Nghiên cứu khoa học những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”

Kỷ yếu Hội nghị toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống”, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 2004 464-468 Sử dụng thị RAPD ADN lục lạp nghiên cứu quan hệ di truyền số xuất xứ Lim xanh Erythrophleum fordii Oliv Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Nguyễn Hoàng Nghĩa Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Đặt vấn đề Trong số hàng nghìn gỗ rừng Việt Nam, có tới hàng trăm loài bị đe dọa mức độ khác nhau, số loài đứng trước nguy bị tuyệt chủng mà nguyên nhân chủ yếu hậu việc tàn phá môi trường sống thu hẹp diện tích rừng tự nhiên Cây Lim Xanh Erythrophleum fordii Oliv gọi Lim, họ phụ Vang Caesalpinioideae, họ Đậu Leguminosae Lim xanh loài gỗ quý, tiếng từ lâu đời, có giá trị kinh tế cao ưa chuộng thị trường [1] Lim xanh có phân bố trải dài suốt từ Quảng Ninh đến Quảng Bình có xuất xứ tiếng Cầu Hai, Chân Mộng (Vĩnh Phú), Ba Vì, Sơn Tây (Hà Tây), Mai Sưu (Hà Bắc) Hữu Lũng (Lạng Sơn) song đến khó tìm thấy quần thụ lim rộng lớn mà số cá thể rải rác [12] Hiện Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam sưu tầm bảo tồn Lim xanh từ nhiều xuất xứ khác Câu hỏi đặt liệu xuất xứ có trùng lặp hay không?, có cần thiết phải bảo tồn nguồn gen Lim xanh tất xuất xứ hay không? Những năm gần thị phân tử dùng rộng rãi nghiên cứu phân loại nhiều loại Trong số đó, thị RAPD sử dụng rộng rãi nhất, kỹ thuật đơn giản tốn RAPD sử dụng để xác định giống [4,5] mối quan hệ phát sinh loài Citrus [6] Việc sử dụng thị ADN lục lạp (cpDNA) phân tích phát sinh loài mang lại kết lý thú tính bảo thủ thiên nhiên, tần số đột biến thấp ADN nhân có kích thước nhỏ Sự đa hình ADN lục lạp sử dụng nhiều nghiên cứu xác định mối quan hệ địa lý đa dạng di truyền loài [3,10] Phản ứng PCR để nhân vùng không mã hoá cpDNA với mồi lục lạp phổ biến, sau sản phẩm PCR cắt enzym cắt hạn chế để tìm đa hình sử dụng nghiên cứu phát sinh loài Citrus Trong này, trình bày kết sử dụng RAPD cpDNA nghiên cứu mối quan hệ di truyền xuất xứ Lim xanh nhằm đưa khuyến cáo việc bảo tồn nguồn gen loài quan trọng Nguyên liệu phương pháp Nguyên liệu Chín mẫu xuất xứ Lim xanh (Thanh Hoá, Ba Vì, Hà Bắc, Đông Giang, Lang Hanh, Nghệ An, Cầu Hai, Tam Đảo, Quảng Ninh) Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp Hoá chất chuẩn mua từ hãng Sigma Amersham (Mỹ) Các mồi RAPD (C1, C7, C9, B1, B4, B9) mua từ hãng Operon - Mỹ Các mồi lục lạp (cpDNA) trnH-trnK, PsbC-trnS mua từ hãng Fermentas theo trình tự công bố [9] Phương pháp Nghiên cứu đa dạng loài Tách chiết ADN genome kỹ thuật RAPD tiến hành công bố [2] Sản phẩm PCR điện di gel agarose 0,8 %, quan sát đèn cực tím chụp ảnh hệ thống Thermal Imaging System FTI-500, Pharmacia Biotech Kỹ thuật PCR với mồi lục lạp Phản ứng PCR ADN genome xuất xứ Lim xanh với hai cặp mồi cpDNA (20 nucleotide) tiến hành với tổng thể tích 25 μl/mẫu gồm: ADN tổng số (12 ng), dNTP (0,2 mM), mồi cpDNA (10 ng), MgCl2 (1,5 mM), Taq polymerase (2 đơn vị) 2,5 μl đệm 10xPCR Chu trình nhiệt: 920C phút; 10 chu kỳ gồm bước: 920C giây, 550C 15 giây, 720C phút; 20 chu kỳ gồm bước sau: 920C giây, 550C 15 giây, 720C phút 10 giây; cuối kéo dài 720C 10 phút [7,8] Sản phẩm PCR điện di gel agarose 0,8 %, quan sát đèn cực tím Phân đoạn ADN nhận từ sản phẩm PCR với mồi lục lạp cắt enzym cắt hạn chế Tag I, Hha I, Hinf I sau điện di gel agarose 1,5 %, quan sát đèn cực tím chụp ảnh Phân tích số liệu Các số liệu đưa vào xử lý chương trình NTSYS pc (Rohlf F J, 1993) [11] để tính ma trận tương đồng đôi mẫu Sau mẫu nghiên cứu xử lý tiếp NTSYS - SIMQUAL biểu biểu đồ quan hệ di truyền Kết nghiên cứu thảo luận Phân tích đa hình di truyền xuất xứ Lim xanh thị RAPD Trung bình mồi cho 5,2 đến 9,7 phân đoạn (hình 1) Tổng số 428 băng đa hình/428 băng nhận từ phản ứng PCR ADN genome từ xuất xứ với mồi RAPD Như tỷ lệ đa hình đạt 100% Số phân đoạn đa hình mồi cao, đạt 47-87 phân đoạn Mồi C7 cho số phân đoạn đa hình thấp đạt 47 phân đoạn xuất xứ, mồi C1 B1 cho số phân đoạn đa hình cao nhất, 87 phân đoạn xuất xứ Lim xanh, số phân đoạn trung bình từ đến 11 Xuất xứ Nghệ An cho số phân đoạn trung bình thấp (5 phân đoạn), xuất xứ Hà Bắc cho số phân đoạn trung bình cao (11 phân đoạn) Cả chín xuất xứ cho số phân đoạn đa hình số phân đoạn đếm được, nghĩa tỷ lệ phân đoạn đa hình xuất xứ Lim đạt 100% Như vậy, bước đầu dựa thị RAPD có nhận xét xuất xứ Lim xanh đa dạng mặt di truyền Bảng Tỷ lệ đa hình xuất xứ Lim xanh với thị RAPD Ký hiệu Xuất xứ Tổng số băng đếm Tổng số băng đa hình Số băng tb xuất xứ Tỷ lệ băng đa hình(%) Thanh Hoá 38 38 7,6 100 Ba Vì 41 41 8,2 100 Hà Bắc 53 53 10,6 100 Đông Giang 31 31 6,2 100 Lang Hanh 46 46 9,2 100 Nghệ An 25 25 100 Cầu Hai 44 44 8,8 100 Tam Đảo 41 41 8,2 100 Quảng Ninh 24 24 4,8 100 Tổng 428 428 Phân tích đa hình di truyền xuất xứ Lim thị ADN lục lạp Kết PCR-cpDNA với mồi lục lạp nhận phân đoạn ADN có kích thước mong muốn Sản phẩm với cặp mồi trnH-trnK cho phân đoạn ADN có độ dài 1750 bp (hình 2a) với cặp mồi psbC-trnS cho phân đoạn có kích thước 1600 bp Sản phẩm PCR-cpDNA cặp mồi trnH-trnK với xuất Lim xanh cắt enzym cắt hạn chế Tag I, Hha I, Hinf I với mục đích tìm vị trí cắt enzym xuất xứ khác Từ nhận đa hình xuất xứ Kết minh họa hình 2b Từ kết hình ảnh thu cho thấy sau cắt với enzym thu 72 phân đoạn từ sản phẩm cắt, có 54 phân đoạn đa hình Enzym Tag I cắt gen lục lạp xuất xứ Quảng Ninh vị trí cắt (1600 bp) Enzym Hha I cắt gen lục lạp xuất xứ vị trí (thứ tự sau vị trí 1: 1500 bp, vị trí 2: 1000 bp, vị trí 3: 700 bp, vị trí 4: 600 bp) Các xuất xứ Thanh Hoá, Hà Bắc, Lang Hanh, Cầu Hai, Tam Đảo có vị trí cắt nhau, vị trí cắt 2, 3, xuất xứ Ba Vì, Đông Giang, enzym Hha I cắt gen lục lạp vị trí 4; xuất xứ Nghệ An Quảng Ninh, enzym cắt vị trí 1, 2, Enzym Hinf I cắt gen lục lạp xuất xứ vị trí (vị trí 1: 700 bp, vị trí 2: 600 bp, vị trí 3: 500 bp, vị trí 4: 200 bp, vị trí 5: 100 bp, vị trí 6: 80 bp) Enzym cắt gen lục lạp xuất xứ Ba Vì, Đông Giang vị trí nêu Các xuất xứ Thanh Hoá, Hà Bắc, Lang Hanh, Cầu Hai, Tam Đảo, enzym cắt vị trí 1, 2, 3, 4, Tuy nhiên, enzym Hinf I không cắt vị trí gen lục lạp xuất xứ Quảng Ninh Nghệ An Như vậy, kết phân tích thị cpDNA cho thấy xuất xứ Lim xanh khác mặt di truyền tế bào chất 3.3 Phân tích mối quan hệ di truyền xuất xứ Lim xanh Các phân đoạn đa hình dựa phân tích RAPD cpDNA ghi nhận dựa có mặt hay vắng mặt chúng Nếu có ký hiệu 1, ký hiệu Các số liệu xử lý chương trình NTSYS-pc để phân tích mối tương quan đối tượng nghiên cứu Dựa ma trận số liệu thiết lập, tiến hành xác định mối tương quan di truyền xuất xứ Lim xanh Dựa vào hệ số giống di truyền Jaccard thu được, sơ đồ quan hệ di truyền xuất xứ Lim xanh thiết lập (hình 3) Từ sơ đồ nhận thấy quan hệ di truyền xuất xứ Lim xa 100% xuất xứ có hệ số di truyền nhỏ 0,5 Hai xuất xứ Lang Hanh Cầu Hai coi gần quan hệ di truyền (tuy nhiên hệ số Jaccard đạt 0,43) Hai xuất xứ Quảng Ninh Nghệ An có mối quan hệ di truyền xa so với xuất xứ lại (hệ số Jaccard 0,17) Kết luận Trong tổng số 428 phân đoạn ADN nhân ngẫu nhiên phản ứng PCRRAPD sử dụng mồi với xuất xứ Lim xanh cho 100% phân đoạn đa hình Điều cho thấy mồi RAPD nghiên cứu cho đa hình cao xuất xứ Lim xanh Phân tích vị trí cắt đặc hiệu enzym cắt hạn chế sản phẩm PCR với mồi lục lạp cho thấy thị ADN lục lạp cho mức độ đa hình cao Các phân tích đa dạng di truyền dựa hệ số di truyền giống Jaccard xuất xứ Lim xanh số liệu thị RAPD ADN lục lạp cho thấy xuất xứ đa dạng di truyền Từ kết luận trên, đến khuyến cáo cần thiết phải bảo tồn vốn gen Lim xanh tất xuất xứ xuất xứ nghiên cứu xa di truyền Tài liệu tham khảo Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999 Một số loài bị đe dọa Việt Nam Nxb Nông nghiệp Hà nội 147 tr Nguyễn Đức Thành, 1999 Phát triển ứng dụng thị phân tử nghiên cứu đa dạng phân tử lúa Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội: 1205-1215 Demesure B., Sodzi N., Petit RJ., 1995 A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants Mol Ecol 4:35-38 Deng ZN et al, 1995 Identification of in vivo and in vitro lemon mutants by RAPD markers J Hortic Sci, 70:117-125 Deng ZN et al, 1995 Parentage determination of some citrus hybrids by molecular markers Proc Int Soc Citricul 2:849-854 Federici CT et al, 1998 Phylogenetic relationship within the genus Citrus (Rutaceae) and related genera as revealed by RFLP and RAPD analysis Theor Appl Genet, 96:812-822 Gielly L., Taberlet P., 1994 The use of chloroplast DNA to resolve plant phylogenies: non-coding vs RbcL sequences Mol Biol Evol, 11: 769-777 Mohanty A et al, 2001 Chloroplast DNA study in wild population and some cultivars of Prunus avium L Theor Appl Genet, 103: 112-117 Nicolosi E et al, 2000 Citrus phylogeny and genetic origin of important species as investigated by molecular markers Theor Appl Genet, 100: 11551166 10 Olmstead RG., Palmer JD., 1994 Chloroplast DNA systematics: a review of methods and data analysis Am J Bot 81: 1205-1224 11 Rohlf FJ., 1993 NTSYS-pc Numerrical taxonomy and multivariate system, Version 1.80 Applied Biostatitics Inc., New York 12 Lời cảm ơn: Công trình hoàn thành với hỗ trợ kinh phí Chương trình NCCB KHTN Chúng xin cám ơn GS TSKH Lê Xuân Tú đọc góp ý cho thảo Summary The use of RAPD and chloroplast DNA markers in the study of genetic relationship of Erythrophleum fordii Oliv From different origins Quach Thi Lien, Nguyen Đuc Thanh Institute of Biotechnology –VAST Nguyen Hoang Nghia Forest Science Institute of Viet Nam Genetic relationship of nine Erythrophleum fordii Oliv origins were investigated using RAPD and cpDNA markers The RAPD analysis using random amplified polymorphic primers reveled 428 Polymorphic bands All the bands were polymorphic among the investigated origins Non-coding regions of cpDNA were amplified using chloroplast universal primers trnH-trnK and PsbC-trnS, and polymorphisms were subsequently generated by digestion of the PCR products with TaqI, HhaI and HinfI endonucleases Eleven restriction sites were detected and 54 polymorphic bands of the total number 72 bands were obtained The coefficients of genetic similarity between the investigated origins based on RAPD and cpDNA data were rather low (from 0,17 to 0,43) showing the genetic divergent of the E fordii origins Our results indicated an necessary to protect all of the E fordii investigated ... J, 1993) [11] để tính ma trận tương đồng đôi mẫu Sau mẫu nghiên cứu xử lý tiếp NTSYS - SIMQUAL biểu biểu đồ quan hệ di truyền Kết nghiên cứu thảo luận Phân tích đa hình di truyền xuất xứ Lim xanh... Jaccard 0,17) Kết luận Trong tổng số 428 phân đoạn ADN nhân ngẫu nhiên phản ứng PCRRAPD sử dụng mồi với xuất xứ Lim xanh cho 100% phân đoạn đa hình Điều cho thấy mồi RAPD nghiên cứu cho đa hình cao... xứ nghiên cứu xa di truyền Tài liệu tham khảo Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999 Một số loài bị đe dọa Việt Nam Nxb Nông nghiệp Hà nội 147 tr Nguyễn Đức Thành, 1999 Phát triển ứng dụng thị phân tử nghiên