màng vận hành đồng thời, màng toàn sợi trục thần kinh đồng thời vận hành Dó điện cực đồng tâm, đo dòng điện màng tuân theo phương trình: Trong 3/11 Phương pháp kẹp điện áp im = dòng điện tổng đơn vị chiều dài [µA/cm chiều dài sợi trục] imI = dòng ion tổng đơn vị chiều dài [µA/cm chiều dài sợi trục] cm = điện dung tạo đơn vị chiều dài [µF/cm chiều dài sợi trục] Vì thiết bị bảo đảm đồng dọc sợi trục, mô tả kẹp không gian Mô hình đo dòng điện kẹp không gian minh họa hình 4.2 Nguyên lý phương pháp đo kẹp không gian (A) Cấu trúc vật lý thiết bị mà đảm bảo đồng dọc trục, dòng điện theo hướng tỏa tròn, khử dòng chiều (B) Dòng điện tổng im, xuyên suốt màng (trên đơn vị chiều dài), bao gồm thành phần dòng ion imI dòng điện dung imC Kẹp điện áp Trong phương pháp kẹp không gian, dòng điện màng bao gồm thành phần tụ đóng vai trò nguồn dòng gây nhiễu Thành phần điện dung loại bỏ cách giữ điện áp màng không đổi suốt trình đo Như gọi phương pháp kẹp điện áp Do dòng điện dung, trước hết vế phải phương trình 4.2, tỷ lệ với thời gian phát sinh điện áp, dòng điện dung không điện áp phát sinh không Trong trường hợp kết phương trình dòng điện màng giảm là: im = imI (4.3) 4/11 Phương pháp kẹp điện áp Và dòng điện màng dòng ion (Tiếp theo thời điểm điện áp tăng vọt, xung dòng ngắn xuất điện dung màng Nó nhanh không ảnh hưởng đến việc đo dòng nảy sinh từ kích hoạt) Phương pháp kẹp điện áp minh họa thiết bị kẹp không gian hình 4.3 Một nấc điện áp mong muốn phải chuyển đổi điện cực bên bên dòng chảy điện cực đo (là dòng xuyên màng) Thí nghiệm kẹp điện áp (A) Nguyên lý đơn giản thí nghiệm (B) Mô hình dòng điện màng sợi thần kinh thí nghiệm kẹp điện áp Hiện mạch đo kẹp điện áp mức độ phức tạo phương pháp mô tả minh họa hình 4.4 Các điện cực riêng biệt dùng cho ứng dụng dòng điện (a, e) nhận cảm điện áp (b, c) để tránh lỗi điện áp bề mặt điện cực chất điện phân trở kháng dây điện cực dòng mỏng Hình 4.4 mô tả nguyên lý mạch đo thực Hodgkin, Huxley, Katz (1952) Mạch gồm có khuếch đại đồng (có trở kháng vào lớn) mà xác định điện áp màng ( Vm) bên dây thần kinh (b) bên dây thần kinh (c) Đầu đưa tới cộng, chênh lệch điện áp kẹp (Vc) điện màng đo (Vm) xác định khuếch đại Đầu này, K(Vc - Vm), hướng tới phát dòng điện Bộ phát dòng cung cấp dòng điện cho hệ thống điện cực (a, e) xuyên qua màng Dòng điện phát sinh suốt trình đo điện áp qua điện trở hiệu chỉnh Rc 5/11 Phương pháp kẹp điện áp Dòng điều chỉnh cho điện áp Vm tiến gần đến giá trị điện áp Vc, sau tín hiệu hồi tiếp giảm không Khi K lớn, cân thiết lập Vm = Vc giữ nguyên giá trị Đây nguyên lý hồi tiếp âm điều khiển tỷ lệ Phép đo thực với dây thần kinh có kích thước lớn, đường kính xấp xỉ khoảng 0,05 mm lồng vào hai điện cực mô tả hình 4.4 với dây thần kinh (Chúng thường chế tạo vòng xoắn ốc đan xen quấn quanh lõi cách điện) Bước điện áp dòng màng thí nghiệm kẹp điện áp Dòng điện ứng dụng xuyên qua hai điện cực (a) (e) điện áp xuyên màng Vm đo hai điện cực (b) (c) Nguồn dòng điều khiển để trì điện áp màng ứng với vài giá trị Vc chọn CÁC VÍ DỤ VỀ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC TỪ PHƯƠNG PHÁP KẸP ĐIỆN ÁP Kẹp điện áp điện áp Nernst natri Hình 4.5 mô tả dòng xuyên màng đặc trưng thu phương pháp kẹp điện áp Điện bên màng thay đổi đột ngột từ điện nghỉ -65 mV tới +20 mV với bước nhảy +85 mV Như vậy, dòng ion bắt đầu vào thể khỏi thể sau khoảng ms đạt tiệm cận với gí trị mA/cm2 Ta khảo sát xuất dòng điện màng tế bào ứng với mức điện áp khác Hình 4.6 cho thấy kết thí nghiệm phép đo bước điện áp từ 91-143 mV Trong chuỗi đường cong cần ý dòng điện màng lại tạo nên hai trạng thái: trạng thái sớm trạng thái muộn hình 4.5 Dòng sớm có hướng vào phía bước điện áp nhỏ Khi bước điện áp tăng, biên độ thành phần hướng vào giảm biến hoàn toàn với bước 6/11 Phương pháp kẹp điện áp điện áp 117 mV Với bước điện áp cao hơn, dòng sớm hướng tăng tỷ lệ với bước điện áp Mặt khác thành phần dòng màng muộn hướng đơn điệu tăng đến gần giới hạn tiệm cận Giới hạn tăng lên hàm số bậc thang điện áp tăng Tổng hợp điện áp màng nghỉ -65 mV bước điện áp 117 mV kết điện áp màng tế bào +52 mV Dựa vào nồng độ Na+ bên bên màng, phương trình Nernst ước lượng điện áp cân +50 mV (Chú ý ví dụ mục 3.1.3) Vì kết luận thành phần dòng điện sớm tạo ion Na+ từ giảm điện áp cân Na+ hướng vào Vm thấp điện áp Nernst Na+ hướng phía Vm lớn điện áp Nernst Na+ Do thành phần hướng (thành phần muộn) phải phụ thuộc vào dòng ion K+ Bởi Cl- hướng gần trạng thái cân bằng, nên sợi thần kinh nghỉ tính thấm Cl- không tăng suốt trình điện hoạt động dòng Cl- trở nên nhỏ so với Na+ K+ bỏ qua Bước điện áp dòng màng thí nghiệm kẹp điện áp 7/11 Phương pháp kẹp điện áp Dãy bước điện áp kẹp Sự biến đổi nồng độ ion Một phương thức tiếp cận để chọn lựa đo lường dòng đơn ion Ka+ cách dùng bước kẹp điện áp tương ứng với điện Nernst Na+ Việc có tác dụng khử dòng Na+ Bằng cách thay đổi có hệ thống nồng độ Na+ bên sợi thần kinh, sau việc lựa chọn bước kẹp điện áp điện áp Nernst Na+ tương ứng, nghiên cứu trạng thái đơn K+ Và trở lại việc đo dòng điều kiện bình thường (với Na+ K+), trừ dòng K+ lại đơn dòng ion Na+ Phương pháp mô tả hình 4.7 Hình cho thấy kết thí nghiệm kẹp điện áp thực nước biển thường mức điện áp 56 mV Hình 4.7.A mô tả điện Nernst ứng với ion điện áp kẹp khác Đường cong hình 4.7.B diễn tả dòng điện màng tổng đo bào gồm dòng thành phần Na+ K+ Đường cong (C) dòng màng đo sau ion Na+ màng giảm mức điện áp 56 mV đạt tới điện áp Nernst Na+ Do đường cong thể dòng K+ Bằng cách trừ đường cong (C) cho (B) ta đường cong (D) dòng màng ion Na+ trạng thái ban đầu (Na+ không thay đổi) Các đường cong (C) (D) thành phần mong muốn (B) Chú ý Hodgkin Huxley giả sử dòng K+ không bị ảnh hưởng thay đổi ion Na+ bên màng đường cong (C) giống nước biển thường nước biển nồng độ Na+ bị giảm bớt 8/11 Phương pháp kẹp điện áp Một kỹ thuật thông minh phát triển Baker, Hodgkin, Shaw (1962) cho phép thay đổi để tạo thành phần ion bên Hình 4.8 mô tả cách chuẩn bị sợi thần kinh cho kiểu thí nghiệm Hodgkin Huxley Với thí nghiệm này, phải ép chặt bào tương ngoài; xong xuôi sử dụng lăn (A) Sau rót đầy chất dịch lỏng (B) vào sợi trục Điện màng đo suốt trình xung lực hoạt động trước thực (C) sau thực (D) Các phép đo trình hồi phục lại điều kiện đầu thực để đảm bảo trạng thái điện màng tế bào thần kinh không thay đổi Phương pháp chọn dòng Na+ K+: Các ion Na+ bên màng thay cation để giảm điện Nernst Na+ phù hợp với giá trị điện áp kẹp 9/11 Phương pháp kẹp điện áp Sự chuẩn bị sợi thần kinh lớn mực ống cho thí nghiệm kẹp điện áp,nơi nồng độ ion bên tế bào thần kinh bị thay đổi (A) Đầu tiên bào tương đảy nhờ lăn (B) Đổ đầy chất dịch lỏng vào sợi dây thần kinh (C) Các xung động thần kinh đo trước truyền dịch (D) Các xung động thần kinh đo sau truyền dịch Sự chặn kênh ion nhờ tác nhân hóa dược Các dòng ion Na+ K+ bị tách riêng cách đưa vào tác nhân hóa dược để chặn chọn lọc kênh Na+ K+ Narahashi, Moore trường đại học họ cho tetrodotoxin (TTX) chặn có chọn lọc dòng Na+ qua màng tế bào (Narahashi, Moore, and Scott, 1964; Moore et al., 1967) Armstrong Hille (1972) cho tetraethylammonium (TEA) chặn dòng ion K+ (Tetrodotoxin hóa chất độc hại có nội tạng loài cá fugu Nhật Bản) Hình 4.9 cho ta chuỗi thí nghiệm kẹp điện áp, bắt đầu điều kiện thường Sau kênh Na+ bị chặn tetrodotoxin, phép đo thể dòng ion K+ Về sau tetrodotoxin phun xa, phương pháp điều khiển đo thực Tiếp đến kênh K+ bị chặn tetraethylammonium cho phép đo chọn lọc dòng ion Na+ (Hille, 1970) 10/11 Phương pháp kẹp điện áp Phương pháp đo chọn lọc dòng Na+ K+ cách lựa chọn việc chặn kênh Na+ K+ với tác nhân hóa dược (A) Đo điều khiển tác nhân hóa dược (B) Đo sau đưa vào tetrodotoxin (TTX) (C) Đo điều khiển tác nhân hóa dược (D) Đo sau đưa vào tetraethylammonium (TEA) 11/11 [...].. .Phương pháp kẹp điện áp Phương pháp đo chọn lọc dòng Na+ và K+ bằng cách lựa chọn việc chặn các kênh Na+ và K+ với các tác nhân hóa dược (A) Đo điều khiển khi không có tác nhân hóa dược (B) Đo sau khi đưa vào tetrodotoxin ... điện áp xuyên màng Vm đo hai điện cực (b) (c) Nguồn dòng điều khiển để trì điện áp màng ứng với vài giá trị Vc chọn CÁC VÍ DỤ VỀ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC TỪ PHƯƠNG PHÁP KẸP ĐIỆN ÁP Kẹp điện áp điện áp. .. trình điện hoạt động dòng Cl- trở nên nhỏ so với Na+ K+ bỏ qua Bước điện áp dòng màng thí nghiệm kẹp điện áp 7/11 Phương pháp kẹp điện áp Dãy bước điện áp kẹp Sự biến đổi nồng độ ion Một phương. .. kẹp điện áp Hiện mạch đo kẹp điện áp mức độ phức tạo phương pháp mô tả minh họa hình 4.4 Các điện cực riêng biệt dùng cho ứng dụng dòng điện (a, e) nhận cảm điện áp (b, c) để tránh lỗi điện áp