công nghệ sản xuất vitamin b12 từ vi khuẩn propionibacterium shermanii

Công nghệ sản xuất vitamin theo phương pháp sinh học chỉ tập trung vào một số vitamin đặc bao gồm vitamin B12, vitamin B2, hỗn hợp vitamin D2 và các vitamin nhóm B khác.. Cyanocobalamin,

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

Tiểu luận:

TỪ VI KHUẨN Propionibacterium shermanii

Nguyễn Thụy Hai MSHV : 12310729 Thi Phối Phối MSHV : 12310746

TPHCM 04 - 2013

GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng 1

Lời mở đầu

Vitamin B12 là một loại vitamin rất cần thiết cho cơ thể con người Trong cơ thể, nó tồn tại dưới dạng bốn dẫn xuất mà người ta gọi là cobalamin và hoạt động như các yếu tố enzyme Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng của viatmin B12 trong việc chữa trị bệnh thiếu máu ác tính và các bệnh về viêm dây thần kinh Vitamin B12 chỉ có nhiều trong các thực phẩm đi từ nguyên liệu động vật, thực vật chứa rất ít vitamin B12 Vì thế nhu cầu tổng hợp viatmin B12 trên quy mô công nghiệp là thiết yếu, để bổ sung vitamin B12 cho những người ăn chay trường và chữa các loại bệnh do thiếu vitamin B12 Trong công nghiệp, vitamin B12 hoàn toàn được tổng hợp bởi các vi sinh vật

GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng 2

PHẦN I: TỒNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung

Vitamin là phân tử hữu cơ cần thiết ở lượng rất nhỏ cho hoạt động chuyển hoá bình thường của cơ thể sinh vật Có nhiều loại vitamin và chúng khác nhau về bản chất hoá học lẫn tác dụng sinh lý Vitamin thúc đẩy các qúa trình trao đổi chất và là thành phần không thể thiếu được trong cấu tạo của nhiều loại enzym

Do đó việc nghiên cứu, sản xuất vitamin trở nên rất cần thiết Vitamin được sử dụng chủ yếu ở ba lĩnh vực:

- Y học

- Thực phẩm cho người

- Thức ăn cho gia súc

Các nhà khoa học đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau trong công nghệ sản xuất vitamin Bao gồm các phương pháp sau:

- Chiết rút từ nguồn nguyên liệu thực vật v| động vật

- Tổng hợp hóa học

- Tổng hợp sinh học

Cả ba phương pháp đều có những ưu và nhược điểm riêng, với mỗi phương pháp cho ra những vitamin riêng Do đó để sản xuất vitamin từ các nguồn nguyên liệu và phương pháp khác nhau, người ta thường nhắm vào hiệu quả của phương pháp, trong đó giá thành đóng vai trò quan trọng cho việc quyết định phương pháp sản xuất

Công nghệ sản xuất vitamin theo phương pháp sinh học chỉ tập trung vào một

số vitamin đặc bao gồm vitamin B12, vitamin B2, hỗn hợp vitamin D2 và các vitamin nhóm B khác

1.2 Vitamin B 12

1.2.1 Giới thiệu chung

Thuật ngữ vitamin B12 rất rộng, dùng để chỉ những hợp chất có chứa cobalamin vì trong phân tử của nó có chứa kim loại Coban Tại hội nghị quốc

GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng 3

tế về hóa sinh năm 1961, các nhà bác học đã đề nghị gọi tên nhóm vitamin B12

là corinoit Hiện nay người ta biết khoảng 100 loại chất tương tự vitamin B12 trong số đó có các chất quan trọng thường gặp như cyancobalamin (B12), hydroxycobalamin (B12a), nitritocobalamin Hợp chất corinoit bị loại mất coban được gọi là corin, còn acid corinic là corin có cả các nhánh bên Dạng tự nhiên của những hợp chất cobalamin là adenosylcobalamin, methylcobalamin và hydroxocobalamin

Cyanocobalamin, được định nghĩa là vitamin B12, là một hợp chất cobalamin bền vững, được sản xuất ở quy mô công nghiệp nhưng không tìm thấy trong tự nhiên Vitamin B12 là một vitamin quan trọng để chữa bệnh thiếu máu nguy hiểm và bệnh viêm dây thần kinh ngoại biên, đồng thời nó cũng là một vitamin quan trọng cần bổ sung trong khẩu phần ăn động vật và cả con người

Bởi vì tổng hợp vitamin B12 bằng phương pháp hóa học khó khăn và tốn kém nên người ta thường sản xuất vitamin B12 đại trà bằng phương pháp lên men vi sinh vật gián đoạn hoặc kết hợp gián đoạn và liên tục

1.2.2 Cấu tạo hóa học và tính chất của vitamin B 12

- Tên quốc tế: cyanocobalamin và hydroxo-cobanamin

- Công thức hóa học: C63H90N14O14PCo

- Cấu trúc hóa học của vitamin B12 bao gồm 2 phần:

+ Phần cobamid gồm 4 nhân pyrol đã hydrogen hóa, giữa nhân là nguyên tử coban hóa trị 3; các nhân này đã bị thế bởi nhóm methyl, acetamid

GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng 4

bền khi bảo quản và là chế phẩm dược dụng là cyanocobalamin có công thức cấu tạo như trên và hydroxocobalamin khi thay CN bằng nhóm OH

Hình 1: Cấu trúc phân tử vitamin

- Vitamin B12 thường ở dạng kết tinh, có kích thước rất nhỏ, màu đỏ sẫm, không có mùi và vị

- Tan trong nước, trong các dung dịch trung tính, cồn; không tan trong eter, acetol, benzen, clorofoc

- Chúng bền nhiệt khi ở dạng cyamit, nhưng khi tiếp xúc với kim loại nặng thì rất dễ mất hoạt tính, vitamin B12 không bền trong môi trường

1.3 Sản xuất vitamin B 12 trên quy mô công nghiệp

Khi vitamin B12 được sản xuất theo quy mô công nghiệp thì ta phải quan tâm, kiểm soát đến các yếu tố như giống vi sinh vật, cơ chất sử dụng, quá trình

GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng 5

phản ứng và quá trình thu nhận, tinh chế sản phẩm Bản chất của quá trình sản xuất theo quy mô công nghiệp là sản phẩm của quá trình có định hướng rõ ràng, qui trình sản xuất được kiểm soát từ khâu sản xuất giống đến quá trình lên men và cuối cùng là quá trình thu nhận sản phẩm

Như vậy quá trình lên men công nghiệp thực chất là thực hiện và kiểm soát những công việc sau:

 Tạo giống và nâng cao chất lượng giống

 Tính toán, thiết kế, chế tạo các thết bị lên men phù hợp với công nghiệp và sản phẩm

 Thực hiện các kĩ thuật trong lên men

 Tách, thu nhận và tinh chế sản phẩm

Ta cần phải giải quyết hai vấn đề sau:

a) Kỹ thuật lên men: nghiên cứu điều kiện tối ƣu trong quá trình lên men như thiết bị, công nghệ…nhằm đạt được hiệu suất cao cho các sản phẩm mong muốn

b) Kỹ thuật thu hồi sản phẩm sau lên men và chế biến thành các dạng thương phẩm, nghiên cứu các điều kiện trích ly, tinh chế nhằm thu được các chất có hoạt tính sinh học dạng tinh khiết Nhiều kỹ thuật trong công nghiệp hóa học như: lọc, kết tủa, ly tâm, kết tinh, hấp phụ, chưng cất, sấy… đều được sử dụng ở đây Điều kiện khác nhau cần lưu ý tới là các chất có hoạt tính sinh học thường không bền vững với các điều kiện nhiệt độ, pH và các yếu tố vật lý khác

Điều kiện và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật có ảnh hưởng đến sự hình thành thành phần và tính chất của chất lỏng canh trường Các chế độ sinh tổng hợp cần hướng tới kết quả thu nhận môi trường có chất nền và những tạp chất khác còn lại là tồi thiểu và có nồng độ các sản phẩm mong muốn là cực đại

GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng 6

PHẦN II: NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT

Sản xuất vitamin B12 trong công nghiệp đi từ nguyên liệu vi sinh vật và

rỉ đường hay hèm rượu, dịch whey

2.1 Vi sinh vật

2.1.1 Yêu cầu về nguyên liệu

Trong công nghệ lên men, giống vi sinh vật đóng vai trò hết sức quan trọng, ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng và giá thành của sản phẩm Như vậy, giống vi sinh vật sử dụng trong công nghệ lên men vitamin B12 phải thỏa mãn những yêu cầu sau:

 Giống vi sinh vật đó phải cho ra vitamin B12 có chất lượng và số lượng cao hơn hẳn các sản phẩm phụ khác

 Năng suất cao

 Phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm

 Sản phẩm của quá trình phải dễ dàng tách ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối vi sinh vật giống

 Vi sinh vật phải thuần khiết

 Vi sinh vật phải có tính thích nghi cao, đặc biệt phải thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp, sự ổn định nhiệt độ, áp suất thẩm thấu, pH

 Giống phải có tốc độ sinh sản và phát triển mạnh trong điều kiện môi trường công nghiệp

 Tốc độ trao đổi chất mạnh để nhanh tạo ra sản phẩm mong muốn

 Giống phải ổn định trong bảo quản và điều kiện bảo quản dễ dàng

2.1.2 Vi sinh vật sản xuất vitamin B 12

Có rất nhiều vi sinh vật có thể tham gia quá trình sinh tổng hợp vitamin

B12 Một số quy trình sản xuất vitamin được biết đến là quy trình sản xuất

vitamin từ vi khuẩn Propionicbacterium, từ xạ khuẩn Actinomyces olivacens,

và vi khuẩn sinh khí metan

GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng 7

Một số vi khuẩn có khả năng sản xuất vitamin: Agrobacterium

tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Bacillus megaterium, Clostridium

Corynebacterium XG, Eubacterium limosum, Methanobacterium arbophilicum,

Protaminobacter ruber, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas putida, Rhizobium meliloti, Rhodopseudomonas sphaeroides, Salmonella typhimurium, Spirulina platensis, Streptomyces antibioticus, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces griseus, Streptomyces olivaceus , ngoài ra còn có các giống

thuộc xạ khuẩn Actinomyces

Trước đây người ta thường sử dụng chủ yếu chủng Streptomyces griseus

để sản xuất trên quy mô công nghiệp nhưng ngày nay người ta chuyển sang sử

dụng vi khuẩn Propionibacterium shermanii và Pseudomonas denitrificans thay thế cho vi khuẩn Streptomyces Nguyên nhân là vitamin B12 là sản phẩm

phụ của sản phẩm Streptomicin lên men bởi Streptomyces griseus hay là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất Clotetracyclin lên men bởi Streptomyces

aureofaciens.Lượng vitamin được tạo ra trong các quá trình trên là rất thấp

(2mg/lít) nên rất khó chiết tách

Việc sản xuất bằng Propionibacterium shermanii hay P freudenreichii

cho hiệu suất vitamin cao hơn Tế bào của các vi khuẩn này chứa một lượng vitamin khoảng 20 mg/l

2.1.3 Vi khuẩn Propionibacterium

- Trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, không di động Kích thước nhỏ

- Trong tự nhiên chúng xếp thành từng đôi hoặc từng chuỗi ngắn

- Hiếu khí tùy ý

Phân loại: vi khuẩn Propionibacterium được phân loại thành 2 nhóm:

- Nhóm vi khuẩn Propionibacterium sống trong sản phẩm sữa Chúng

phát triển trong môi trường phômai và sữa Trên cơ sở tính tương đồng

GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng 8

của DNA trong thành phần cấu tạo của thành tế bào, nhóm vi khuẩn

Propionibacterium sống trong sản phẩm sữa được phân loại thành 6

loài: Propionibacterium freudenreichii, P jensenii, P.theonii, P.acidipropionici, P.coccoides và P.cyclohexanicum

- Nhóm vi khuẩn propionic sống trên da Môi trường sống chính của

giống Propionibacterium sống trên da là da người.Nhóm vi khuẩn sống trên da được phân loại thành 6 loài: P.acnes, P.avidium, P.granulosum,

P.lymphophilums, P.propionicum và Propioniferax innocua Nhóm vi

khuẩn sống trên da có dạng que, kị khí

- Trái ngược với vi khuẩn propionibacteria sống trên da, nhóm vi khuẩn Propionibacteria sống trong sản phẩm sữa không sản sinh indole và không thể hóa lỏng gelatin Hơn thế nữa, hai nhóm này có thể được phân biệt rõ dựa vào các đặc điểm sinh lý học của nó Do đó, hai nhóm

vi khuẩn Propionibacterium này khác nhau chủ yếu dựa trên môi trường sống tự nhiên của chúng

2.1.4 Đặc điểm của vi khuẩn Propionibacterium shermanii

Trong các chủng giống vi sinh vật tham gia tổng hợp vitamin B12 thì có

giống Propionibacterium shermanii có nhiều ưu điểm nhất để đưa vào sản xuất

qui mô công nghiệp Vi khuẩn này có một số đặc điểm như sau:

- Lên men acid lactic, glycerol, glucose, fructo, manit, lactose

- pH hoạt động 4.5 – 7.5 pH tối ưu cho tổng hợp vitamin B12 là 5.8 – 7.5

- Nhiệt độ thích hợp cho sản xuất vitamin B12 là 28 – 300C

- Các chất dinh dưỡng cần cho sự phát triển bao gồm: muối amon, amoniac, CoCl2 hoặc Co(NO3)2; các kim loại: Cu, Fe, Zn, Mn thường làm giảm quá trình tổng hợp B12.

- Các vitamin làm tăng hiệu suất tổng hợp vitamin B12 bao gồm: tiamin, biotin, acid nicotinic, acid tolic

o Trong những hợp chất hữu cơ gồm có hợp chất có chứa nitơ và không chứa nitơ ở dạng amin như: acid aspactic, acid glutamic, leucin, isoleucin Nitơ tổng chiếm khỏang 0,3 – 0,5% (ít hơn so với lượng nitơ có trong rỉ đường củ cải)

o Ngoài ra trong rỉ đường có một số vitamin sau:

Bảng 1 Thành phần các vitamin trong rỉ đường (tính theo µg/1g rỉ đường)

GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng 10

Mặt khác, trong rỉ đường luôn có mặt vi sinh vật với mật độ rất lớn, thường gặp nhất là những vi sinh vật gây màng và gây chua, dẫn tới làm giảm chất lượng của rỉ đường Vì vậy trong sản xuất ta hay dùng fluosilicate natri

20/000 so với trọng lượng mật rỉ để bảo quản

Ưu điểm của việc sử dụng rỉ đường để sản xuất so với những nguyên liệu khác là:

 Giá rẻ

 Khối lượng lớn, dồi dào

Sử dụng tiện lợi

Nguồn cung cấp khá phổ biến

Đặc biệt ở nước ta, không phạm đến chính sách lương thực

GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng 11

2.4 Dịch Whey

Sự phát triển của sinh vật và sản phẩm vitamin B12 từ dịch Whey dường như khác với mô hình sản xuất đối với các loại cấu trúc khác Sinh vật gần như phát triển tối đa trước khi vitamin B12 được tích lũy

Trong dịch Whey, lactose có thể làm nguồn cacbon cho vi sinh vật sử dụng để phát triển Trong dịch Whey và men chiết có đầy đủ các chất dinh dưỡng cho sự phát triền và hình thành vitamin B12 từ vi sinh vật

Trên phương diện đó, với nhược điểm của dịch Whey nên việc sử dụng

để sản xuất vitamin B12 thì nhỏ và rải rác, riêng lẻ, không đủ cung cấp cho quá trình sản xuất có lợi của vitamin B12

Việc sản xuất vitamin B12 từ dịch Whey chỉ có ý nghĩa trên quy mô công nghiệp khi việc chuyên chở dịch Whey thực hiện gần nơi sản xuất và lượng Whey tương đối nhiều để có thể kết hợp và sản xuất Chi phí vận chuyển tăng

vì lượng dịch Whey thô chứa khoảng 93,1% là nước Chi phí chuyên chở có thể giảm khi cô đặc dịch thô thành dạng rắn trước khi chuyên chở Một lý do khác

là dịch Whey có thể sản xuất nếu như giá trị sản phẩm của nó tăng bởi quá trình lên men như quá trình lên men vitamin B12 Ngay cả khi quá trình chỉ thải ra lượng thừa dịch Whey mà không tăng giá sản phẩm sữa, nó sẽ có giá trị vì giúp giải quyết vấn đề chất thải trong quá trình sản xuất phô mai

Bảng 3 Thành phần whey protein

Cách thực hiện: giống Propionibacterium shermanii được cấy trong môi

trường thạch nghiêng với glucose, KH2PO4, (NH4)2PO4, cao ngô hoặc nước chiết trái cây Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ t0 = 28 – 320C trong 7 – 8 ngày Sau đó bảo quản lạnh, cấy truyền mỗi tháng 1 lần

Nhân giống cho sản xuất thường được thực hiện trong điều kiện kị khí Môi trường nhân giống cho lượng đường ít hơn môi trường lên men, các thành phần khác thì giống môi trường lên men

hoặc Co(NO3)2

Vi khuẩn Propionibacterium shermanii sử dụng cơ chất trong môi trường

để tăng sinh khối Hàm lượng cơ chất trong môi trường giảm theo thời gian, sinh khối tăng dần

Bảng 4: Môi trường nhân giống

Thời gian tiệt trùng 30 phút

Thiết bị nhân giống: thiết bị nhân giống có dạng hình trụ bằng thép không rỉ, bên trong có cánh khuấy Xung quanh thiết bị là lớp vỏ áo điều nhiệt

để ổn định nhiệt độ xung quanh trong quá trình nhân giống

GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng 14

Phía trên nắp thiết bị có các cửa với nhiều chức năng khác nhau:

+ cửa thông cánh khuấy gắn với motor

Thành phần môi trường lên men bao gồm: Nguồn carbon, nguồn nitơ, yếu

tố tăng trưởng, muối dinh dưỡng, coban, glycine và sodium cyanide

- Nguồn carbon là carbohydrate (dextrose, maltosse, xylose, syrup bắp, sucrose, mật rỉ), acid hữu cơ là acid lactic Chiếm 0.5 – 10% khối lượng môi trường nuôi cấy

- Nguồn Nitơ là các protein trong đậu nành, yến mạch, bắp, bột mì, dịch chiết nấm men, nước Whey … Khối lượng chiếm 1 – 5% khối lượng môi trường nuôi cấy