Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzym

Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzym

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

LÊ KIM THANH

ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ

LÊN HOẠT TÍNH XÚC TÁC CỦA ENZYME BROMELAIN TRONG QUẢ DỨA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ

Luận văn đính kèm theo đây, với tựa đề tài :” Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain trong quả dứa” do Lê Kim Thanh thực

hiện và báo cáo, đã được hội đồng chấm luận văn thông qua

Cần Thơ, ngày …tháng…năm 2007

Chủ tịch hội đồng

Nguyễn Văn Mười

LỜI CẢM TẠ

Em xin chân thành gửi lời cảm tạ và biết ơn sâu sắc đến:

Cô Trần Thanh Trúc đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận

lợi nhất cho em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp;

Và cô Nguyễn Thị Thu Thủy đã nhiệt tình truyền thụ những kiến

thức quý báu, tạo cơ sở khoa học vững chắc cho em trong quá

trình thực hiện đề tài;

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô phòng thí nghiệm Công Nghệ

Enzyme, Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã

nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề

tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô bộ môn Công nghệ Thực

Phẩm đã tận tình giảng dạy và truyền thụ những tri thức quý báu cho

chúng em trong suốt thời gian học tập

Em xin cảm ơn thầy cố vấn Nhan Minh Trí và tập thể các bạn lớp

Công Nghệ Thực Phẩm khóa 28 đã động viên và giúp đỡ em trong

suốt khóa học vừa qua

Cần Thơ, ngày 15 tháng 6 năm 2007

Sinh viên thực hiện

Lê Kim Thanh

đáng được quan tâm là hệ enzyme trong quả dứa mà tiêu biểu là hệ enzyme

protease_bromelain quả Đề tại này được đặt ra với mục đích là tìm ra quy luật hoạt

động của hệ enzyme bromelain quả từ dịch chiết quả dứa ở các điều kiện xử lý

pH = 4,6 – 9,5 và nhiệt độ từ 10 – 75 0 C

Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ quả dứa được sử dụng cho nghiên cứu enzyme bromelain tốt nhất từ ngày bảo quản thứ tư trở đi; và bảo quản dịch chiết chứa enzyme tốt nhất là ở điều kiện lạnh đông

Đồng thời, có sự tương tác giữa pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của hệ enzyme

bromelain quả trong dịch chiết Hệ enzyme này thể hiện hoạt tính tối thích trong khoảng nhiệt độ từ 10 – 20 0 C ở môi trường pH thấp, 30 – 40 0 C ở môi trường pH kiềm (pH = 7,5 – 9,5) và 40 – 60 0 C ở môi trường pH trung tính (pH = 6,8 -7,1)

MỤC LỤC

TÓM TẮT trang i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH HÌNH iv

DANH SÁCH BẢNG iv

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 TỔNG QUAN 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DỨA 2

2.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME TRONG DỨA 3

2.2.1 Sơ lược về hệ enzyme trong cây dứa 3

2.2.2 Sơ lược về enzyme bromelain 4

2.2.3 Cấu tạo và hoạt tính chung của enzyme bromelain 5

i Cấu tạo 5

ii Hoạt tính enzyme bromelain 6

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain 7

i Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ 7

ii Ảnh hưởng của nhân tố pH 8

2.3 GIỚI THIỆU VỀ PHẢN ỨNG ENZYME 9

2.3.1 Động hóa học của phản ứng cơ bản 9

2.3.2 Động học phản ứng enzyme 10

2.4 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CASEIN 11

2.5 SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME BROMELAIN 12

2.6 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 15

3.1.1 Nguyên liệu 15

3.1.2 Hóa chất thí nghiệm 15

3.1.3 Thiết bị thí nghiệm 15

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu và hóa chất nghiên cứu 16

3.2.2 Bố trí thí nghiệm 17

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 20

4.1 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản dịch chiết từ dứa chứa bromelain quả đến đặc tính enzyme 20

4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả trên cơ chất là casein 22

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 26

5.1 Kết luận 26

5.2 Đề nghị 26

TÀI LIỆU THAM KHẢO 27

PHỤ LỤC v

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Các giống dứa ăn quả phổ biến 2

Hình 2: Quả dứa (Ananase Comosus) 3

Hình 3: Cách sắp xếp các amino acid trong phân tử bromelain 6

Hình 4: Cấu trúc phân tử proteases cysteine 6

Hình 5: Hình vẽ minh họa sự tác động của pHmôi trường lên hoạt tính enzyme 8

Hình 6: Sơ đồ quy trình trích ly bromelain quả (thô) 16

Hình 7: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch casein 1% 16

Hình 8: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch quả theo thời gian bảo quản 21

Hình 9: Mẫu dung dịch chiết chứa enzyme bromelain quả sau 12 ngày bảo quản 22

Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch quả dứa 23

Hình 11: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính của bromelain quả khi xử lý ở các nhiệt độ khác nhau 24

Hình 12: Đồ thị biểu diễn hoạt tính của bromelain quả khi xử lý ở các nhiệt độ khác nhau ở pH thấp 25

Hình 13 Đường chuẩn tyrosine vii

DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein 12

Bảng 2: Kết quả theo dõi hoạt tính của enzyme bromelain trong dung dịch dứa tươi theo thời gian bảo quản 20

Bảng 3: Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ môi trường xử lý lên hoạt tính của enzyme bromelain quả xii

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Khoảng 20 năm gần đây, với hơn 400 đề tài nghiên cứu, giới khoa học Châu Âu đã đưa

ra một khuyến cáo rằng “với một quả dứa mỗi ngày, bạn sẽ không cần gặp bác sĩ”

(Harvey and Ross, 1985) Câu nói trên đã được khoa học thực tiễn xác minh là phù hợp với dược tính đặc biệt của quả dứa Qua nhiều nghiên cứu cho thấy quả dứa loài

Ananas có khả năng dược lý cao là do trong thành phần của quả có hệ enzyme bromelain, hay còn gọi là enzyme dứa

Bromelain là tên gọi chung của một nhóm enzyme thực vật, được tìm thấy từ những

cây dứa loài Ananas, họ Bromeliaceae Enzyme này đã mang đến cho giống dứa

Ananas sự nổi tiếng về khả năng dược lý trong việc chữa trị các bệnh về đường tiêu hóa

và giảm đau, giảm sưng do viêm nhiễm

Về mặt thực phẩm, dứa là một loại cây ăn quả có nhiều giá trị dinh dưỡng và rất được

ưa chuộng Về mặt khoa học, dứa là một nguồn thực vật chứa loại enzyme đặc biệt có dược tính cao Trong chế biến thực phẩm từ quả dứa, vấn đề đặt ra là cần quan tâm đến

sự biến đổi về thành phần, giá trị dinh dưỡng và hệ enzyme trong quả dứa Với vai trò không kém phần quan trọng, hệ enzyme trong quả dứa cũng cần được quan tâm đúng mức Tuy nhiên, để biết được sự biến đổi về hoạt tính của hệ enzyme bromelain quả, cần phải biết quy luật chung về hoạt tính xúc tác của chúng

Giống như các enzyme khác, hoạt tính xúc tác của enzyme “bromelain quả” cũng chịu ảnh hưởng bởi nhiều nhân tố, trong đó nhân tố pH và nhiệt độ, là hai nhân tố được quan tâm nhiều nhất trong quá trình chế biến thực phẩm từ quả dứa Từ vấn đề đặt ra trên, việc nghiên cứu khảo sát các ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của hệ enzyme bromelain trong quả dứa là cần thiết, nhằm tạo tiền đề và cơ sở cho việc nghiên cứu lâu dài về hệ enzyme này

Khảo sát tác động của việc xử lý pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain quả trên cùng một loại cơ chất Trên cơ sở đó, tìm hiểu được quy luật biến thiên về hoạt tính của hệ enzyme này theo sự thay đổi của pH và nhiệt độ chế biến nhằm phục vụ cho công nghệ chế biến các sản phẩm từ dứa

Ruộng dứa Dứa Queen

Dứa là loại cây ăn quả nhiệt đới có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được đưa tới các đảo khu

vực Caribe nhờ những thổ dân Anhdieng Carib Năm 1493, Christopher Columbus lần

đầu tiên đã nhìn thấy các loại cây của chi này tại Guadeloupe Ông đã đem chúng về Châu Âu và từ đây chúng được người Anh và Tây Ban Nha phát tán tới các đảo trên Thái Bình Dương (Morrison, 1963) Năm 1813, các cánh đồng trồng dứa thương phẩm được thành lập tại Hawaii, Philippines, Đông Nam Á, Florida và Cuba Dứa đã trở thành một trong 3 loại cây ăn quả phổ biến nhất trên thế giới, sau chuối và các loại quả

họ citrus (Anon, 1993)

Dứa có tên khoa học là Ananas comosus Thuộc loài Ananas, họ Bromeliaceae Một số

giống dứa trồng phổ biến nhất hiện nay là giống Queen và Cayenne, tên khoa học là

Ananas comosus (Linnaeus) merril (Brasil) Ngoài ra, còn có một số giống dứa ăn quả phổ biến khác như Ananas sativus, Ananas bracteatur (Lindley) (Nam Mỹ) (Collin et

al., 1931)

Hình 1: Các giống dứa ăn quả phổ biến

Hiện nay, trên thế giới cây dứa được trồng ở hầu hết các nước nhiệt đới như Philippines, Thái Lan, Malaysia, Brazil, Mexico, Cuba, Nam Phi và một số nước cận nhiệt đới như đảo Hawaii, Đài Loan

Ở nước ta, dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước hiện khoảng 40.000 ha với sản lượng khoảng 500.000 tấn trong đó 90% là phía Nam Các tỉnh trồng dứa nhiều

ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau, Cần Thơ, Long An… miền Bắc có Thanh Hóa, Ninh Bình, Tuyên Giang, Phú Thọ….miền Trung có Nghệ An, Quảng

Dứa Cayenne

Nam, Bình Định,… Năng suất quả bình quân một năm ở các tỉnh phía Bắc khoảng 10 tấn, phía Nam 15 tấn/ha

Dứa là một loại quả nhiệt đới có giá trị dinh dưỡng và giá trị năng lượng cao Dứa được

sử dụng trong chế biến thực phẩm và rất được ưa chuộng Thành phần hóa học của quả dứa bao gồm nước (81 – 87%), sacharose (4,59 – 12%), glucose, fructose, vitamine nhóm B, vitamine C và các khoáng chất Fe, Na, K, P, Mg

Ngoài ra trong quả dứa còn có một hệ các acid hữu cơ đa dạng, tạo nên vị chua, thơm hấp dẫn cho quả như acid citric (28 – 66% tổng lượng acid trong quả) (Gortner, 1963), acid ascorbic (từ 200 – 710 mg/l) (Singleton, 1955), acid malic (18 – 30% tổng lượng

acid trong quả (Chan et al.,1973), acid oxalic, acid formic Hàm lượng acid trong quả

thay đổi theo độ chín của dứa và chúng được phản ánh bởi thông số pH Khi trái chín chuyển sang màu vàng, độ pH giảm xuống từ 3,9 – 3,7 (Teisson và Pineau, 1982)

2.2.1 Sơ lược về hệ enzyme trong cây dứa

Trong dịch chiết từ thân cây dứa và quả dứa có một hệ enzyme khá đa dạng và phức tạp, chúng thay đổi trong suốt quá trình phát triển của cây và quả dứa Giống như ở các loại thực vật khác, hệ enzyme trong cây dứa cũng bao gồm nhiều nhóm enzyme với các đặc tính khác nhau, trong đó, nhóm enzyme protease chiếm đa số Protease trong dứa gồm có cysteine protease, đây là nhóm enzyme chính với đại diện là enzyme bromelain; ngoài ra còn có một lượng ít các enzyme peroxidase, amylase, cellulase, acid phosphatase

(Nguồn: http://www.greatvistachemicals.com/biochemicals/bromelain.html, truy cập ngày:

13/11/2006)

- Enzyme peroxidase, tồn tại và có hoạt tính không đổi trong suốt quá trình phát triển của quả Tuy nhiên, trong quả chín lượng enzyme này giảm dần, chỉ còn khoảng 1/3 so với ban đầu (Gortner và Singleton, 1965)

- Cysteine protease là nhóm enzyme proteolytic chủ yếu nhất được tìm thấy trong dịch thân và quả dứa Protease trong quả xuất hiện từ lúc bắt đầu ra hoa, tăng dần

về số lượng trong suốt thời kỳ phát triển của quả Ở giai đoạn quả chín, lượng

enzyme này cũng có xu hướng giảm dần (Gortner và Singleton, 1965; Lodh et al.,

comosain Trong dịch quả dứa, cysteine protease chủ yếu là bromelain quả

- Từ một số nghiên cứu khác, các nhà khoa học còn tìm thấy trong dịch từ thân và

quả của một loại dứa Bromelia pinguin (cùng họ Bromeliaceae) cũng chứa

enzyme protease tên là pinguinain (EC.3.4.99.18) Loại này chỉ có một số đặc

tính đặc biệt và hoạt tính hydrolase kém hơn so với bromelain (Toro-Goyco et al.,

1968)

- Từ quả xanh của giống Bromelia Hieronymi Mez, họ Bromeliaceae, các nhà khoa

học đã tìm thấy được một loại peptidase mới tên là Hieronymain I Loại enzyme

này cũng đã được xác lập vào nhóm cysteine protease (Bruno M.A.; Pardo M.F.; Caffini N.O.; López L.M.I, 2003)

Trong quá trình phát triển của cây và trái dứa, dịch chiết thân và trái còn chứa một số các enzyme dehydrogenase, synthase, pectin methyl esterase, pectin galactoronase nhưng với số lượng rất thấp

2.2.2 Sơ lược về enzyme bromelain (bromeline)

Enzyme bromelain lần đầu tiên được biết đến vào khoảng thế kỷ XIX Năm 1892, nhà khoa học Chittenden là người đầu tiên đã tìm thấy sự hiện diện của một loại enzyme có

khả năng thủy phân protein trong dịch của cây và trái dứa, Ananas Comosus

(pineapple) Ông đã gọi nó là “bromeline” Sau này, thuật ngữ “bromeline” hay

“bromelain” đã được dùng để gọi chung các enzyme thủy phân protein (protease), được

tìm thấy từ những cây giống cây dứa thuộc cùng họ Bromeliaceae

(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/bromelain, truy cập ngày: 15/12/2006)

Bromelain hiện diện ở tất cả các phần của cây dứa, loài

Ananas Chúng chiếm trên 50% protein trong thân dứa và

quả dứa Do đó enzyme bromelain còn được gọi là

“enzyme dứa” Tùy theo nguồn gốc, bromelain được phân

làm 2 loại là bromelain thân (trích từ dịch thân dứa) và

bromelain quả (trích từ dịch quả dứa)

Trong công nghiệp, phần thân cây dứa được dùng làm

nguyên liệu chính để sản xuất ra enzyme bromelain thương

mại, vì đây là nguồn nguyên liệu dồi dào đặc biệt là sau

mùa thu hoạch trái

Enzyme bromelain quả (EC 3.4.22.33)

- Tên gọi khác: bromelain quả, juice bromelain, bromelase, bromelain quả FA2

Hình 2: Quả dứa

(Ananase Comosus)

- Hoạt tính: là một endopeptidase, xúc tác phản ứng thủy phân protein tại vị trí bất

kỳ trên mạch polypeptide

- Cơ chất: thủy phân cơ chất tự nhiên lẫn tổng hợp tương tự như bromelain thân.Tuy nhiên, bromelain quả hoạt động thủy phân tốt nhất trên cơ chất tổng hợp Bz-Phe-Val-Arg+NHMec, không phản ứng với cơ chất Z-Arg-Arg-NHMec như bromelain thân

(Nguồn:http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/enzymes/ec3/ec04/ec22/ec0033/index.html, truy cập ngày: 13/11/2006)

Bromelain quả là một protease acid, có phân tử lượng khoảng từ 23 đến 31 kDa tùy thuộc vào kỹ thuật phân tích của phòng thí nghiệm Bromelain quả có điểm đẳng điện

pI = 4,6 khác biệt cơ bản với bromelain thân với pI = 9,6 (Yamada et al., 1976; Ota et

al., 1985)

2.2.3 Cấu tạo và hoạt tính của enzyme bromelain

i Cấu tạo

- Mã số enzyme

 Bromelain thân: E.C.3.4.22.32

 Bromelain quả : E.C.3.4.22.33

(Nguồn: http://www.brenda.uni-koeln.de/information/all_enzymes.php4?ecno=3.4.22.33, truy cập ngày: 21/12/2006)

- Tên gọi khác: bromelin, bromeline, bromelain

- Tên khoa học và y học : sulfuhydryl proteolytic enzyme, cysteine protease

- Tên thương mại : Bromanase (Kramer – Novis), Bromelain 2400 Maximum Strength (Vitalize Corp)

Bromelain là một thuật ngữ dùng chung để chỉ các enzyme được tìm thấy trong dịch chiết từ cây dứa, chủ yếu là các protease cysteine

Enzyme bromelain là một protease-thiol Trong trung tâm hoạt động của bromelain có

chứa cysteine Đây là một amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh là – SH

(sulfuhydryl) Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp và trong mỗi phân

tử có tất cả 5 cầu nối disulfite

Bromelain ở thân và quả dứa có thành phần acid amine thay đổi khác nhau Bromelain thân có khoảng 321 – 144 acid amin, còn bromelain quả thì có khoảng 283 – 161 acid amin Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amin là valine và ở

đầu carbonyl là glycine Bromelain quả có amino acid ở đầu amin là alanine

Khi phân tích cấu trúc bậc một của bromelain, Murachi và Busan nhận thấy cách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau

Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp –

- Gly – Cys – Lys –

Hình 3: Cách sắp xếp các amino acid trong phân tử bromelain

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

ii Hoạt tính enzyme bromelain

Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase,

amydase và esterase Bromelain xúc tác phản ứng thủy

phân trên nhiều cơ chất và có thể thủy phân cả cơ chất tự

nhiên lẫn cơ chất tổng hợp như hemoglobin, casein, gelatin,

BAA _ Benzoyl-L-Arginine amide, BAEE

_Benzoyl-L-Arginine Ethyl Esther, BAEM _ Benzoyl-L-_Benzoyl-L-Arginine

Methyl Esther…(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Nhóm sulfuhydryl trong phân tử của enzyme đóng vai trò

rất quan trọng trong các phản ứng của enzyme, là thành

phần trực tiếp tham gia các phản ứng xúc tác Chúng có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức chất enzyme – cơ chất Chúng tham gia vào nhiều biến đổi hóa học như

sự ion hóa, acyl hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa, alkyl hóa, tạo thành các mercaptide, serine mercaptal, liên kết hydrogen và những phức hợp chuyển điện tích (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Giống như papain, bromelain đóng vai trò là một endopeptidase, có khả năng tham gia

xúc tác, đẩy mạnh phản ứng thủy phân protein thành các oligopeptide và các amino acid

- Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain trong thân dứa cao hơn bromelain trong quả xanh và quả chín

R ( H2N – CH – CO - )k

Hình 4: Cấu trúc phân tử proteases cysteine

- Đối với cơ chất tổng hợp như BAA, ở 50C và pH = 6,0 thì hoạt tính phân giải của bromelain trong quả xanh cao hơn bromelain trong thân và quả chín (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Hoạt tính của bromelain có thể được xác định theo các đơn vị: đơn vị Rorer, đơn vị BTU (đơn vị bromelain tyrosine), đơn vị CDU (đơn vị thủy phân casein), đơn vị GDU (đơn vị thủy phân gelatin), đơn vị MCU (đơn vị đông tụ sữa)…

Thông thường người ta đánh giá hoạt tính của enzyme bromelain dựa trên đơn vị MCU hoặc GDU 1 GDU tương đương với 1,5 MCU

( Nguồn: http://www.nowfoods.com/index.php, truy cập ngày: 12/12/2006)

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain

Giống như các cấu trúc xúc tác sinh học khác, hoạt tính của enzyme bromelain cũng chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố:

 Nhân tố môi trường gồm nhiệt độ, pH, ion kim loại ;

 Nhân tố bên trong gồm nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, một số nhóm chức của enzyme và độ tinh khiết của enzyme

Các yếu tố nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động xúc tác của enzyme bromelain còn phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như cơ chất, bản thân enzyme, thời gian phản ứng, sự có mặt của các chất hoạt hóa

Bromelain là một enzyme có nguồn gốc thực vật vì thế tính chất của enzyme này sẽ gắn liền với một số tính chất của loại thực vật chứa chúng Trong số các tác nhân ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme thì tác nhân vật lý là được quan tâm nhiều nhất bởi các ứng dụng của nó trong thực tiễn sản xuất, đặc biệt là sự ảnh hưởng bởi nhiệt độ và

pH của môi trường xử lý enzyme hay trong quá trình chế biến loại thực vật chứa chúng

i Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ

Nhiệt độ có những ảnh hưởng ở nhiều mức độ khác nhau lên hoạt tính của enzyme Enzyme có bản chất là protein nên nó không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, đa số các enzyme bị mất hoạt tính trên 700C (Lê Ngọc Tú, 2004)

Enzyme bromelain có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 45 – 600C Nhiệt

độ quá cao sẽ làm thay đổi cấu trúc của enzyme, phá vỡ các liên kết trong phân tử enzyme, làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động cysteine, làm vị trí không gian của nhóm – SH bị biến đổi nên enzyme không kết hợp được với cơ chất Nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao sẽ làm phân tử protein bị biến tính sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme (Phạm Thu Cúc, 1999)

pH tối thích

Độ hoạt động của enzyme

pH pHtối thích

Bên cạnh đó, nhiệt độ của phản ứng xúc tác còn chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, đặc biệt là thời gian phản ứng, thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những tác động làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme

Theo nhiều nghiên cứu cho thấy

- Ở dịch chiết quả, (pH = 3,5), khi tăng nhiệt độ lên đến 600C thì bromelain vẫn còn hoạt tính

- Bromelain tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ hơn

 Ở 5oC, pH = 4 – 10, enzyme bromelain giữ hoạt tính tối đa trên casein trong vòng 24 giờ;

 Ở 55oC, pH = 6,1 ,enzyme bromelain bị mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút

- Quá trình đông khô, enzyme bromelain bị mất 27% hoạt tính

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

ii Ảnh hưởng của nhân tố pH

Giá trị pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường Mỗi loại enzyme thường chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích

Bromelain có biên độ pH hoạt động khá rộng, chúng có khả năng hoạt động tốt trong khoảng pH = 3 – 10 Tuy nhiên, khoảng pH tối thích của enzyme bromelain lại là pH =

5 – 8 (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Trong phân tử enzyme bromelain, trung tâm hoạt động là cysteine, chứa nhóm hóa học hoạt động mạnh là – SH Khả năng xúc tác của nhóm cysteine là nhờ liên kết đồng hóa trị được tạo thành thioester giữa nhóm acyl của cơ chất và nhóm sulfuhydryl của gốc cysteine

Trong môi trường pH sinh lý (pH = 6 – 8), phần lớn các nhóm – SH ở trạng thái không ion hóa và sự tạo thành liên kết hydro với cơ chất là do sự tham gia proton của nhóm – SH Chính nhóm proton – SH sẽ làm tăng mật độ điện tích xung quanh nguyên tử lưu huỳnh (Lê Ngọc Tú, 2004)

Bên cạnh đó pH còn ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác, mức độ ảnh hưởng của pH môi trường lên enzyme tùy thuộc vào nhiệt độ, loại cơ chất, thời gian phản ứng, độ tinh khiết của enzyme, bản chất của dung dịch đệm và sự hiện diện của chất tăng hoạt

Enzyme là một chất xúc tác sinh học đặc hiệu, có vai trò xúc tác các phản ứng sinh hóa diễn ra trong cơ thể sống Về cấu tạo, enzyme có bản chất là protein, trong phân tử enzyme có một hoặc vài bộ phận mang tính chất đặc hiệu, chỉ có bộ phận này mới tham gia xúc tác phản ứng Bộ phận này được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme Trong trung tâm hoạt động, có những nhóm chức hóa học có chức năng trực tiếp trong quá trình xúc tác phản ứng Tất cả các phần còn lại của enzyme đóng vai trò như một cái khung, giữ cho cấu trúc không gian thích hợp với khả năng xúc tác của enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.3.1 Động hóa học của phản ứng cơ bản

Tất cả các phản ứng sinh hóa đều có thể diễn ra với sự có mặt hay không có mặt enzyme Thông thường, các phản ứng hóa học chỉ có thể xảy ra khi phân tử các chất tham gia phản ứng phải tiếp xúc với nhau ở vị trí tham gia phản ứng và chúng phải ở trạng thái hoạt động Muốn hoạt hóa các phân tử này cần cung cấp cho chúng một mức năng lượng nào đó đủ để đạt đến trạng thái hoạt hóa Năng lượng đó gọi là năng lượng hoạt hóa Khi có sự tham gia của enzyme, năng lượng cản trở được hạ thấp, nhờ vậy sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất diễn ra dễ dàng hơn Tức là đối với phản ứng có enzyme, chỉ cần một mức năng lượng nhỏ cung cấp cho hệ thống thì phản ứng đã xảy

ra nhanh chóng

Vai trò xúc tác của enzyme trong phản ứng hóa học là khi có sự tham gia của các

enzyme, cơ chất được hoạt hóa mạnh, làm thay đổi tính chất và cấu trúc của cơ chất, từ

đó sinh ra các sản phẩm mới của phản ứng (Lê Ngọc Tú, 2003)

2.3.2 Động học phản ứng enzyme

Năm 1913, hai nhà khoa học Lenom Michealis và Maud Menten đã đưa ra mô hình động học để giải thích phản ứng được xúc tác bởi enzyme và lập phương trình phản ánh mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và enzyme Theo mô hình này, enzyme (E) kết hợp với cơ chất (S) tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (E – S) Phức hợp này sẽ được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzyme Enzyme được giải phóng sẽ thực hiện phản ứng mới

Theo Michealis – Menten, cơ chế xúc tác tổng quát của phản ứng có enzyme được trình bày theo sơ đồ:

Trong đó: K1, K-1, K2, K-2 là những hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng

K-1 có giá trị nhỏ nhất

Phản ứng chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm là quan trọng nhất

K2 tỉ lệ với nồng độ ES: v = K2.[ES] (v: vận tốc phản ứng)

Khi nồng độ ES càng lớn, vận tốc phản ứng càng lớn (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Theo thuyết Mischaelis và Menten, cơ chế phản ứng có xúc tác của enzyme xảy ra qua

ba giai đoạn:

 Giai đoạn một: enzyme (E) sẽ kết hợp với cơ chất (S) tại vị trí trung tâm hoạt động của enzyme bằng các liên kết hóa học, tạo thành phức hệ enzyme cơ chất (E-S) Ở giai đoạn này, các liên kết được hình thành thường là những liên kết yếu nên phức hệ E – S thường không bền Phản ứng tạo phức hệ này thường xảy

ra rất nhanh và cần có một ít năng lượng Giữa E và S có năm loại liên kết tham gia, mỗi loại có đặc tính riêng và năng lượng liên kết khác nhau, gồm liên kết phối trí, liên kết hydro, liên kết ion, liên kết kỵ nước lực Vander-Waals và liên kết do dịch chuyển điện tử

 Giai đoạn hai: khi tạo thành phức hệ E – S, dưới tác dụng của enzyme, cơ chất

sẽ bị thay đổi về cấu trúc không gian và mức độ bền vững của các liên kết bên trong phân tử, dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia

phản ứng Sau đó xảy ra sự thay đổi mật độ điện tích của phức hợp E – S làm biến dạng các liên kết giữa chúng, kết quả là cơ chất được hoạt hóa, dẽ dàng tham gia phản ứng

 Giai đoạn ba: đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm của quá trình phản ứng được tạo thành, enzyme tách ra và trở về trạng tháng ban đầu, chuẩn bị kết hợp với phân tử cơ chất khác Quá trình phản ứng hoàn thành

(citied by P R Mathewson, 1998)

Để xác định hoạt tính xúc tác của một loại enzyme, điều quan trọng nhất là lựa chọn cơ chất và phương pháp đo hoạt tính phù hợp Khả năng xúc tác của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào loại cơ chất Đối tượng nghiên cứu ở đây là bromelain quả, cơ chất được chọn là casein sữa (hoặc có thể là dạng muối caseinate)

Casein là protein chủ yếu có trong sữa, chiếm khoảng 80% protein của sữa Casein là một trong những protein có tính acid vì trong phân tử của chúng có chứa nhiều gốc acid glutamic và acid aspartic Các casein đều có điểm đẳng điện pI= 4,6 Casein không có cấu trúc bậc ba và bốn nên không bị biến tính theo định nghĩa mà bị biến đổi phần lớn

do bị thủy phân bằng enzyme hoặc do xử lý nhiệt, khi đó các liên kết peptide bị cắt đứt

và hình thành những nitro phi protein (các mạch peptide ngắn, acid amine tự do, muối amonium ) Các muối caseinate thì bền với nhiệt và tan trong nước tốt hơn Casein trong sữa gồm bốn dạng chính: α (s1) và α (s2)-casein, β-casein, κ-casein

(Lê Văn Việt Mẫn, 2004)

 α (s1)-casein: phân tử lượng khoảng 23000 Da, có 199 gốc acid amine Do sự phân bố các phần tích điện và các phần ưa béo không đồng đều nên các phân tử loại này có tính chất lưỡng cực, 1 đầu ưa nước, 1 đầu kỵ nước

 α (s2)-casein: phân tử lượng khoảng 25000 Da, có 207 gốc acid amine, có tính

ưa nước cao nhất trong các loại casein do phân tử của nó chứa nhiều nhóm phosphoryl và gốc cation nhất

 β-casein: phân tử lượng khoảng 24000 Da, có 209 gốc acid amine, có tính ưa béo cao nhất Dưới 40C, β-casein hoàn toàn bị khử trùng hợp do có nhiều tương tác ưa béo bị phá hủy

 κ-casein: phân tử lượng khoảng 19000 Da, có 169 gốc acid amine Loại này chỉ chứa một gốc phosphoryl và cũng có tính lưỡng cực Đầu amino của phân tử protein thì ưa béo còn đầu carboxyl thì ưa nước

Casein trong sữa có nguồn gốc từ những chủng bò khác nhau thì có thể có cấu trúc bậc một khác nhau Tuy nhiên cấu trúc bậc một của cùng một loại casein chỉ khác nhau bởi vài gốc acid amine trong phân tử protein của chúng (Lê Ngọc Tú, 2003)

Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein

Glutamic Acid Proline

Leucine Lysine Valine Aspartic Acid Serine

Tyrosine Isoleucine Phenylalanine Threonine Arginine Histidine Alanine Methionine Glycine Tryptophan Cystine

20,2 % 10,2 % 8,3 % 7,4 % 6,5 % 6,4 % 5,7 % 5,7 % 5,5 % 4,5 % 4,4 % 3,7 % 2,8 % 2,7 % 2,5 % 2,4 % 1,1 % 0,3 %

Nguồn: http://www.casein.com/products.htm, truy cập ngày: 16/12/2006

Shoshi et al (1975) đã nghiên cứu về sự biến đổi về thành phần hóa học của bromelain

thân I-1 và bromelain quả A dưới sự tác động của 2-hydroxy-5-5-nitrobenzyl Bromide, tetra nitromethane và H2O2 Kết quả nghiên cứu cho thấy, dưới tác động của các hợp chất trên, enzyme bromelain bị biến đổi mạnh về cấu trúc, thành phần các acid amine trong phân tử, trong khoảng pH và nhiệt độ nhất định

(Nguồn: http://www.brenda.uni-koeln.de/information/all_enzymes.php4?ecno=3.4.22.33, truy cập ngày: 15/03/2007)

Yamada, Takahashi và Murachi (1976), đã tinh chế và định tính được một loại protease

từ quả dứa, tên là bromelain quả FA2 Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự biến đổi của enzyme này sẽ sinh ra chuỗi amino acid cuối cùng là

Ala – Val – Pro – Gln – Ser – Ile – Asp – Trp – Arg – Asp – Tyr – Gly – Ala Thành phần amino acid của FA2 không khác biệt nhiều so với bromelain thân, tuy nhiên về cấu tạo FA2 có ít hơn về tổng lượng lysine và alanine so với glycine như bromelain thân nên có thể kết luận FA2 không phải là một glucoprotein

(Nguồn:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=956152&d opt=Abstract, truy cập ngày: 12/03/2007)

Waliszewski và Corzo (2004) cũng đã nghiên cứu về ái lực xúc tác của enzyme bromelain quả dạng thô trên những cơ chất protein khác nhau Nghiên cứu đã thực hiện với dịch quả dứa ở bốn mức độ chín khác nhau trên năm loai cơ chất gồm azocasein, azoalbumine, hemoglobin, natricaseinate và casein Sản phẩm tạo thành được xác định bằng phương pháp quang phổ Nghiên cứu đã đưa ra kết luận về khoảng pH và nhiệt độ tối thích đối với hoạt tính xúc tác của bromelain quả trên từng loại cơ chất trên

(Nguồn: http://www.ift.confex.com/ift/2004/techprogram/paper26158.htm, truy cập ngày: 15/03/2007)

Bên cạnh đó, Andrew et al (1990) cũng đã tiến hành nghiên cứu về nhóm các enzyme

cysteine proteinase của cây dứa và các nghiên cứu về ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của bromelain quả, comosain và pinguinain trên các loại cơ chất tổng hợp, sử dụng phương pháp quang phổ để xác định sản phẩm tạo thành Một phần kết quả nghiên cứu cho thấy trong thân dứa có tối thiểu bốn loại cysteine protease trong khi trong quả dứa chỉ chứa 2 loại là bromelain thân và bromelain quả với bromelain quả là chủ yếu Với cơ chất tổng hợp, hoạt tính của các cysteine proteinase này là thể hiện mạnh nhất

Ở trong nước, Phạm Thị Trân Châu và cộng sự cũng nghiên cứu một số tính chất của bromelain tách từ chồi dứa tây cho thấy trong chồi dứa, bromelain có hoạt tính cực đại

ở pH = 6,5 nhiệt độ tối thích là 600C

2.6 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung nghiên cứu: khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả (thô) trên cơ chất là casein

Phần thí nghiệm bao gồm các nội dung:

 Trích ly dung dịch enzyme bromelain quả (thô) từ nguồn nguyên liệu dứa tươi,

giống dứa Queen (Ananas comosus), đạt độ chín 2 (chín 2-3 hàng mắt, thường

sử dụng trong chế biến các sản phẩm dứa_thực phẩm)

 Khảo sát sự thay đổi các đặc tính của enzyme bromelain trong dịch chiết (tính chất vật lý, hoạt tính thủy phân) theo thời gian bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau

 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả (thô) trên cơ chất là casein và sau đó xác định hoạt tính của enzyme bằng cách xác định nồng độ sản phẩm sinh ra từ phản ứng thủy phân bằng phương pháp quang phổ (áp dụng phương pháp Kunitz)

Từ cơ sở là quá trình nghiên cứu trên, xây dựng biểu đồ biểu diễn mối tương quan giữa

pH và nhiệt độ ảnh hưởng lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả trên cơ chất là casein

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

Địa điểm thực hiện: phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ

Thời gian thực hiện: Từ 12/3/2007 đến 28/5/2007

3.1.2 Nguyên liệu

 Dứa giống Queen, đạt độ chín 2 (chín 2-3 hàng mắt)

3.1.3 Hóa chất thí nghiệm

 Casein – sodium caseinate, từ sữa bò (Sigma)

 L - Cysteine hydrochlorid – monohydrate (Merck)

 Trichloroacetic acid (TCA) (Trung Quốc)

 Ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt (EDTA) (Trung Quốc)

 Máy ly tâm lạnh (Hattich centrifugen D-78532 Tuttlingen, 1999, Germany)

 Thiết bị ủ nhiệt (Water Bath)

 Máy đo quang phổ (Hitachi U-1500 Spectrophotometer)

 Cuvette thạch anh

 Máy đo pH (Thermo electron corporation)

 Cân phân tích độ chính xác 0,0001; 0,01

 Micropipette, pipette, nhiệt kế

 Máy ép trái cây (Philip)

 Tủ lạnh, tủ đông và một số dụng cụ khác

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu và hóa chất nghiên cứu

i Phương pháp trích ly enzyme bromelain quả (thô)

Dứa ở độ chín đã được lựa chọn, sau khi thu hái, tiến hành trích ly enzyme bromelain theo phương pháp trích ly tổng quát cho các enzyme theo sơ đồ ở hình 6

Hình 6: Sơ đồ quy trình trích ly enzyme bromelain quả (thô)

Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004

ii Phương pháp xác định hoạt tính của enzyme bromelain

Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong quả khóm theo các điều kiện xử lý khác nhau được tiến hành theo phản ứng thủy phân của enzyme bromelain trong dịch quả trên cơ chất là casein (phương pháp Kunitz, xem phụ lục)

iii Phương pháp chuẩn bị dung dịch casein 1%

Cơ chất casein sử dụng trong quá trình xác định hoạt tính của enzyme bromelain được chuẩn bị theo sơ đồ ở hình 7

Hình 7: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch casein 1%

Ly tâm lạnh (7000 vòng/phút,

40C)

Dịch chiết chứa enzyme

3.2.2 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Khảo sát sự thay đổi các đặc tính của enzyme bromelain trong dịch chiết (tính chất vật lý, hoạt tính thủy phân) theo thời gian bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau

Mục đích

Xác định điều kiện bảo quản thích hợp mà enzyme vẫn duy trì và ổn định hoạt tính

Tiến hành thí nghiệm

Dung dịch enzyme sau khi trích ly sẽ được đưa vào bảo quản với 2 nhân tố

Nhân tố A: Nhiệt độ bảo quản

A1: Nhiệt độ lạnh 40C

A2: Nhiệt độ lạnh đông -30 0C

Nhân tố B: Thời gian bảo quản, thay đổi ở 10 mức độ:

B1: 1 ngày B2: 2 ngày B3: 3 ngày

B4: 4 ngày B5: 5 ngày B6: 6 ngày

B7: 8 ngày B8:10 ngày B9:12 ngày

B10:14 ngày

Mẫu chuẩn đối chứng là mẫu không bảo quản (mẫu vừa mới trích ly): B0

Ứng với mỗi nghiệm thức thời gian là một mẫu thử, lặp lại 2 lần

Số mẫu thí nghiệm: (10 nghiệm thức + 1 mẫu đối chứng)* 2 lần lặp lại * 2 (điều kiện bảo quản) = 44 mẫu

Thu nhận kết quả

Sau thời gian bảo quản, mẫu thí nghiệm được kiểm tra để xác định đặc tính vật lý (màu sắc, độ kết lắng) và hoạt tính enzyme theo phương pháp Kunitz với cơ chất là casein, điều kiện thí nghiệm: pH = 7,5; nhiệt độ = 370C

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả(trong dịch quả dứa) trên cơ chất là casein

Mục đích

Tìm hiểu quy luật biến đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch quả dứa ở những điều kiện tiền xử lý khác nhau