ảnh hưởng của tdz và naa đến sự nhân chồi và tạo rễ in vitro cây hoa thược dược (dahlia variabilis desf.)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG NGUYỄN THỊ THÊM ẢNH HƯỞNG CỦA TDZ VÀ NAA ĐẾN SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ IN VITRO CÂY HOA THƯỢC DƯỢC Dahlia variabilis Desf...

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ THÊM

ẢNH HƯỞNG CỦA TDZ VÀ NAA ĐẾN SỰ NHÂN

CHỒI VÀ TẠO RỄ IN VITRO CÂY HOA THƯỢC

DƯỢC (Dahlia variabilis Desf.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Ngành: Hoa Viên và Cây Cảnh

Cần Thơ - 2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: HOA VIÊN VÀ CÂY CẢNH

ẢNH HƯỞNG CỦA TDZ VÀ NAA ĐẾN SỰ NHÂN

CHỒI VÀ TẠO RỄ IN VITRO CÂY HOA THƯỢC

DƯỢC (Dahlia variabilis Desf.)

Cán bộ hướng dẫn:

Ths Nguyễn Văn Ây

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Thị Thêm

MSSV: 3083757 Lớp: Hoa Viên Cây Cảnh K34

i

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Hoa viên và Cây cảnh với đề tài: “Ảnh hưởng

của TDZ và NAA đến sự nhân chồi và tạo rễ in vitro cây hoa thược dược

(Dahlia variabilis Desf.)” do sinh viên NGUYỄN THỊ THÊM thực hiện kính trình

lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

ii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Hội đồng chấm luận văn đã chấp thuận luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Hoa viên

và Cây cảnh với đề tài: “Ảnh hưởng của TDZ và NAA đến sự nhân chồi và tạo

rễ in vitro cây hoa thược dược (Dahlia variabilis Desf.)”, do sinh viên Nguyễn

Thị Thêm thực hiện và bảo vệ trước hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp ngày….tháng….năm 2012

Luận văn đã được hội đồng đánh giá ở mức: ………

Ý kiến hội đồng: ………

………

………

………

Cần Thơ, ngày……tháng……năm 2012 Chữ ký của thành viên hội đồng Thành viên 1 Thành viên 2 Thành viên 3

Khoa Duyệt Trưởng khoa Nông Nghiệp & SHƯD

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và thầy hướng dẫn Các

số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thêm

iv

TIỂU SỬ CÁ NHÂN

1 LÝ LỊCH SƠ LƯỢC

Nơi sinh: Cần Thơ

Họ và tên cha: Nguyễn Văn Hiền

Họ và tên mẹ: Phan Thị Bót

Chỗ ở hiện nay: Ấp Thới Xuân, xã Trường Thắng, huyện Thới Lai, thành phố Cần Thơ

2 QUÁ TRÌNH HỌC TẬP

- 1996-2001: Học sinh Trường tiểu học Thới Lai 5

- 2001-2005: Học sinh Trường trung học cơ sở Thị Trấn Thới lai

- 2005-2008: Học sinh Trường trung học phổ thông Thới Lai

- 2008-2012: Sinh viên Trường Đại Học Cần Thơ, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Ngành Hoa viên & Cây cảnh, khóa 34

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2012

Người khai

Nguyễn Thị Thêm

v

LỜI CẢM TẠ

Kính dâng!

Cha mẹ suốt đời tận tụy vì tương lai của con

Xin tỏ lòng biết ơn đến!

Thầy Nguyễn Văn Ây đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp

Thầy Phạm Phước Nhẫn và cô Lê Minh Lý, cố vấn học tập của Lớp, cùng với quý thầy cô Khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng đã tận tâm, dìu dắt, rèn luyện tôi suốt những năm học tại trường Đại Học Cần Thơ

Chân thành cám ơn!

Cô Lê Hồng Giang, Cô Phan Thị Hồng Nhung, anh Mai Vũ Duy cùng với các anh chị, các bạn sinh viên trong phòng thí nghiệm Nuôi Cấy Mô, Bộ Môn Sinh Lý-Sinh Hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ đã hết lòng giúp đỡ

Các bạn sinh viên lớp Hoa viên & cây cảnh K34 đã giúp đỡ động viên tôi trong những năm tháng trên giảng đường Đại Học

vi

MỤC LỤC

TRANG CHẤP NHẬN LUẬN VĂN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TRANG CHẤP NHẬN LUẬN VĂN CỦA HỘI DỒNG

LỜI CAM ĐOAN

iv

v

vi viii

1.1 Nguồn gốc, phân bố, giá trị của cây thược dược 2

1.2.2 Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật 8 1.2.3 Ưu điểm và khuyết điểm của nuôi cấy mô thực vật

9

1.3 Một số nghiên cứu về các cây thuộc họ Cúc (Asteraceae) 12

2.1.2 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm 14

vii

3.1 Hiệu quả của TDZ lên sự nhân chồi thƣợc dƣợc in vitro 18

3.2 Hiệu quả của NAA lên hả năng tạo rễ chồi thƣợc dƣợc in vitro

viii

DANH SÁCH BẢNG

3.1 Ảnh hưởng của TDZ lên sự gia tăng số chồi thược dược theo thời gian

(tuần sau khi cấy)

18

3.2 Ảnh hưởng của TDZ lên sự gia tăng số lá thược dược theo thời gian (tuần

sau khi cấy)

21

3.3 Ảnh hưởng của TDZ lên sự gia tăng chiều cao (cm) chồi thược dược theo

thời gian (tuần sau khi cấy)

22

3.4 Ảnh hưởng của NAA lên sự tạo rễ của chồi thược dược vào thời điểm 3

tuần sau khi cấy

25

3.5 Ảnh hưởng của NAA lên sự gia tăng số lá thược dược theo thời gian (tuần

sau khi cấy)

28

3.6 Ảnh hưởng của NAA lên sự gia tăng chiều cao (cm) chồi thược dược theo

thời gian (tuần sau khi cấy)

29

ix

DANH SÁCH HÌNH

3.1 Sự sinh trưởng của chồi thược dược 4 tuần sau khi cấy trên môi

trường MS có các nồng độ TDZ khác nhau

20

3.2 Sự phát triển chiều cao và số lá thược dược vào thời điểm 4 tuần sau khi

cấy trên môi trường MS có nồng độ TDZ khác nhau

23

3.3 Rễ thược dược ở 3 tuần sau khi cấy trên môi trường MS có nồng độ NAA

khác nhau

26

x

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

α-NAA : alpha-naphthalene acetic acid

xi

NGUYỄN THỊ THÊM 2012 “Ảnh hưởng của TDZ và NAA đến sự nhân chồi và

tạo rễ in vitro cây hoa thược dược (Dahlia variabilis Desf.)” Luận văn tốt nghiệp

đại học ngành Hoa viên - cây cảnh, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng,

Trường Đại Học Cần Thơ Cán bộ hướng dẫn: ThS Nguyễn Văn Ây

TÓM LƯỢC

Đề tài: “Ảnh hưởng của TDZ và NAA đến sự nhân chồi và tạo rễ in vitro cây

hoa thược dược (Dahlia variabilis Desf.)” được thực hiện nhằm tìm ra nồng độ TDZ và NAA thích hợp cho giai đoạn nhân chồi và tạo rễ in vitro cây hoa thược

dược Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Nuôi cấy mô, Bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ, từ

tháng 01 đến tháng 06 năm 2012 Kết quả thí nghiệm cho thấy: (i) Trong giai

đoạn nhân chồi hoa thược dược, sử dụng môi trường Murashige & Skoog không

bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật để nhân chồi đạt số chồi đạt được cao

nhất (2,93 chồi sau 4 tuần nuôi cấy) Trên môi trường này các chồi in vitro sinh trưởng và phát triển tốt (ii) Sử dụng môi trường cơ bản MS bổ sung than hoạt

tính 2 g/l và không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng hoặc môi trường MS bổ

sung than hoạt t nh 2 g/l và NAA 0,5 mg/l để tạo rễ cho chồi hoa thược dược in vitro đã cho tỷ lệ tạo rễ cao (tương ứng là 90,5% - 100%) và số rễ cao (tương

ứng là 10,3 và 12,5 rễ) rễ phát triển tốt so với các nghiệm thức còn lại Về mặt lý

thuyết, trong một năm có thể tạo ra từ 1.060.000 – 1.172.000 cây in vitro từ một

chồi ban đầu

Từ khóa: cây hoa thược dược, TDZ, NAA, nhân chồi, tạo rễ

1

MỞ ĐẦU

Khi xã hội ngày càng phát triển, thì con người đòi hỏi càng cao về nhu cầu tinh thần Hoa và cây cảnh không chỉ mang giá trị thẩm mỹ mà còn mang giá trị tình cảm rất lớn đem lại sự thoải mái, thư giãn cho con người Do đó, nó đã thúc đẩy con người tìm tòi nghiên cứu ra nhiều giống hoa mới và nhiều phương pháp sản xuất đem lại hiệu quả kinh tế hơn

Hoa thược dược (Dahlia variabilis Desf.) là một loài hoa to, đẹp, đa dạng về

chủng loại, màu sắc mà còn khá bền nên là loại hoa rất được ưa chuộng Thược dược được chọn làm quốc hoa ở Mexico, cũng là loài hoa ch nh thức của thành phố Seattle, bang Washington ở Mĩ Trên thế giới các nhà chọn giống thực vật đã t ch cực trong việc nhân giống thược dược để tạo ra hàng trăm giống mới Tuy nhiên, ở nước ta việc nhân giống loài cây này chủ yếu bằng phương pháp truyền thống nên chưa mang lại hiệu quả cao, số lượng giống rất hạn chế và khó giữ được những đặc tính tốt của cây mẹ

Khoa học phát triển không ngừng đem lại nhiều thành tựu to lớn phục vụ cho con người Một trong những tiến bộ mang nghĩa quan trọng đó chính là kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Kỹ thuật này đã được phát triển mạnh mẽ và có khá nhiều ứng dụng quan trọng trong việc chọn giống, nhân giống và phục hồi giống…(Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Nuôi cấy mô là một công cụ nhân giống tích cực, tạo được cây sạch bệnh, có hệ số nhân cao và thời gian sản xuất được rút ngắn Nhiều loại hoa được đưa vào nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và đạt được hiệu quả như mong đợi

Vì vậy, đề tài “Ảnh hưởng của TDZ và NAA đến sự nhân chồi và tạo rễ in vitro cây hoa thược dược (Dahlia variablis Desf)” được thực hiện nhằm tìm ra nồng độ

TDZ và NAA thích hợp cho giai đoạn nhân chồi và tạo rễ in vitro cây hoa thược

dược, góp phần hoàn chỉnh quy trình vi nhân giống loại hoa này, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ

2

CHƯƠNG 1 LƯỢC HẢO T I LIỆU

1.1 Nguồn gốc, phân bố, giá trị của cây thược dược

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố

Cây hoa thược dược có tên khoa học là Dahlia variablis Desf, thuộc họ cúc

(Asteraceae) Theo Phạm Văn Duệ (2005), cây thược dược có nguồn gốc ở Mehico

và có tên gọi là Chichipathi Cây hoa thược dược được mang tên Dahlia là tên nhà thực vật học người Thụy Điển

Thược dược được trồng ở các vùng núi Châu Mỹ từ Mehico đến Colombia và

du nhập vào Tây Ban Nha từ năm 1788, rồi sang Pháp và được trồng chính thức tại Pháp năm 1979, từ đó được đem trồng ở nhiều nước hác (Võ Văn Chi, 2003) Theo Phạm Văn Duệ (2005), hoa thược dược được nhập vào Việt Nam đầu thế kỷ

XX

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Thược dược là cây thân thảo sống nhiều năm nhờ các rễ hình thoi hay dạng

củ, hợp thành bó ở cổ rễ, chứa đầy chất dự trữ hydrocarbon (inulin) Thân rỗng, phân nhánh, nhẵn hay có lông tơ, cao 0,3 - 2 m hay hơn Lá dạng lông chim không đều, có lá chét hình trái xoan, có răng men theo cuống, có khi nguyên hay xẻ lông chim, màu lục hay màu xanh lục đậm ở mặt trên, nhạt ở mặt dưới, cuống lá rộng (Võ Văn Chi, 2003), (Hình 1.1)

Mỗi cánh hoa là một hoa nhỏ đầy đủ, hoa nhỏ không có cuống và gắn thẳng vào đế chung Mỗi hoa nhỏ có một vảy là lá bắc Đặc điểm hoa thược dược có bao phấn ch n trước nhụy nên không thể tự thụ được Để có hạt thì cây phải giao phấn,

do đó cây con mọc từ hạt thường khác với cây mẹ (Phạm Văn Duệ, 2005)

Thược dược ưa sáng, nếu đủ nắng thì màu hoa càng đẹp, củ giống khỏe Nhưng cây lại thích khí hậu mát mẻ, nhiệt độ trung bình hông cao hơn 30˚C, không thấp dưới 10˚C, độ ẩm 60 - 70%

Theo Võ Văn Chi (2003) sơ bộ có thể chia làm các dạng màu như sau:

- Thược dược trắng:

- Thược dược nhung: có cánh môi đỏ đậm, phớt đen

- Thược dược cánh sen: có cánh môi màu hồng đậm, màu hồng nhạt

- Thược dược vằn: có cánh môi màu đỏ viền trắng

- Thược dược vàng cam: cánh môi rộng, dài, màu da cam

Cây hoa thược dược thường được dùng để trang trí trong công viên, công trình

đô thị, hu vui chơi giải trí Ngoài ra, nó còn được trồng trong các luống hoa, bồn hoa, làm đẹp cho khu nhà ở, sân vườn Thược dược còn là một trong những loại hoa trồng chậu có giá trị kinh tế cao

4

Rễ cây thược dược được sử dụng làm thuốc tiêu viêm, chống đau Ở Vân Nam (Trung Quốc), người ta dùng để trị đau răng, viêm tuyến mang tai (Võ Văn Chi, 2003)

1.1.4 Các phương pháp nhân giống cây thược dược

Theo Ngọc Hà (2011) cây thược dược được nhân giống chủ yếu bằng cách giâm cành, một số ít trồng từ củ, và gieo hạt chỉ áp dụng với nhóm hoa cánh đơn Nhân giống bằng phương pháp giâm cành là phương pháp đơn giản, dễ làm, không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp Nếu nhân giống bằng củ thì cây con giữ được kiểu gene của cây mẹ, và cây mọc từ củ thì tuổi sinh lý trẻ, mầm khỏe Tuy nhiên khó bảo quản củ và thời gian trồng từ củ đến có hoa lâu (Phạm Văn Duệ, 2005) Phương pháp gieo hạt thường áp dụng để trồng hoa bán vào dịp Tết vì dễ xác định ngày trồng và khả năng cho hoa vào đúng dịp Tết rất cao

1.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1 Môi trường nuôi cấy

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên (2002), mô thực vật nuôi cấy trong môi trường cũng cần chất dinh dưỡng như cây cần đất Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi theo từng loài và bộ phận nuôi cấy Tuỳ theo mục đ ch của người nghiên cứu mà mô nuôi cấy được duy trì ở trạng thái mô sẹo (callus), tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh thành cây hoàn chỉnh, môi trường nuôi cấy phải thay đổi nhiều hay t (Vũ Văn Vụ, 1999) Tuy vậy, tất cả các môi trường nuôi cấy có các thành phần cơ bản như: nước, đường làm nguồn cung cấp carbon, muối hoáng đa lượng, muối hoáng vi lượng, vitamin, chất điều hoà sinh trưởng Ngoài ra, còn thêm các thành phần hữu cơ có thành phần hoá học xác định (acid amin, EDTA…) hoặc không xác định như nước dừa Tuỳ theo môi trường nuôi cấy mà bổ sung hàm lượng agar thích hợp

5

sucrose và glucose (20 - 40 g/l) (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Ngoài ra, đường còn đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường Khi sử dụng đường sucrose trong nuôi cấy nó được thuỷ phân hoàn toàn một phần thành monosaccharide: glucose và fructose (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Loại đường hay sử dụng là saccharose và glucose Nhưng hiện nay saccharose được dùng phổ biến hơn (Lâm Ngọc Phương, 2010)

 hoáng đa lượng

Theo Lê Văn Hòa và ctv (1999), hoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh

hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và chúng hông gây độc Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là Nitrogen (N), Phosphorus (P), Potasium (K), Magnesium (Mg), Calcium (Ca), Lưu huỳnh (S)… Đối với cây trồng, các chất vô

cơ đóng vai trò rất quan trọng Ví dụ: Mg2+ là thành phần của phân tử diệp lục, Ca2+

là thành phần của màng tế bào, N là thành phần quan trọng của amino acid, vitamin, protein và các nucleic acid

Nitơ thì thông thường được cung cấp như ion nitrat (từ KNO3) và ion amonium (từ NH4NO3) Về mặt lý thuyết, có sự thuận lợi khi cung cấp nitơ từ ion amonium và nitrat nhưng thực tế thì hàm lượng nitơ cần phải được giảm khi kết hợp với các phân tử đa lượng vì nếu như nồng độ cao ion amonium sẽ gây độc cho cây trồng (Butenko, 1964; trích bởi Nguyễn Đức Thành, 2000)

Theo Curir và ctv (1986), đã nhận thấy tỷ lệ nhân cao hơn ở nhiều loài khác

nhau hi hàm lượng ammonium (NH4+) của môi trường giảm Hơn nữa sự tăng nồng độ của Ca, Mg, Fe và Mn trong môi trường cải tiến ảnh hưởng đến chất lượng

vi chồi (Pati và ctv., 2006)

 hoáng vi lượng

Khoáng vi lượng là những thành phần yêu cầu rất ít cho sự sinh trưởng và phát triển của cây và có nhiều vai trò khác nhau Các thành phần vi lượng gồm có mangan, đồng, sắt, coban, kẽm, bo, molypđen Sự hiện diện của nguyên tố sắt đặc biệt quan trọng cho quá trình tạo chồi và rễ bất định (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Trong nuôi cấy mô thường sử dụng sắt vi lượng ở dạng phức hợp chelate (Fe-EDTA) Ở dạng này sắt không bị tủa mà phóng thích từ từ vào môi

trường nuôi cấy theo nhu cầu của mô thực vật (Nguyễn Văn Uyển và ctv., 1984)

Một số muối vi lượng thường dùng là ZnSO4, CuSO4, CoCl2 Ngoài ra một số môi trường còn có muối nikel và amonium (Nguyễn Đức Thành, 2000)

6

 Vitamin

Theo Phan Thị Bích Trâm (2008), vitamin là những hợp chất hữu cơ mà chỉ với một lượng nhỏ cũng có tác dụng đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển bình thường Vitamin tham gia vào nhóm ghép của enzyme có tác động như một coenzyme Tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy trong ống nghiệm có khả năng tổng hợp được hầu hết các vitamin nhưng hông đủ về lượng Do đó, phải bổ sung thêm vitamin vào môi trường nuôi cấy (Nguyễn Xuân Linh, 1998) Vitamin thường được sử dụng nhất là nicotinic acid, pyridoxine (B6), thiamine (B1), myo-inositol, vitamin C thường được sử dụng như là chất chống oxy hóa

Thiamine được sử dụng như là coenzyme trong biến dưỡng carbohydrate

Nicotinic được sử dụng như là coenzyme trong biến dưỡng các chất nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) hay nicotinamide dinucleotide phosphate (NADP) Pyridoxin là coenzyme trong phản ứng dị hóa amino acid

Myo-inositol là thành phần của phosphatidyl inositol và phytic acid hỗ trợ cho sự sinh trưởng của tế bào (Nguyễn Bào Toàn, 2010)

 Agar

Theo Nguyễn Xuân Linh (1998), chất đông cứng để làm giá thể cho môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật, người ta thường sử dụng agar (thạch) Agar là một loại polysaccharide của tảo biển Ở 80˚C thạch ngậm nước thành trạng thái lỏng, nhưng ở 40˚C thì trở về trạng thái rắn Nồng độ sử dụng thường là 6 - 8 g/l, điều này đạt được nhờ các Polysaccharide kết hợp với các phần tử H2O tạo thành polymere Ngoài ra, agar còn có tác dụng khác nữa là cung cấp thêm Iod, làm giàu

hàm lượng Iod trong môi trường (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006) Nếu nồng độ thạch

trong môi trường nuôi cấy cao sẽ giới hạn sự phát triển của mô sẹo và ngược lại làm hạn chế sự trao đổi chất giữa môi trường và mô nuôi cấy (Lâm Ngọc Phương, 2010)

 Than hoạt tính

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) than hoạt tính cho vào môi trường nhằm mục

đ ch làm tối môi trường nuôi cấy (môi trường tạo rễ) Bên cạnh đó, còn có tác dụng khử độc tố của môi trường nuôi cấy bằng cách kết hợp với các hợp chất có gốc phenol do cây tiết ra trong suốt quá trình nuôi cấy, hút các chất ức chế sự phát triển của cây (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

 Giá trị pH

pH thường được hiệu chỉnh trong khoảng 5,5 - 6 trước khi hấp khử trùng pH quyết định sự hòa tan của hoáng trong môi trường pH còn ảnh hưởng đến sự hấp thu hoáng trong môi trường và ảnh hưởng trên sự tạo gel của agar khi hấp khử trùng pH thấp (<4,5) môi trường có agar khó tạo gel (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Độ

pH của môi trường được điều chỉnh bằng dung dịch 10% KOH, NaOH, HCl Có thể

đo pH bằng máy để bàn hoặc máy đo pH cầm tay Thường thì nhiệt độ cao sẽ làm tăng t nh pH của môi trường

 Chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là những chất có hoạt tính sinh học rất lớn, được tạo ra một lượng rất nhỏ để điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật Gồm hai nhóm chất: auxin và cytokinin

 Auxin

Auxin tự nhiên thường tìm thấy ở thực vật là indole-3-acetic acid (IAA) Năm

1953, Went và Thimann chứng minh rằng auxin (IAA) kích thích sự tạo rễ (trích bởi Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2005) Theo Nguyễn Xuân Linh (1998) auxin là các hợp chất kích thích sự giãn nở tế bào, sự hình thành mô sẹo và sự xuất

8

hiện rễ bất định Các auxin có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp từ 0,1 - 1 mg/l tùy theo mục đ ch và vật liệu nuôi cấy Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa

rễ, ngược lại ở hàm lượng auxin cao sẽ tạo mô sẹo (Vũ Văn Vụ, 1999)

Trên cơ sở các hoạt tính sinh học của auxin, công nghiệp hóa chất đã tổng hợp được các chất hóa học có tác dụng giống IAA Các chất này được gọi là auxin tổng hợp, chúng được sử dụng trong nông nghiệp có tác dụng như chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2005) Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) auxin tổng hợp được sử dụng rộng rãi nhất là indole-3-butyric acid (IBA), hiện nay được chứng minh là xuất hiện trong tự nhiên trong cây, alpha-naphthalene acetic acid (NAA) và 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D) Do IAA là auxin tự nhiên, kém bền bởi nhiệt nên ít dùng, IBA và NAA thường sử dụng cho quá trình

tạo rễ ở đa số các loại cây

 Cytokinin

Theo Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn (2005) chức năng ch nh của cytokinin là kích thích sự phân bào Ngoài ra, cytokinin còn kích thích pha dãn dài lẫn pha chuyên hóa Khi có tác dụng của auxin ở các mức hác nhau, đối với các tế bào tách rời (nuôi cấy mô) sự cân đối giữa auxin và cytokinin sẽ kích thích sự thành lập callus, rễ và chồi Cyto inin được tổng hợp ở rễ, từ đó vận chuyển lên chồi Chúng đóng vai trò ch nh trong sự thành lập chồi và cơ quan trong nuôi cấy mô Nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích hình thành nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài ra, hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặc làm cho chồi chứa nhiều nước (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Các cyto inin thường dùng trong nuôi cấy mô là kinetin (6-furfurylaminopurin), BA (Benzyl adenine), BAP (6-Benzyl amino purin) Ngoài các loại cytokinin trên, còn có Thidiazuron (TDZ) là cytokinin có hoạt tính cao nhờ ít bị phân hủy bởi enzyme nội sinh so với

các loại cytokinin khác (Mor và ctv., 1982) Hiệu quả tăng nhanh chồi trong một số loài khó nhân giống như Acer fremanii (Kerns và ctv., 1986) và Pyrus communis (Singha và ctv., 1988) Bên cạnh đó, TDZ có hiệu quả cao gia tăng hình thành chồi nách trong nhân chồi Rhododendron (Fellman và ctv., 1987)

1.2.2 Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy thực vật in vitro) là quá trình nuôi cấy thực vật trong ống nghiệm, khác với nuôi cấy in vivo là quá trình nuôi cấy thực vật

trong điều kiện tự nhiên Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung

9

cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng (Nguyễn Xuân Linh, 1998) Theo Lâm Ngọc Phương (2009) ỹ thuật nuôi cấy mô thực vật là công cụ rất tốt để nghiên cứu sinh học thực vật, những kỹ thuật này đã được ứng dụng nhanh chóng vào thực tiễn khi các cây còn trong ống nghiệm Nhân giống vô tính trong ống nghiệm hay vi nhân giống là kỹ thuật đầy hứa hẹn Nó sản xuất ra những cây con giống với cây mẹ do sự kích thích những khả năng tự nhiên về nhân giống vô tính của các loài thực vật, hoặc do việc cảm ứng sự sinh tạo cơ quan mới của chồi

và rễ Vi nhân giống không thay thế các phương pháp nhân giống truyền thống, nhưng bản thân nó có vị tr trong các lĩnh vực chất lượng cao

1.2.3 Ưu điểm và khuyết điểm của nuôi cấy mô thực vật

Theo Lâm Ngọc Phương (2009) nuôi cấy mô thực vật có một số ưu huyết điểm sau:

- Kỹ thuật vi nhân giống dễ dàng tạo được những dòng cây sạch bệnh;

- Vi nhân giống có thể trẻ hóa và phục tráng những dòng, nó có thể dễ dàng

nhân dòng bằng cách giâm cành hoặc các kỹ thuật thông dụng khác;

- Các phương pháp nuôi cấy mô là nền tảng của công nghệ di truyền

 Khuyết điểm

- Phương pháp này tương đối đắt tiền hơn các phương pháp nhân giống vô tính

khác;

- Không phải loại cây nào cũng có thể vi nhân giống;

- Môt số loài có thể có biến dị di truyền hoặc không di truyền khi vi nhân giống;

- Tất cả đợi chờ sự giống nhau khi vi nhân giống Các loài không giống nhau có

thể được nhân giống rất hiệu quả nhưng chỉ phát hiện sau này

10

1.2.4 Các giai đoạn vi nhân giống

Đối với nhân giống vô tính trong ống nghiệm, quy trình nhân giống được chia

thành 4 giai đoạn:

 Nuôi cấy vô trùng (giai đoạn khởi đầu)

Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình nhân

giống in vitro Mục đ ch của giai đoạn này là phải tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro Để khử trùng mô thực vật, người ta thường dùng

một số hóa chất như: HgCl2, Ca(OCl)2, NaOCl, H2O2… và tùy thuộc vào từng loại

mô thực vật mà chọn loại, nồng độ và thời gian xử lý hóa chất thích hợp (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

Theo Lâm Ngọc Phương (2009) để tăng t nh linh động và khả năng xâm nhập của hóa chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô cấy trong vòng 30 giây trong rượu ethylic 70% sau đó mới xử lý với dung dịch diệt khuẩn Đồng thời người

ta thêm các chất giảm sức căng bề mặt như Tween 80, Fotolfo, Teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn

Để chọn lọc mẫu vật thích hợp trong nuôi cấy khởi đầu cần lưu 4 điểm sau:

2 Chọn loại cơ quan và vị trí mẫu ở cây

3 Tuổi và tình trạng sinh lý tối ưu của cơ quan

4 Mùa thích hợp đề lấy mẫu vật

5 Phẩm chất của cây để lấy mẫu vật

 Giai đoạn II (giai đoạn nhân giống)

Theo Nguyễn Xuân Linh (1998) mục đ ch của giai đoạn này là tái sinh một cách

có định hướng các mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ

lệ các hợp chất Auxin/Cytokinin ngoại sinh được đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm đến tuổi sinh lý của mẫu cấy Thường các mô non, chưa phân hóa có hả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hóa sâu Người ta còn nhận thấy lấy mẫu cấy trong thời kỳ sinh trưởng mạnh của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi Có nhiều kiểu để gia tăng tốc độ nhân như cấy mắt Trong kỹ thuật này có hai kiểu tạo chồi, một kiểu tạo chồi từ một mẫu cấy chỉ có một mắt hoặc nhiều mắt Phương pháp hác để gia tăng số chồi ở giai đoạn này là cấy đỉnh sinh trưởng

11

(meristem culture) hoặc cấy chồi (shoot tip culture) Đỉnh sinh trưởng hoặc chồi có thể được lấy từ chồi đỉnh hay chồi ngang (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

 Giai đoạn III (giai đoạn tạo rễ và phát triển)

Mục đ ch của giai đoạn này là chuẩn bị cho cây con sẵn sàng cho sự ra ngoài

Nó bao gồm việc ra rễ, phát triển cây con, cũng như tạo sự cứng cỏi cho chúng đối với những xáo trộn sau này Phương pháp nhân giống vô tính trong ống nghiệm có hiệu quả hi có được tỉ lệ cây con sống tốt cao sau khi ra khỏi giai đoạn nuôi cấy vô trùng và chuyển trồng nơi vườn ươm Việc cấy chuyền cuối cùng được tiến hành nhằm giúp cho sự sinh trưởng và tạo rễ Có thể lợi dụng giai đoạn này để huấn

luyện cây và chuẩn bị cho chúng bước vào giai đoạn in vivo (Lâm Ngọc Phương,

2009)

 Giai đoạn IV (giai đoạn thuần hóa)

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) mục đ ch của giai đoạn này là làm giảm tối

thiểu chết cây con, khi chuyển từ in vitro sang nhà lưới hoặc điều kiện ngoài đồng

Trong giai đoạn này các yếu tố cần được quan tâm là:

- Tình trạng cây con khi chuyển ra môi trường trồng

- Các yếu tố về môi trường như nhiệt độ, ẩm độ và ánh sáng của nơi thuần

dưỡng hoặc tình trạng cây con trong bình cấy

1.2.5 Phương pháp vi nhân giống

 Phương pháp nhân chồi bên

Chồi nách hay chồi bên có cấu tạo giống chồi ngọn, cành bên cùng lớn lên bởi phần đỉnh ngọn của nó và mỗi cành bên cũng được tận cùng bằng một chồi ngọn Trong nách lá thường có thể có hai, ba hoặc nhiều hơn các chồi nách sắp xếp theo hướng ngang hoặc thẳng đứng (Hà Thị Lệ Ánh, 2005)

Trong phương pháp nhân chồi bên, chồi ngọn được cô lập trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ các nách lá phát triển dưới ảnh hưởng của cytokinin ở nồng độ cao Vai trò cytokinin lúc này là hạn chế ưu t nh ngọn để cho các chồi bên

có thể phát triển Các chồi bên này có thể tiếp tục chuyển sang môi trường mới bổ sung cytokinin thì các chồi bên mới lại tiếp tục được tạo ra (Nguyễn Đức Lượng và

Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

 Ưu điểm của phương pháp này:

12

- Phương pháp này đơn giản hơn so với các phương pháp nhân giống khác

- Tốc độ nhân giống cao

- Sản phẩm ổn định về mặt di truyền

- Cây con tăng trưởng rất tốt, có lẽ là do đã được trẻ hóa

- Đối với một số loại cây, số lần cấy chuyền càng nhiều thì nhu cầu cytokinin càng giảm là do cây đã quen với cyto inin và mô đã được trẻ hóa (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

 Các yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành chồi bên

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002) thì nhu cầu về cytikinin rất khác nhau (loại và nồng độ cytokinin) Ví dụ cây con của Bromeliaceae có thể tạo chồi bên mà không cần sự hiện diện của cyto inin trong môi trường nuôi cấy Đối với một số loại cây, số lần cấy truyền càng nhiều thì nhu cầu về cytokinin càng giảm do cây đã quen với cyto inin và mô đã được trẻ hóa Nhu cầu về nồng độ cyto inin thay đổi tùy theo từng loài thực vật

1.3 Một số nghiên cứu về các cây thuộc họ Cúc (Asteraceae)

Ở giống cúc C23 sử dụng môi trường MS kết hợp với NAA 0,5 mg/l trong giai đoạn tạo rễ là thích hợp nhất (Đặng Minh Tâm, 2002)

Đỗ Bé Thảo (2009), môi trường nuôi cấy MS có sự hiện diện của than hoạt tính 1 g/l kết hợp với chất điều hòa sinh trưởng NAA 0,5 mg/l cho tỉ lệ tạo rễ cao 100%,

số rễ được hình thành 4,3 rễ/cây, sự vươn dài rễ 5,6 cm và chiều cao chồi 4,6 cm có hiệu quả cao nhất trong môi trường tạo rễ của chồi cúc “Farm t m”

(Chrysanthemum sp.)

Jaime (2004) sử dụng môi trường MS kết hợp TDZ 2 mg/l để tạo mô sẹo có hiệu

quả trên hoa cúc (Chrysanthemum sp.) và môi trường thích hợp tạo rễ là MS kết

hợp NAA 1 mg/l

Theo Trần Khắc Hạnh và ctv (2004), đối với giống cúc CN01 sử dụng môi

trường MS + BA 0,5 mg/l + 15% nước dừa để nuôi cấy, số chồi thu được sau 4 tuần nuôi cấy là 5 chồi/mẫu Sử dụng môi trường MS + 15% nước dừa để tạo cây hoàn chỉnh sau 2 tuần nuôi cấy

13

Trên giống cúc CN97 (hoa màu trắng), Hoàng Thị Lan Hương và ctv (2004) sử

dụng HgCl2 0,1% (trong 7 phút) để khử trùng nguyên liệu cho tỷ lệ mẫu sống là 51,5% Sử dụng môi trường MS + A 0,1 mg/l + 15% nước dừa để nhân chồi với

hệ số nhân chồi đạt được là 5 chồi/mẫu và tạo cây con hoàn chỉnh ở môi trường MS + NAA 0,1 mg/l + 15% nước dừa là tốt nhất

Theo Tống Hồ Nam (2009), trong vi nhân giống cây hoa cúc “Đài Loan” vàng

(Chrysanthemum sp.) thì sử dụng môi trường MS bổ sung NAA 2 mg/l cho kết quả

tỷ lệ tạo rễ cao và rễ phát triển tốt

Nguyễn Văn Hồng (2009), kết quả nghiên cứu trên cây cúc đồng tiền cho thấy,

bổ sung BAP 1,5 mg/l + 15% nước dừa vào môi trường MS mang lại hiệu quả cao nhất trong nhân nhanh chồi hoa đồng tiền sau tái sinh Môi trường MS bổ sung NAA 0,15 mg/l cho kết quả tạo rễ tốt nhất

Theo Ngô Đăng Vịnh và ctv (2003), đối với cúc đồng tiền môi trường thích hợp

tạo callus và tái sinh chồi là môi trường MS + TDZ 0,2 mg/l + NAA 0,1 mg/l, môi trường nhân nhanh tốt nhất là môi trường bán lỏng MS + AP 1,5 mg/l + 10% nước dừa và môi trường ra rễ là môi trường MS + NAA 0,5 mg/l

Nguyễn Thị Lý Anh và Nguyễn Quang Thạch (2004), nghiên cứu trên giống cúc Nhật “Rivalry” cho ết quả môi trường nhân nhanh tốt nhất là môi trường MS + BA

1 mg/l, môi trường tạo cây hoàn chỉnh là môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Trên môi trường này chồi ra rễ 100% sau 2 tuần nuôi cấy, khả năng sinh trưởng và phát triển của cây tốt

Theo Nguyễn Thị Kim Lý và Nguyễn Xuân Linh (2004), đối với giống cúc CN20 môi trường thích hợp nhân nhanh chồi là môi trường MS + BAP 0,5 mg/l + α-NAA 0,1 mg/l, môi trường tạo cây hoàn chỉnh là MS + α-NAA 0,2 mg/l

14

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN V PHƯƠNG PH P 2.1 Phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu

Thí nghiệm sử dụng chồi non gieo từ hạt in vitro của cây thược dược (Hình

2.1) Hạt thược dược có tên thương mại Zinnia Dahlia FL Red Flame của công ty TNHH sản xuất Thương Mại Xanh

Hình 2.1 Vật liệu thí nghiệm (chồi non thược dược) 2.1.2 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Nuôi cấy mô, Bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ từ tháng 01 đến tháng 06 năm 2012

2.1.3 Điều kiện thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện phòng cấy mô có ẩm độ 68 - 72%, nhiệt độ 26 ±2°C, cường độ chiếu sáng 1.500 - 2.000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày

2.1.4 Thiết bị và hóa chất