QUÁ TRÌNH XÂM NHẬP VÀ SỰ LAN TRUYỀN CỦA CỦA HPV

Trong 10 năm qua có khoảng 6.000 phụ nữ chết vì ung thư cổ tử cung cao gấp đôi so với phụ nữ chết vì HIV/AIDS; mặc dù khác với HIV, các tổn thương do HPV, thậm chí ung thư do HPV có thể

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

MỤC LỤC HÌNH 2

ĐẶT VẤN ĐỀ 4

NỘI DUNG 5

CHƯƠNG I TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC NGHIÊN CỨU HPV 5

1.1 Vị trí phân loại của HPV trong sinh giới 5

1.2 Vai trò của HPV 5

CHƯƠNG II CÁC PHƯƠNG PHÁP HIỆN TẠI ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ NGHIÊN CỨU HPV 7

2.1 Quan sát bằng mắt thường 7

2.2 PAP’s smear 7

2.3 Phương pháp lai phân tử sử dụng sử dụng mẫu dò trực tiếp 9

2.4 PCR (Polymerase Chain Reaction) 10

2.5 Định genotype HPV bằng kỹ thuật PCR – ELISA 14

2.6 Xác định genotype của HPV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR đặc hiệu 15

2.7 Xét nghiệm bắt mồi lai (Hybrid Capture 2 – HC2) 16

2.8 Real-time PCR 16

CHƯƠNG III: CẤU TRÚC CỦA HPV 19

3.1 Cấu tạo 19

3.2 Chức năng các vùng gene và protein 21

3.3 Vòng đời và đáp ứng miễn dịch 23

CHƯƠNG IV QUÁ TRÌNH XÂM NHẬP VÀ SỰ LAN TRUYỀN CỦA CỦA HPV 25

4.1 Quá trình tương tác và xâm nhập vào tế bào chủ của HPVs 25

4.1.1 Các thụ thể của HPV 25

4.1.2 Sự xâm nhập của HPV vào trong tế bào 27

4.2 Sự lan truyền của HPV 30

4.2.1 Sự lan truyền trong cơ thể 30

4.2.2 Sự lan truyền từ cơ thể này sang cơ thể khác 30

CHƯƠNG V SAO CHÉP, PHIÊN MÃ VÀ DỊCH MÃ 32

5.1 Sao chép 32

5.2 Phiên mã 33

5.3 Dịch mã 37

9.1 Bệnh ung thư cổ tử cung 38

9.1.1 Cơ chế gây bệnh của HPV 38

9.1.2 Các tổn thương tiền ung thư đường sinh dục 40

9.2 Mụn cóc ở da 41

9.3 Mụn cóc hậu môn – sinh dục 42

9.4 U nhú hô hấp tái diễn 44

9.5 U nhú miệng 44

KẾT LUẬN 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

MỤC LỤC HÌNHMỤC LỤC 1

MỤC LỤC HÌNH 2 ĐẶT VẤN ĐỀ 4 NỘI DUNG 5 CHƯƠNG I TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC NGHIÊN CỨU HPV 5

1.1 Vị trí phân loại của HPV trong sinh giới 5

Hình 1 Các tế bào cổ tử cung bình thường dưới kính hiển vi 8

Hình 2 Các tế bào bất thường cổ tử cung dưới kính hiển vi 9

2.3 Phương pháp lai phân tử sử dụng sử dụng mẫu dò trực tiếp 9

Hình 3 Kỹ thuật lai phân tử 10

2.4 PCR (Polymerase Chain Reaction) 10

Hình 4 Vị trí các gen L1 và E6/E7 của HPV và độ dài sản phẩm PCR trong phát hiện và định type HPV 12

Hình 5 Kết quả ts-PCR định type HPV type 33, 6/11, 58, 52 và 56 13

Hình 6 Kết quả ts-PCR định type HPV type 35, 42, 43 và 44 13

Hình 7 Kết quả ts-PCR định type HPV type 68, 39, 51 và 66 13

Hình 8 Kết quả ts-PCR định type HPV type 16, 18, 31, 59 và 45 13

Hình 9 Phát hiện và định type HPV bằng kỹ thuật NM – PCR 14

2.5 Định genotype HPV bằng kỹ thuật PCR – ELISA 14

2.6 Xác định genotype của HPV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR đặc hiệu 15

2.7 Xét nghiệm bắt mồi lai (Hybrid Capture 2 – HC2) 16

3.2 Chức năng các vùng gene và protein 21

Hình 13 Cấu trúc gene DNA của HPV 16 22

Hình 14 Sơ đồ cấu tạo của thụ thể α6 intergrin 25

4.1.1.2 Thụ thể Heparan sulfate proteoglycans (HSPGs)/Heparan

sulfate 26

Hình 15 Sơ đồ HSPG và HS 26

4.1.2 Sự xâm nhập của HPV vào trong tế bào 27

4.1.2.1 Nhập bào qua trung gian là clathrin 27

Hình 16 Sơ đồ cấu trúc của Clathrin 27

4.1.2.2 Nhập bào qua trung gian caveolae 27

Hình 17 Sơ đồ cấu trúc của Caveolae 28

Hình 18 Sơ đồ các con được xâm nhập vào tế bào của HPVs 29

4.2 Sự lan truyền của HPV 30

4.2.1 Sự lan truyền trong cơ thể 30

4.2.2 Sự lan truyền từ cơ thể này sang cơ thể khác 30

Hình 19 HPV tấn công tế bào cổ tử cung 31

CHƯƠNG V SAO CHÉP, PHIÊN MÃ VÀ DỊCH MÃ 32

Hình 23 ESE, ESS, các nhân tố điều khiển adenyl hóa 36

Hình 24 Các mRNA tạo ra từ genome HPV 37

5.3 Dịch mã 37

9.1 Bệnh ung thư cổ tử cung 38

9.1.1 Cơ chế gây bệnh của HPV 38

Hình 25 Cơ chế sinh ung thư của HPV 39

Hình 26 Các giai đoạn xâm lấn của HPV 40

9.1.2 Các tổn thương tiền ung thư đường sinh dục 40

Hình 27 Diễn tiến tự nhiên của nhiễm HPV nguy cơ cao và khả năng tiến triển thành ung thư cổ tử cung 41

9.2 Mụn cóc ở da 41

9.3 Mụn cóc hậu môn – sinh dục 42

9.4 U nhú hô hấp tái diễn 44

9.5 U nhú miệng 44

KẾT LUẬN 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

ĐẶT VẤN ĐỀVirus gây u nhú ở người (Human Papilloma Virus – HPV) là nguyên nhân chủ yếu gây ung thư cổ tử cung cho phụ nữ Các nhà khoa học đã tìm thấy HPV trong 99,7% các trường hợp ung thư tế bào gai ở cổ tử cung HPV cũng là nguyên nhân gây ra mụn cơm hay những nốt sần ở vùng sinh dục Có hơn 100 chủng HPV nhưng chỉ có 15 chủng gây ung thư cổ tử cung, trong đó hai chủng 16 và 18

là nguyên nhân gây ra hơn 70% các trường hợp ung thư cổ tử cung.

Có khoảng 100 loại HPV, trong 40 loại gây bệnh ở cơ quan sinh dục con người,

có 15 loại được liệt vào hạng "độc" tạo nguy cơ cho sức khỏe Hai loại thông thường nhất là HPV-16 và HPV-18 có khả năng nhiễm sâu vào cổ tử cung phụ nữ (3-10%), sau đó làm thay đổi mô tử cung và gây bệnh ung thư cổ tử cung Ngoài ra HPV loại độc cũng là nguyên nhân gây ung thư âm đạo , ung thư âm hộ , ung thư hậu môn , ung thư dương vật , ung thư đầu và cổ Loại ít độc hơn, HPV-6 và HPV-11,

có thể gây 90% chứng mụn cóc (mào gà) của cơ quan sinh dục Loại nhẹ gây chứng mụn cóc ở tay (HPV-2) và bàn chân (HPV-1).

Mặc dù tỷ lệ gây bênh không cao nhưng HPV dễ dang lây lan và không biểu hiện

triệu chứng cụ thể trong nhiều năm liền nên việc phòng bệnh là rất khó khăn Do đó cần có những hiểu biết đầy đủ về các thông tin cần thiết về HPV và bệnh do chúng gây ra để có ý thức trong việc ngăn ngừa và kiểm soát nguồn bệnh.

NỘI DUNG CHƯƠNG I TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC NGHIÊN CỨU HPV1.1 Vị trí phân loại của HPV trong sinh giới

Virus papilloma ở người (HPV) là một loại siêu vi trùng dạng DNA, rất hay lây,

và có khả năng gây nhiều chứng bệnh từ nhẹ đến trầm trọng

Phân loại virus:

42, 43, 44 được gọi là nhóm nguy cơ thấp

1.2 Vai trò của HPV

Theo điều tra của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế, tỉ lệ nhiễm HPV của phụ

nữ toàn cầu dao động trong khoảng 9-13%, nghĩa là cứ 10 phụ nữ có 1 người nhiễm HPV Ở Việt nam nếu chỉ tính riêng ung thư cổ tử cung thì số người chết vì HPV đã cao hơn nhiều so với HIV Trong 10 năm qua có khoảng 6.000 phụ nữ chết vì ung thư

cổ tử cung cao gấp đôi so với phụ nữ chết vì HIV/AIDS; mặc dù khác với HIV, các tổn thương do HPV, thậm chí ung thư do HPV có thể chữa khỏi hoàn toàn nếu được phát hiện sớm Tuy nhiên thực tế ở Việt Nam, phần lớn bệnh nhân ung thư cổ tử cung chỉ được phát hiện ở giai đoạn cuối, vài năm trước khi qua đời

Human Papilloma Virus (HPV) thuộc họ Papillomaviridae HPV được lây truyền qua da và phổ biến nhất là qua đường tình dục và tất nhiên những nơi có tiếp xúc trực

tiếp hay gián tiếp như âm đạo, cổ tử cung, hậu môn, đường niệu, bàng quang, miệng, mắt… sờ mó, hôn, đồng tính luyến ái, gây lây nhiễm qua niêm mạc miệng và từ đó xâm nhập vào cơ thể Người bị nhiễm HPV có thể biểu hiện lâm sàng là các thương tổn tại chỗ với trạng thái tăng sinh nội mô biểu bì thuộc nhiều dạng khác nhau như sùi niêm mạc, viêm, xơ cứng biểu mô, khối u papilloma vùng sinh dục, vùng hầu họng, dạng tăng sinh tế bào keratin Hầu như mọi type HPV đều có biểu hiện đặc trưng liên quan đến papilloma vùng sinh dục như condyloma, u xơ và u mềm cổ tử cung … HPV là một trong những tác nhân lây nhiễm qua đường tình dục phổ biến Biểu hiện lâm sàng là hình ảnh u sùi điển hình vùng hậu môn – sinh dục như âm hộ, âm đạo, trực tràng, vùng hậu môn, dương vật và u sùi vùng hầu họng đặc biệt là ung thư

cổ tử cung Hiện nay nguyên nhân gây nên ung thư cổ tử cung đã được biết một cách

rõ ràng là do HPV gây ra HPV được chia làm hai nhóm, nhóm nguy cơ cao và nguy

cơ thấp (về tính gây ung thư) Nhóm nguy cơ cao có liên quan trực tiếp đến bệnh lý ung thư chúng được phát hiện có mặt trên 90% các trường hợp ung thư cổ tử cung (ung thư tế bào lát hay ung thư tế bào tuyến), trái lại nhóm nguy cơ thấp thì hiếm gặp trong trong các trường hợp ung thư Tần suất lưu hành HPV cao trong cộng đồng, 6-11% ở người bình thường (có tài liệu báo cáo là >20%)

CHƯƠNG II CÁC PHƯƠNG PHÁP HIỆN TẠI ĐƯỢC SỬ

DỤNG ĐỂ NGHIÊN CỨU HPV2.1 Quan sát bằng mắt thường

Quan sát bằng mắt thường với iodine Lugol (VILI): VILI cũng dùng tương tự như VIA nhưng có bôi dung dịch iodine Lugol lên cổ tử cung và sau đó xem có vùng nào không bám màu VILI cho thấy ngay kết quả, tại Ấn Độ và Châu Phi, các kết quả của phương pháp này đã được đánh giá bằng phương pháp soi cổ tử cung và type cho kết quả tốt (42, 48, 50, 51) Các phát hiện không hoàn toàn chính xác nhưng phương pháp này có thể kết hợp với Pas Stream và Hybrid capture để tăng độ chính xác hơn bất kỳ xét nghiệm đơn lẻ nào Tuy nhiên độ nhạy và độ đặc hiệu còn hạn chế

Quan sát bằng mắt với acid acetic (VIA): có thể là biện pháp thay thế cho xét nghiệm tế bào Với phương pháp VIA dung dịch acid acetic 3-5% được bôi lên cổ tử cung và quan sát bằng mắt thường sau 1 phút Nếu quan sát thấy các vùng bị trắng gần khu vực chuyển tiếp thì xét nghiệm này được coi là dương tính đối với các tế bào tiền ung thư hoặc ung thư xâm lấn sớm Ưu điểm: không tốn kém, nhanh, không đòi hỏi kỹ

thuật cao, độ đặc hiệu 64%-98%, độ nhạy của VIA (66%-98%) tốt bằng hoặc tốt hơn độ nhạy của Pap smear, nhưng cũng giống như Pap smear, kiểm tra bằng mắt thường là rất chủ quan, và cần phải giám sát để kiểm soát chất lượng của các phương pháp kiểm tra bằng mắt thường.

2.2 PAP’s smear

Năm 1928, George Nicolas Papanicolaou – một bác sĩ người Hy Lạp giới thiệu những phát hiện mới của mình về một phương pháp chẩn đoán ung thư mới với tựa đề

bài báo là "New Cancer Diagnosis" (Phương pháp chẩn đoán ung thư mới) Cũng từ

năm này, Papanicolaou đến và làm việc tại Hoa Kỳ Tại đây, năm 1939, ông cùng với một đồng nghiệp của mình là bác sĩ Herbert Traut, một nhà bệnh học về phụ khoa, làm phết tế bào âm đạo cho nhiều bệnh nhân, và từ đó chứng minh khả năng chẩn đoán ung thư cổ tử cung ở giai đoạn sớm của phương pháp này

Năm 1943, họ giới thiệu những kết quả nghiên cứu của mình trong một bài báo

nổi tiếng "Diagnosis of Uterine Cancer by the Vaginal Smear" (Chẩn đoán ung thư tử

cung bằng phết tế bào âm đạo) Từ đó, phương pháp này được gọi theo tên của người

đã khởi xướng nó – xét nghiệm Pap

Từ đó đến nay, phương pháp làm xét nghiệm này đã có nhiều cải tiến để tăng tính chính xác và hiệu quả, và hiện được dùng rất rộng rãi để tầm soát ung thư cổ tử cung Cũng cần biết rằng đây là xét nghiệm chỉ dùng để tầm soát, mà không dùng để chẩn đoán và chỉ áp dụng với ung thư cổ tử cung chứ không phải dùng cho “ung thư tử cung” như bài báo mà Papanicolaou đã viết.

Tại Việt Nam, trước đây xét nghiệm này thường được gọi tên là phết mỏng tế bào

âm đạo, nhưng tên gọi trên không chính xác vì thực chất là lấy tế bào của cổ tử cung chứ không phải của âm đạo, nên một số tài liệu mới gần đây đã gọi xét nghiệm này là phết tế bào cổ tử cung, hoặc phết mỏng tế bào cổ tử cung, hoặc cũng gọi tắt là xét nghiệm Pap

Nguyên lý dựa trên tính chất bong ra một cách tự nhiên, liên tục của tế bào âm đạo, cổ tử cung, đặc biệt là các tế bào bất thường thì tính bong sớm và rất dễ bong Phân tích hình thái học chi tiết người ta cho rằng dấu hiệu của tế bào bị nhiễm HPV là sẽ bị biến đổi thành các dạng tế bào đa nhân, tế bào đa nhân khổng lồ, hoặc nhân teo lại, hay có thể tìm thấy tế bào bóng, tế bào có vòng sáng quanh nhân …

Hình 1 Các tế bào cổ tử cung bình thường dưới kính hiển vi

Hình 2 Các tế bào bất thường cổ tử cung dưới kính hiển vi

* Cách thực hiện

- Dùng que Ayre đặt áp vào ỗ cổ tử cung

- Trải đều tế bào lên lame kính

- Cố định mẫu trong dung dịch cồn + ether hoặc xịt một lớp keo mỏng lên bề mặt lame

Phương pháp PAP’s smear có độ nhạy 44 – 78% và độ đặc hiệu cao 91 – 96%, đơn giản, rẻ tiền, không gây tác động trên người được làm, dễ áp dụng đại trà Tuy nhiên phương pháp này cũng có tỉ lệ âm tính giả, theo các tác giả giao động từ 1,1 – 29,7%

2.3 Phương pháp lai phân tử sử dụng sử dụng mẫu dò trực tiếp

Để phân tích kiểu gene của HPV, người ta sử dụng kỹ thuật Southern Blot (là

kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu đầu tiên về HPV) Phương pháp lai tại chỗ (là

kỹ thuật gần giống với phương pháp hoá mô miễn dịch, người ta đánh giá sự biểu hiện của kháng nguyên trong điều kiện của mô học bệnh lý)

Hình 3 Kỹ thuật lai phân tử

Nhược điểm của phương pháp này là độ nhạy thấp, tốn nhiều thời gian và cần một lượng lớn DNA tinh khiết cao Đối với các mô được cố định sự liên kết chéo của DNA do có xúc tác bởi formol gây ra sự thoái hoá của DNA hoặc tế bào hư hại

2.4 PCR (Polymerase Chain Reaction)

Với PAP’s smear ta có thể nói có hay không tổn thương nghi ngờ ác tính hay không ác tính trên cổ tử cung Ngày nay nhờ sự phát triển của sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật PCR cho phép nhận biết chính xác có nhiễm HPV hay không và nhiễm type nào để tìm thấy nguy cơ cao hay thấp có khả năng dẫn đến ung thư cổ tử cung PCR dương tính không có nghĩa là ung thư cổ tử cung, việc nhận định có nhiễm HPV hay không nhiễm không nói được tình trạng mô học hay tế bào học của cổ tử cung mà chỉ có thể nói rằng người được thử đang trong tình trạng nhiễm HPV

Ứng dụng từ nhiều nghiên cứu đã được công bố trên thế giới kỹ thuật PCR đã được triển khai thực hiện và áp dụng tại Bệnh viện Phong Da liễu Trung ương Quy Hòa để phát hiện và định type HPV Phản ứng chuỗi Polymerase là một dụng cụ có giá trị vì

nó cho phép các vùng gene đặc hiệu của DNA nhân lên trong ống nghiệm Điều này làm cho chủng có thể được phát hiện với số lượng lớn như hầu hết các trường hợp nhiễm virus khác Với các ưu điểm đó, việc ứng dụng quy trình kỹ thuật PCR để phát hiện DNA của HPV trong mẫu bệnh phẩm dịch phết cổ tử cung

- Đầu tiên người ta tách chiết DNA từ mẫu dịch phết tế bào cổ tử cung PCR đặc hiệu theo nhóm (gs-PCR: Group–specific PCR) phát hiện nhiều type HPV cùng một nhóm Sử dụng cặp mồi chung (consensus primers) là MY09 và MY11 có trình tự: (5’-GCG ACC CAA TGC AAA TTG GT- 3’) và (5’- GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC-3’), có khả năng khuếch đại đoạn DNA đích có độ dài 450 cặp nucleotide, nằm trên gen L1 (gen cấu trúc nằm trên vỏ capsid của HPV)

- Để tăng tuyệt đối độ nhạy của phản ứng PCR cặp mồi thứ hai cũng được sử dụng cho kỹ thuật nested PCR là cặp mồi GP5+ và GP6+ có trình tự: (5’- TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC-3’) và (5’ – GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT-3’), cặp mồi này khuếch đại một đoạn DNA nằm trong trong đoạn DNA sản phẩm của PCR lần I từ cặp mồi MY9 và MY11, có độ dài 150 cặp nucleotide

- PCR đặc hiệu cho từng type HPV (ts-PCR: type specific PCR), việc định type HPV dựa vào sự khác nhau về trình tự các nucleotid trên gen E6/E7 (gen gây ung thư - oncogenes) có khả năng tổng hợp protein gây ung thư, do đó nó có khả năng quyết định tính gây bệnh của virus và chúng có mức độ biến đổi khác nhau

Hình 4 Vị trí các gen L1 và E6/E7 của HPV và độ dài sản phẩm PCR trong phát hiện

và định type HPV

- Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho từng type bao gồm các type được gọi là nguy

cơ cao là: HPV type 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 và 68 Các type được gọi là nguy cơ thấp là: HPV type 6-11, 42, 43 và 44

- Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên gel agarose Thời gian xét nghiệm: 3 – 4 giờ

Hình 5 Kết quả ts-PCR

định type HPV type 33, 6/11,

58, 52 và 56

Hình 6 Kết quả ts-PCR

định type HPV type 35, 42, 43

và 44

Hình 7 Kết quả ts-PCR

định type HPV type 68, 39, 51

và 66

Hình 8 Kết quả ts-PCR

định type HPV type 16, 18, 31,

59 và 45

Hình 9 Phát hiện và định

type HPV bằng

kỹ thuật NM – PCR

Kỹ thuật Nested-Multiplex PCR (NM-PCR) cũng được ứng dụng, hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm đồng thời 3 – 4 cặp mồi sao cho sản phẩm PCR có độ dài khác biệt

để có thể phân biệt được trên thạch điện di Kỹ thuật đòi hỏi nghiêm ngặt các điều kiện

về nhiệt độ, nồng độ các thành phần của hỗn hợp PCR và việc chọn lựa các cặp mồi để phản ứng khuếch đại đặc hiệu có thể xảy ra

Phản ứng PCR với ưu điểm là độ nhạy: hơn 90%, cần 5 DNA; giá trị tiên đoán âm: 99%; xác định được type; giá thành tương đối rẻ (200.000đ đến 1.000.000đ; nhưng chưa được FDA chứng nhận và tốn thời gian) Xét nghiệm PCR ngày nay được khuyến cáo sử dụng kèm với xét nghiệm PAP’s smear nhằm nâng cao khả năng sàng lọc các trường hợp nghi ngờ, giúp theo dõi bệnh chặt chẽ hơn và có hiệu quả thật sự trong tầm soát ung thư cổ tử cung

2.5 Định genotype HPV bằng kỹ thuật PCR – ELISA

Sử dụng sản phẩm của phẩm Công ty Khoa Nam, mẫu bệnh phẩm cho lai lai với

9 mẫu dò đặc hiệu genotype là 16, 18, 31, 33, 35, 39/45, 6/11

- Trích ly DNA – HPV từ mẫu bệnh phẩm: sử dụng dung dịch PROKPREP là proteinase K/detergent để thủy phân protein bám trên DNA của virus, sau đó ly trích DNA

- Phát hiện DNA – HPV : phản ứng PCR sử dụng mồi MY09, MY11 (Invitrogen)

và dUTP có gắn DIG (Roche) được pha với nồng độ thích hợp để khuếch đại đoạn gen đặc hiệu dài 450bp trên vùng L1 của HPV (sản phẩm PCR có gắn DIG trong suốt quá trình thực hiện) Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, kết quả được dương tính khi vạch khuếch đại rõ nét ở vị trí 450 bp

- Xác định genotype của HPV: những mẫu HPV – DNA dương tính được tiến hành xác định genotype như sau: biến tính sản phẩm PCR (HPV dương tính) ở 950C, trong 10 phút Sản phẩm sau biến tính được giữ ngay trong đá (để duy trì tình trạng biến tính) Sản phẩm này được đem lai trong các giếng ELISA (có đoạn dò đặc hiệu cho từng genotype của HPV đã được gắng trên các giếng ELISA) Sản phẩm lai được được phát hiện bằng cộng hợp là anti-DIG gắng HRPO, phức hợp này được phát hiện bằng chất hiện màu TMP Kết quả được đọc ở bước sóng 450nm Khi OD của giếng

có giá trị > OD của giếng chứng âm và có trị số cao nhất so với OD của các giếng khác trong cùng một mẫu thì là kiểu gen của mẫu Nếu tất cả các giếng có OD < OD của giếng chứng âm thì kết luận là mẫu dương tính với HPV nhưng với kiểu gen khác với kiểu gen 16, 18, 31, 33, 35, 39/45, 6/11

Ưu, nhược điểm: phát hiện và định vị genotype trong các mẫu quệt cổ tử cung là xét nghiệm rất cần thiết để chuẩn đoán, phát hiện sớm ung thư và để dùng vaccine phòng ngừa kịp thời Mặc dù phương pháp PCR – ELISA hữu hiệu để phát hiện và định genotype HPV nhưng phương pháp này bị giới hạn số genotype cần xác định vì phụ thuộc vào đoạn dò đặc hiệu cho từng genotype

tiếp sản phẩm PCR đặc hiệu vùng gen L1 của HPV và so sánh trình tự này trên thư

viện trình tự các genotype của HPV, nhờ vậy mà có thể cho được kết quả genotype HPV

Mẫu bệnh phẩm được đem PCR mồi MY09 và MY11 (Invitrogen) và dUTP để khuếch đại đoạn gen đặc hiệu dài 450bp trên vùng L1 của HPV Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, kết quả được dương tính khi vạch khuếch đại rõ nét ở vị trí

450 bp Sản phẩm PCR có kết quả dương tính được làm sạch để loại bỏ dimer primer, thành phần không sử dụng của PCR mix Sản phẩm PCR tinh sạch được định lượng bằng quang phổ và điện di lại trên gel agarose 2% để chắc chắn loại bỏ primer dimer

Sau đó thực hiện phản ứng chu kỳ giải trình tự với bộ mồi MY09 và MY11 bằng máy giải trình tự và phân tích bằng phần mềm sequences analysis Sau khi giải trình tự, tiến hành định genotype của trình tự bằng 2 cách: (1) đăng nhập trình tự giải được trên NCBI Blast để chương trình so sánh trình tự đăng nhập với trình tự trong genbank và hiển thị kết quả so sánh; (2) xây dựng một thư viện các trình tự của các genotype tham chiếu của HPV cho thư viện này vào các thư viện của chương trình Bio-Edit, sau đó dùng phần mềm này để đăng nhập trình tự giải được với trình tự đã đăng nhập.

Mặc dù kỹ thuật PCR-ELISA phát hiện và định genotype HPV ứng dụng được trong nghiên cứu và chuẩn đoán, tuy nhiên với phương pháp bị giới hạn một số genotype Phương pháp giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khá tốn kém, phức tạp, mất nhiều thời gian, nhưng phương pháp này giúp ta có thể xác định được hầu hết các genotype

2.7 Xét nghiệm bắt mồi lai (Hybrid Capture 2 – HC2)

Hybrid Capture 2 hoạt động trên nguyên tắc khuếch đại tín hiệu, dùng probes là sợi đơn RNA (1kb) thuận tiện cho cả bắt mồi và phát hiện DNA HPV mục tiêu Tiếp theo làm biến tính DNA mục tiêu và lai với probe (lai RNA – DNA trên màng chứa anti đặc hiệu ở nhiệt độ phòng) Sau đó phosphatase kiềm đánh dấu kháng thể đơn dòng anti – RNA – DNA (liên quan với captured hybrids) Acid nucleic không được lai (gồm DNA mục tiêu và probe) được rửa bỏ Sản phẩm sau khi lai và đánh dấu bằng phosphatase kiềm được phát hiện phát quang hóa học, đo luminometer

Xét nghiệm có thể phát hiện 13 loại HPV (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,

58, 59 và 68) nhạy hơn phương pháp quan sát bằng mắt thường và tế bào học, với độ nhạy trên 90%; giá trị tiên đoán âm: 99% nhưng độ đặc hiệu thấp: 87%; không xác định được type; ít nhạy hơn PCR, cần 5000 DNA và giá thành đắt, tuy nhiên xét nghiệm này được Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận

2.8 Real-time PCR.

Tách chiết DNA và tiến hành phản ứng real–time PCR Hiện nay có 4 kiểu phản ứng được sử dụng trong kỹ thuật real–time Cả 4 kiểu phản ứng đều sử dụng các chất nhuộm huỳnh quang (flourescent dye), có sự kết hợp bước nhân bản và phát hiện sản phẩm PCR mục tiêu theo thời gian thật (Realtime) của phản ứng

Người ta dựa vào đặc tính exonuclease 5’ – 3’ của Taqman polymerase để hình thành phương pháp Probe Taqman được gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ và

một chất “dập tắt” ở đầu 3’, sao cho ánh sáng huỳnh quang của chất phát huỳnh quang

bị hấp thu bởi chất “dập tắt” Khi còn nguyên vẹn tín hiệu của chất phát huỳnh quang

bị hấp thụ do chúng nằm gần chất hấp thụ Trong giai đoạn kết hợp bắt cặp và kéo dài DNA trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’ – 3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi của Tapman sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang Kết quả chất phát huỳnh quang tách rời khỏi chất hấp thụ và tín hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu

Hình 10 Phản ứng Taqman probe

Các xét nghiệm sử dụng kỹ thuật realtime PCR với công nghệ hiện đại nhất hiện nay, do đó các kết quả định lượng đều là định lượng chính xác Các phương pháp định lượng dựa trên kỹ thuật PCR – Điện di hoặc giải trình tự chỉ mang tính chất tương đối không chính xác So với PCR – Điện di và nhất là Nested PCR – Điện di, kỹ thuật realtime PCR sẽ tránh được nhược điểm lớn nhất của PCR là

ngoại nhiễm gây dương tính giả, do đó kết quả sẽ chính xác nhất Xét nghiệm định genotype sử dụng kỹ thuật realtime PCR và lai phân tử đều cho phép xác định chính xác sự đồng nhiễm các genotype Kỹ thuật giải trình tự bình thường không xác định được đồng nhiễm, để làm được việc này bằng giải trình tự phải tốn chi phí rất cao và rất khó, có thể không thành công Nhất là đối với HPV, tỷ lệ đồng nhiễm rất cao, do đó áp dụng kỹ thuật giải trình tự sẽ cho kết quả không chính xác Việc xác

định sai hoặc không xác định được sự đồng nhiễm các genotype có thể dẫn đến hậu quả nghiêm trọng Ví dụ: 1 bệnh nhân đồng nhiễm HPV genotype 11 (nguy cơ gây ung thư thấp) và 16 (nguy cơ gây ung thư cao) với 11 chiếm ưu thế, xác suất phương pháp giải trình tự cho kết quả genotype 11 là rất cao, như vậy việc theo dõi và can thiệp của bác sỹ sẽ không chính xác

CHƯƠNG III: CẤU TRÚC CỦA HPV3.1 Cấu tạo

Human Papillomavirus (HPV) là loại virus có cấu trúc DNA thuộc họ Papovaviridae Khác với các loại virus như viêm gan siêu vi A.C.SARS cororlavirus

có cấu tạo di truyền RNA Bởi vì virus này không thể phát triển trong thực nghiệm và

không có xét nghiệm huyết thanh nào đáng tin cậy nên sự nhận diện Papillomavirus và

định type HPV căn cứ vào tiêu chuẩn nucleic acid

HPV có cấu trúc DNA gồm 8000 bp Hai chuỗi, phân tử DNA cuộn lại trong một

vỏ protein bao gồm 2 phân tử L1 và L2 Bộ mã di truyền của HPV ngoài phần mã để tạo L1, L2 còn có phần mã hóa của 6 loại protein sớm từ E1 đến E7 cần thiết cho sự nhân đôi của DNA và sự thành lập những hạt thể virus mới trong những tế bào bị nhiễm virus

Hình 11 Cấu trúc của HPV

Cấu trúc DNA của HPV được phân vùng gene sớm E (early region) mã hóa protein trước khi nhân đôi DNA, vùng gene muộn L (late region) mã hóa vỏ bọc của virus và vùng không mã hóa hay vùng điều hòa ngược (URR upstreeam regulatory region)

Vùng gene sớm và vùng gene muộn có những khung đọc mở (ORF) cho việc dịch các protein chức năng

- Vùng gene sớm (E1, E2, E4, E5, E6, E7) biểu hiện sớm trong đời sống virus, có đặc điểm là có tính đặc hiệu mô cao, quan trọng nhất là các gene E6, E7 có vai trò chính trong việc gây ung thư ở tế bào kí chủ

- Vùng muộn L gồm protein chính L1 (trọng lượng phân tử 54-58 kDa) và một protein phụ L2 (trọng lượng phân tử 68 – 76 kDa) mã hóa protein vỏ bọc chủ yếu và thứ yếu Sự biểu hiện vùng muộn này muộn hơn vùng sớm và có thể tìm thấy trong các tế bào keratin trưởng thành ở lớp trên biểu mô lát.

Hình 12 Cấu trúc L1, L2 của HPV

Circular DNA

3.2 Chức năng các vùng gene và protein

- Gene E1:

Là một trong hai vùng ổn định nhất ở HPV Chức năng chính của E1 là mã hóa cho protein gắn đặc hiệu vào DNA E1 có hoạt động tháo xoắn không phụ thuộc ATP, rất cần thiết cho sự sao chép của virus

- Gene E2:

Đây là gene mã hóa chủ yếu cho các yếu tố phiên mã của tế bào Bên cạnh đó, E2 còn tương tác với E1, giúp E1 dễ dàng gắn liền vào điểm khởi động sao chép và có thể bắt đầu sao chép tăng cường hơn Các thí nghiệm cho thấy rằng ở nồng độ thấp, E2 tăng cường sự phiên mã, nhưng ở nồng độ cao, nó lại ức chế sự phiên mã Sự chèn DNA virus vào bộ gene của vật chủ thường làm gián đoạn gene E2, ảnh hưởng tới khả năng ức chế sự biểu hiện protein E6, E7

từ đó kích thích sự phát triển của tế bào Mặt khác, protein E5 còn có vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự chết theo chương trình của tế bào khi có sự sai hỏng DNA do chính virus gây ra

+ Gắn kết với protein p53, một protein ức chế sinh u của tế bào chủ, làm tăng sự phân giải của p53 bởi hệ thống protein của tế bào và làm giảm khả năng ức chế khối u của protein này.

+ Liên kết với gene trong quá trình bất tử hóa Thực nghiệm trên chuột cho thấy liên kết với gene kích thích sự phát triển tế bào NIH 3T3 Tế bào trở nên bất tử, đồng thời hoạt động hóa chất hoạt hóa E2 của Adenovirus

Nếu E6 cản trở quá trình tự sửa sai của tế bào chủ yếu thông qua liên kết với p53 thì E7 thực hiện vai trò này thông qua liên kết với pRB, cũng là một protein ức chế khối u Liên kết này có ái lực cao cấp 10 lần ở những type virus thuộc nhóm nguy cơ cao so với nhóm nguy cơ thấp Điều này phải làm giải phóng số lượng lớn yếu tố phiên mã E2F tự do, kích thích quá trình phiên mã, kéo dài đời sống tế bào

Hình 13 Cấu trúc gene DNA của HPV 16

- Gene L1 và L2:

Đây là 2 vùng gene cấu trúc Vùng L1 mã hóa protein L1, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên nang của virus L1 có trọng lượng phân tử 56 – 60 kDa, được phosphoryl hóa yếu và không gắn với DNA Vùng L2 mã hóa protein vỏ capsid phụ, có trọng lượng phân tử 60 – 69 kDa, lại được phosphoryl hóa cao và khả năng gắn DNA.

3.3 Vòng đời và đáp ứng miễn dịch

Human Papillomavirus có kích thước nhỏ, không có vỏ, gene hình cầu được mã hoá bằng cấu trúc protein Ll và L2 Vòng đời toàn vẹn của virus được nối liền giai đoạn trưởng thành của sự sừng hoá Các nhiễm trùng sơ khởi xuất hiện ở tế bào tầng

cơ bản Những sản phẩm gene đặc hiệu được sao chép lại ở mọi mức độ biệt hóa của

sự sừng hoá tế bào vảy Tại bề mặt, vỏ protein L1 được sao chép và nhờ vào sự bong

ra của tế bào có đời sống ngắn, các virion HPV chuyển qua các tế bào trong biểu mô

kế tiếp

HPV tránh được hệ thống miễn dịch thông qua nhiều cơ chế khác nhau Nhiễm trùng HPV dẫn đến sự đáp ứng kém biểu hiện của interferon và những con đường điều hoà bằng cách ngăn chặn hoạt động gây độc tế bào của các lympho T Không có sự phối hợp huỷ tế bào, hay giải phóng các cytokine tiền viêm xuất hiện như là kết quả của nhiễm trùng tế bào cơ bản Sự vắng mặt của các dấu hiệu để xác định sự nhiễm virus, hệ thống miễn dịch không hoạt động và sự nhiễm vẫn tiếp tục Tầm quan trọng của miễn dịch tế bào thể hiện rõ ở những bệnh nhân nhiễm HIV trên lâm sàng và ở những bệnh nhân ghép thận Đây là những đối tượng vốn có nguy cơ cao với những bệnh lý liên quan với HPV

Khoảng 75-90% nhiễm HPV xuất hiện rõ ràng trong vòng một năm sau khi nhiễm bệnh Khoảng trống được làm trung gian qua sự bong tự nhiên của tế bào biểu

mô, tế bào miễn địch gián tiếp và một phần bởi nồng độ thấp của kháng thể được trung hoà đáp ứng một cách đặc hiệu với HPV L1 epitope Đáp ứng kháng thể giảm dần và mất đi sau khoảng 3 năm trong trường hợp lây nhiễm tự nhiên

Những người nhiễm một loại HPV có thể tạo ra kháng thể đặc hiệu với type đó nhưng có thể không miễn dịch đối với các type HPV khác Vì vậy, chiến lược sản xuất vaccine cần phối hợp kháng nguyên của những type HPV gây bệnh Khoảng thời gian

từ nhiễm HPV đến xuất hiện tổn thương ác tính thường mất 10 năm hoặc lâu hơn nữa Nhiễm HPV chỉ có ở tế bào biểu mô và không đi vào máu nên HPV tránh được

sự nhận diện của hệ thống miễn dịch Ở những phụ nữ đã được chủng ngừa, có thể

không phát hiện được bất kỳ kháng thể nào đặc hiệu cho type HPV Nồng độ kháng thể bảo vệ tuỳ thuộc vào đáp ứng của vaccine và đáp ứng miễn dịch được duy trì liên tục hay cần thiết tiêm nhắc lại

Hiện nay, người ta khuyến cáo tiêm nhắc lại trong khoảng thời gian từ 7 đến 10 năm để duy trì sự bảo vệ Chuẩn độ của kháng thể duy trì liên tục được báo cáo với việc sử dụng hệ thống tá dược AS04 ở vaccine nhị giá được thiết kế để kích thích kháng nguyên trình diện tế bào và kéo dài đáp ứng tế bào lympho B nhớ