ký thuật di truyền

ĐÁNH DẤU BẰNG BIOTINĐánh dấu mẫu dò probe Ỉ Lai với trình tự mục tiêu Ỉ Phát hiện phân tử lai thông qua phức hợp avidin/chất phát huỳnh quang... PHƯƠNG PHÁP NICK TRANSLATIONW “Đục lỗ” tr

1KỸ THUẬT DI TRUYỀN

PCR, RT-PCR

THU NHẬN GENE

Giải trình tự

Các phương pháp in silico

XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC GENE

TÌM HIỂU CHỨC NĂNG CỦA GENE

Northern blot

Southern blot

Gây tạo đột biến

Phiên mã – dịch mã

in vitro

ỨNG DỤNG

Tổng hợp nhân tạo

Mục tiêu : Hiểu rõ cấu trúc và chức năng của gene

để ứng dụng vào các lĩnh vực khoa học và đời sống

NỘI DUNG

1 Thu hồi nucleic acid

2 Phân tích định tính và định lượng nucleic acid

3 Sử dụng các enzyme thông dụng trong sinh học phân tử

4 Lai phân tử

5 Tạo dòng

6 PCR

7 Giải trình tự nucleic acid

8 Biến đổi vật liệu di truyền và chuyển vật liệu di truyền đã biến đổi vào tế bào

THU HỒI NUCLEIC ACID

1 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT

- Tách chiết DNA

- Tách chiết RNA

2 PHƯƠNG PHÁP LY TÂM

- Ly tâm phân đoạn

- Ly tâm đẳng tỷ trọng – Thu nhận nucleic acid tinh sạch

3 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

Thu mRNA

TÁCH CHIẾT DNA & RNA

Thiocyanate

1 Phá màng tế bào, màng nhân Chất tẩy (SDS) guanidinium

+ siêu âm, LiCl, Urea,

+ cơ học,

2 Loại protein Phenol pH8 : Phenol pH4 :

Chloroform:IAA Chloroform:IAAKhác Khác

3 Thu hồi nucleic acid :

Tủa Ethanol tuyệt đối Ethanol tuyệt đối

Isopropanol, Isopropanol, Boom Hấp phụ trên silica Hấp phụ trên silicaLọc Thu trên màng lọc Thu trên màng lọc

PHÁ MÀNG SINH HỌC BẰNG CHẤT TẨY

Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn

Chất tẩy, là phân tử lưỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và các phân tử

phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng

LY TÂM PHÂN ĐOẠN

Ly tâm phân đọan (a) và phân đoạn vùng (b) phân tách các phần tửtrong hỗn hợp dựa trên khối lượng của chúng.Thời gian và lực ly tâm được xác định cho từng nhóm phần tử

Dung dịch ly tâm có tỷtrọng thấp hơn các phần tử cần phân tách

LY TÂM ĐẲNG TỶ TRỌNG

Ly tâm đẳng tỷ trọng

(isopycnic) phân tách

các phần tử trong hỗn

hợp dựa trên tỷ trọng

của chúng

Thời gian và lực ly tâm

là chung cho các nhóm

phần tử

Dung dịch ly tâm có tỷ

trọng với giá trị đi từ

thấp hơn đến cao hơn

tỷ trọng của các phần

tử cần phân tách

9THU HỒI NUCLEIC ACID, PHAGE SAU LY TÂM

ĐẲNG TỶ TRỌNG

11THU HỒI mRNA BẰNG SẮC KÝ ÁI LỰC

CÂU HỎI – PHẦN 1

1 Những khác biệt trong phương pháp tách chiết-tinh sạch DNA và RNA, vì sao lại có những khác biệt đó ?

2 Phương pháp tủa, Boom có những ưu nhược điểm gì ?

3 Khác biệt giữa ly tâm phân đoạn và ly tâm đẳng tỷ trọng ? Ứng dụng của từng loại ly tâm ?

4 Phương pháp tách chiết-tinh sạch DNA plasmid có gì khác với tách chiết-tinh sạch DNA bộ gene ?

ĐIỆN DI DNA TRÊN GEL AGAROSE

- Điện di theo phương nằm ngang

- Giá thể là gel agarose

- Phát hiện với màu nhuộm ethidium bromide, … phát huỳnh quang dưới đèn tử ngoại

- Khả năng phân giải trung bình, phụ thuộc vào nhiều yếu tố, đặc biệt là nồng độ agarose

15ĐIỆN DI TRONG TRƯỜNG XUNG (PULSED-FIELD

ELECTROPHORESIS)

ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE

- Điện di theo phương thẳng đứng

- Giá thể là gel polyacrylamide

- Phát hiện với màu nhuộm Coomassie blue, nhuộm bạc, phát hiện trên phim tín hiệu đồng vị phóng xạ

- Khả năng phân giải cao, phân biệt được những trình tự chỉ cách nhau 1 nucleotide

17ÑIEÄN DI PROTEIN TREÂN GEL

POLYACRYLAMIDE

18ÑIEÄN DI 2 CHIEÀU PROTEIN TREÂN GEL

POLYACRYLAMIDE

KỸ THUẬT RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM – ĐA HÌNH KÍCH THƯỚC CÁC TRÌNH TỰ CẮT GIỚI HẠN

VNTR (VARIABLE NUMBER OF

TANDEM REPEATS)

Phân tích VNTR để nhận biết tính đa hình di truyền ở cá

thể Sử dụng mẫu dò kết hợp với RE để phân tích VNTR

Ví dụ về việc sử dụng PCR và điện

di trong xác định phả hệ

Đây là phả hệ của Sa hoàng, vợ, 3 con, bác sĩ gia đình và các người hầu

KỸ THUẬT “ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT

ASSAY : PHÁT HIỆN NHÂN TỐ TRANS

Các phân đọan protein được ủ với một đoạn DNA đã được đánh dấu phóng xạ vàcó mang một trình tự CIS Các tổ hợp trên sau đó sẽ được phân tích bằng điện di không biến tính (đối với protein) Các phân đọan DNA không gắn protein sẽ di chuyển xa hơn các phân đọan trong đó trình tự CIS liên kết với protein (7, 8 trong hình) Như vậy các phân đọan protein tương ứng với các tổ hợp 7 và 8 sẽ được xác định

CÂU HỎI - PHẦN 2

1 Các điểm khác biệt trong phương pháp tiến hành điện di trên gel agarose và gel polyacrylamide

2 Các ứng dụng của điện di trên gel agarose, điện di trên gel polyacrylamide

3 Phương pháp đo mật độ quang (OD) :

- Nguyên lý và cách xác định hàm lượng nucleic acid

- Nguyên lý và cách xác định độ sạch của nucleic acid

4 Nguyên lý và cách tiến hành phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

5 Nguyên lý và cách tiến hành phương pháp VNTR (Variable Number of Tandem Repeats)

6 Nguyên lý và cách tiến hành phương pháp Electrophoretic Mobility Shift Assay

SỬ DỤNG CÁC ENZYME THÔNG DỤNG TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ

1 ENZYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME)

2 POLYMERASE (DNA, RNA)

3 NUCLEASE (DNase, RNase)

4 LIGASE

MỘT SỐ ENZYME GIỚI HẠN (RE)

MỘT SỐ ENZYME GIỚI HẠN (RE)

CÁC ENDO- & EXONUCLEASE

Loại enzyme Cơ chất Vị trí nhận biết và cắt trên DNA, RNA

KỸ THUẬT DNASE I

FOOTPRINTING : XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ CIS TRÊN DNA

Một đọan DNA được đánh dấu phóng xạ

ở một đầu 5’ và được ủ chung với các

phân đoạn protein được xem là có tương tác với DNA này Sau đó, tổ hợp được

mang phân cắt bằng enzyme Dnase I

Nơi nào trên DNA có gắn protein, nơi đósẽ được bảo vệ khỏi sự phân cắt này, vàhình thành “dấu chân” (giếng 9-12 và O trên hình) Đó chính là trình tự CIS Kích thước của trình tự có thể được nhận biết khi so sánh với thang DNA (M trên hình)

CÂU HỎI – PHẦN 3

1 Cách xây dựng bản đồ cắt hạn chế (restriction map)

2 Cách tiến hành phương pháp DNase Footprinting, ứng dụng của phương pháp

3 Ứng dụng của các nuclease : Nuclease S1, DNase I, RNase A, RNase H,

4 Ứng dụng của các polymerase : reverse transcriptase, DNA polymerase, SP6 RNA polymerase, Taq polymerase, DNA polymerase I, Terminal transferase

5 Ứng dụng của T4 polynucleotide kinase, của alkaline phosphatase

LAI PHÂN TỬ

1 ĐÁNH DẤU MẪU DÒ DNA, RNA,

OLIGONUCLEOTIDE

2 CÁC KIỂU LAI

W Lai trong pha lỏng

W Lai trên pha rắn (Southern, Northern, dot blot)

W Lai tại chỗ

3 ỨNG DỤNG

CÁC PHÂN TỬ DÙNG ĐÁNH DẤU HOÁ HỌC

Có ái lực với Digoxigenin

anti-Dùng phối hợp với dATP, dCTP,

dGTP, dTTP

Có ái lực với streptavidinDùng phối hợp với dATP, dCTP,

dGTP, dTTP

ĐÁNH DẤU BẰNG BIOTIN

Đánh dấu mẫu dò (probe) Ỉ Lai với trình tự mục tiêu Ỉ Phát hiện phân tử lai thông qua phức hợp avidin/chất phát huỳnh quang

PHƯƠNG PHÁP NICK TRANSLATION

W “Đục lỗ” trên 2 mạch của DNA bằng Dnase I

W DNA polymerase I sửdụng haọt tính 5’-3’

exonuclease “gặm” mạch DNA theo chiều 5’-3’

W DNA polymerase I vừa thủy phân vừa tổng hợp mạch mới bù vào lỗ trống với các dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP đánh dấu)

W Kết quả là probe được đánh dấu

PHƯƠNG PHÁP RANDOM PRIMING

W Biến tính mạch đôi DNA

W Bắt cặp tổ hợp “ mồi“ ngẫu

nhiên trên 2 mạch

6 4 = 1296 primers

W DNA polymerase tổng hợp bù

vào chỗ trống bằng các dNTP trong đó có nucleotide đánh dấu

W Kết quả là probe đánh dấu

PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU

PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU OLIGONUCLEOTIDE SỬ DỤNG TERMINAL TRANSFERASE

TỔNG HỢP MẪU DÒ RNA BẰNG PHIÊN MÃ IN VITRO

W Trình tự sẽ dùng làm probe được tạo dòng vào vector biểu hiện

W Tùy mạch muốn dùng làm probe sẽ sử dụng promoter tương ứng

W RNA polymerase nhận biết promoter đặc hiệu, gắn vào và tổng hợp RNA

W Nucleotide tự do dùng trong quá

trình phiên mã có mang một phần

nucleotide đánh dấu

W Kết quả là mẫu dò RNA đánh dấu (riboprobe)

TỔNG HỢP MẪU DÒ RNA BẰNG PCR VÀ

PHIÊN MÃ IN VITRO

gene A

T7 promoter PCR

Phiên mã in vitro với T7

RNA polymerase

Mẫu dò RNA

Thay vì tạo dòng thì sử dụng PCR để gắn thêm trình tự promoter phù hợp

Quá trình tiếp theo giống như tạo dòng

SOUTHERN BLOT

SOUTHERN BLOT (tiếp)

Tách chiết & cắt DNA bằng enzyme giới hạn

Điện di Chuyển lên màng lai Lai và phát hiện phân tử lai

Biến tính DNA Tiền lai

LAI TRÊN PHA RẮN

& PHÁT HIỆN PHÂN TỬ LAI BẰNG ĐỒNG

VỊ PHÓNG XẠ

Cố định

DNA lên

màng lai

Lai với mẫu

dò đánh dấu

SOUTHERN NORTHERN BLOT

-KẾT QUẢ NORTHERN BLOT

Ghi chú : UN : Mẫu chứng khôn cảm ứng, 48h : mẫu cảm ứng tạo E-globin sau 48 giờ, 96h : mẫu cảm ứng tạo E-globin sau 96 giờ Mẫu dò đồng vị phóng xạ

DOT BLOT

Tách chiết DNA, RNA Ỉ Biến tính

(nếu có) Ỉ Đặt lên màng lai Ỉ Tiền

lai Ỉ Lai với mẫu dò (trình tự đã

biết) Ỉ Phát hiện phân tử lai

Dùng để phát hiện, hoặc định lượng tương đối khi so với thang hàm

lượng đã biết

Phương pháp cải biên là reverse dot blot Trình tự đã biết được cố định trên giá thể còn trình tự cần biết (mục tiêu) được đánh dấu

Liên kết với kháng thể 1 &

2 Rửa để loại kháng thể thừa

Phát hiện màu thông qua phản ứng enzyme

CẮT MẪU CHO LAI “TẠI CHỖ” ( IN SITU

HYBRIDIZATION)

KẾT QUẢ LAI TRÊN NHIỄM SẮC THỂ

LAI “TẠI CHỖ” TRÊN PHÔI

Cố định mẫu (formol, đông lạnh) Ỉ Cắt lát mỏng (microtome) Ỉ Cố định

trên lam kính Ỉ Xử lý mẫu trước khi lai Ỉ Tiền lai Ỉ Lai với mẫu dò

đánh dấu hóa học hay đồng vị phóng xạ Ỉ Rửa Ỉ Phát hiện phân tử lai

Ỉ Quan sát dưới kính hiển vi

NGUYÊN TẮC CỦA MICROARRAY

- Tách mRNA từ tế bào nuôi cấy

- Phiên mã ngược thành cDNA có đánh dấu huỳnh quang khác nhau

- Trộn chung 2 loại cDNA đánh dấu

- Rửa, loại các thành phần thừa

- Đo cường độ phát huỳnh quang ở từng điểm :

Điểm phát màu vàng : gene biểu hiện như nhau trong 2 lọai tế bào

Điểm phát màu xanh : gene của tế bào nuôi trong glucose biểu hiện mạnh hơn Điểm phát màu đỏ : gene của tế bào nuôi trong ethanol biểu hiện mạnh hơn

KẾT QUẢ MICROARRAY

VÍ DỤ : PHÁT HIỆN BỆNH HỒNG CẦU HÌNH LIỀM BẰNG SOUTHERN BLOT

KỸ THUẬT “ĐI BỘ TRÊN NHIỄM SẮC THỂ

(CHROMOSOME WALKING)

KẾT QUẢ RFLP TRONG NGHIÊN CỨU

PHẢ HỆ

CÂU HỎI PHẦN 4

1 Cách đánh dấu mẫu dò bằng đồng vị phóng xạ ? Bằng hóa học ? Ưu nhược điểm của từng loại tác nhân ?

2 Cách đánh dấu mẫu dò có bản chất là DNA, RNA, oligonucleotide

3 Southern blot z Northern blot z dot blot đuợc thực hiện như thế nào ?

4 Cho ví dụ về việc sử dụng reverse dot blot

5 Cách tiến hành Southern blot, Northern blot, dot blot

6 Ứng dụng của Southern blot, Northern blot, dot blot

7 Cách tiến hành và ứng dụng của phương pháp lai tại chỗ

8 Cách phát hiện phân tử lai với mẫu dò đồng vị phóng xạ ? Hóa học ?

9 Cách tiến hành phương pháp sử dụng microarray và ứng dụng của microarray

10 Kỹ thuật đi bộ trên nhiễm sắc thể : cách làm và ứng dụng

TẠO DÒNG

HAI CHIẾN LƯỢC TẠO DÒNG

IN VIVO & IN VITRO

NGUYÊN TẮC TẠO DÒNG ( IN VIVO)

CÁC BƯỚC TẠO DÒNG

Biến nạp vector tái tổhợp vào vi khuẩn

Chọn lọc dòng cần tìm

Xử lý enzyme tạo đầu so

le, đầu bằng

Nối vector/

W PCRvới mồi đặc hiệu

W Sửdụngkhángthể đặc hiệu

CHUẨN BỊ cDNA ĐỂ TẠO

DÒNG

Ỉ gắn thêm các

linker có mang

trình tự nhận biết của RE

Ỉ Cắt bằng RE

tương ứng tạo đầu

so le

XỬ LÝ ĐOẠN GẮN CHÈN CÓ ĐẦU BẰNG

W Gắn thêm các linkers mang trình tự nhận biết của RE

W Vector có chứa các trình tự nhận biết của RE tương ứng

TẠO DÒNG BẰNG

PCR

W Mồi (primer) dùng trong phản ứng PCR có mang trình tự nhận biết của RE

W Sản phẩm PCR được cắt bằng RE phù hợp tạo đầu so le

W Nối với vector đã xử lý với cùng loại RE

TẠO DÒNG TRONG

PLASMID

- Tạo plasmid tái tổ hợp

- Biến nạp tế bào E coli : ủ chung với

plasmid TTH có hiện diện CaCl2 ; tạo sốc nhiệt

- Nuôi trên đĩa thạch có ampicillin để chọn dòng vi khuẩn có thu nhận

plasmid TTH

- Thu nhận các dòng tế bào có chứa plamid TTH

W Plasmid thế hệ thứ nhất

W Plasmid thế hệ thứ hai :

pBR322

W Plasmid thế hệ thứ ba :

pUC, pSP, Bluescript,

PLASMID pUC18/19

TẠO DÒNG TRONG PLASMID pUC

BỘ GENE PHAGE VÀ SỰ TỰ RÁP

TẠO DÒNG VỚI VECTOR LÀ PHAGE

Thu nhận DNA phage

Ỉ Loại bỏ trình tự không

cần cho sự đóng gói

Ỉ Gắn trình tự cần tạo dòng

vào thay cho trình tự loại bỏ

Ỉ Đóng gói vào vỏ bọc của

phage

Ỉ Đem xâm nhiễm tế bào vi

khuẩn để chuyển trình tự cần tạo dòng vào vi khuẩn

TẠO DÒNG cDNA TRONG PHAGE O

Đem dung dịch phage tái tổ hợp trải trên lớp tế bào vi khuẩn phủ đầy mặt thạch Ỉ tạo đĩa

ly giải

TẠO ĐĨA LY GIẢI (PLAQUE ASSAY)

Bề mặt thạch phủ một lớp tế bào E coli Ỉ Thêm huyền phù virus tái tổ

hợp Ỉ Phủ tiếp lên trên một lớp agar mềm Ỉ Ủ Ỉ Mỗi đĩa ly giải tương

ứng với vùng ly giải do một phần tử virus gây ra

PHÁT HIỆN ĐĨA LY GIẢI CÓ CHỨA DÒNG CẦN TÌM

Hộp thạch với các đĩa ly giải

È

Aùp màng lai lên mặt thạch

È

Ủ màng lai trong dung dịch kiềm để

ly giải phage giải phóng DNA phage

TỔNG HỢP M13 MẠCH ĐÔI

COSMID VECTOR PHC79

TẠO DÒNG BẰNG VECTOR COSMID

TẠO NGÂN HÀNG BỘ GENE

TẠO DÒNG VỚI BAC (NHIỄM SẮC THỂ NHÂN TẠO CỦA VI KHUẨN

TẠO DÒNG TRONG VECTOR BIỂU HIỆN

W Vector biểu hiện là vector có

mang các promoter cho phép phiên mã trình tự gắn chèn (insert)

W Sử dụng RNA polymerase phù

hợp với promoter để phiên mã

mạch muốn sử dụng làm khuôn

PHIÊN MÃ & DỊCH MÃ TRÌNH TỰ TẠO DÒNG

TẠO DÒNG BẰNG VECTOR “CON THOI”

Mục tiêu : Nhân bản và chọn lọc trình tự gắn chèn (insert) trong 2 loại tế bào chủ khác nhau

CHỌN DÒNG TÁI TỔ HỢP

Chọn các dòng có mang vector tái tổ hợp dựa trên đặc tính

kháng 2 kháng sinh của vector pBR322

CHỌN DÒNG TÁI TỔ HỢP

Chọn dòng tái

tổ hợp dựa

(xanh/trắng)

LAI TRÊN KHUẨN LẠC CHỌN DÒNG CẦN TÌM BẰNG LAI PHÂN TỬ

-Mẫu dò được suy ra từ trình tự amino acid dựa theo mã di truyền, được tổng hợp và đánh dấu, sau đó đem lai với màng lai có mang cá trình tự DNA đã được cố định

CHỌN DÒNG CẦN TÌM BẰNG KHÁNG THỂ

W Tạo một ngân hàng biểu hiện

W Cảm ứng cho các protein biểu hiện

W Phát hiện dòng cần tìm trong ngân hàng biểu hiện với kháng thể đánh dấu vàđặc hiệu cho protein biểu hiện

CÂU HỎI PHẦN 5

1 Vector dùng để tạo dòng cần có những đặc điểm gì

2 Có những loại vector nào ? Ưu nhược điểm của các loại ấy ? Ứng dụng của chúng ?

3 Đặc điểm của các vector plasmid pUC, pSP, Bluescript

4 Mô tả cách sử dụng vector là phage

5 Vector biểu hiện dùng để làm gì ? Cho ví dụ

6 Vcetor con thoi dùng để làm gì ? Cho ví dụ

7 Mô tả cách tạo ngân hàng bộ gene

8 Mô tả cách tạo ngân hàng cDNA

9 Cách phát hiện dòng cần tìm bằng kháng thể

10.Cách phát hiện dòng cần tìm bằng mẫu dò nucleic acid

11.Cách biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR

1 Primer (mồi)

Mồi phải thỏa một số điều kiện cơ bản : (1) dài khoảng 18-24 base, (2)

Tm của 2 primer gần nhau, (3) [G:G] 40-60%, (4) không hình thành primer dimer, (5) không phải là trình tự lặp lại.

2 DNA bản mẫu (template)

Hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch – không chứa các chất ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, ), heparin, )

3 Nồng độ MgCl2

Cần cho hoạt động của Taq polymerase ; hàm lượng quá cao sẽ tạo nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì làm giảm hiệu quả nhân bản của enzyme

4 dNTP

Thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng ; hàm lượng thường không đổi nhưng có thể thay đổi tùy điều kiện thực tế

5 Enzyme

Được chọn tùy mục đích sử dụng :

W Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) : thông dụng nhất, hoạt tính polymerase khá mạnh (35-100 nu/giây), có hoạt tính 5’3’ exonuclease

Stoffel DNA polymerase : tính chịu nhiệt cao hơn, không có hoạt tính 5’-3’exonuclease, hoạt động được ở phổ MgCl2 rộng € multiplex PCR

Taq và Stoffel DNA polymerase thêm 1 3’dA vào sản phẩm PCR

W Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis) : tính chịu nhiệt rất cao, nhân bản được những đọan DNA rất dài, có hoạt tính 3’-5’

exonuclease € tính trung thực cao hơn Taq pol 5-15 lần, tạo sản phẩm “đầu bằng”

W Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus) : có cả 2 hoạt tính 5’-3’ và3’-5’ exonuclease, tính trung thực cao hơn Taq pol 12 lần, thường dùng trong cycle sequencing

W Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus) : vừa có chức năng

polymerase vừa có chức năng phiên mã ngược (RT) € dùng trong phản ưng RT-PCR

W UlTma DNA polymerase (Thermotoga maritima) : tính chịu nhiệt rất cao, có hoạt tính 3’-5’ exonuclease € tính trung thực rất cao

CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR (tiếp)