Chuong 1 sinh học phân tử

MÔN HỌC CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ Giáo viên: TS Đặng Đức Long THÔNG TIN CHUNG VỀ LỚP HỌC • THỜI LƯỢNG: TÍN CHỈ ( 30 TIẾT) = 10 TUẦN HỌC • MỤC TIÊU MÔN HỌC: - Nắm sở lý thuyết yêu cầu quan trọng thực hành kỹ thuật thông dụng SHPT nay; - Hiểu cách vận dụng kỹ thuật vào vấn đề SHPT; - Biết nguồn tài liệu hướng phát triển kỹ thuật SHPT THÔNG TIN CHUNG VỀ LỚP HỌC • NHIỆM VỤ SINH VIÊN: - Theo dõi giảng đọc tài liệu tham khảo theo hướng dẫn; - Làm tập tham gia seminar; - Tham dự kiểm tra kì thi kết thúc học phần • CÁCH ĐÁNH GIÁ: - Điểm báo cáo (bài tập, seminar): 20 % - Điểm thi kỳ: 30 % - Điểm thi kết thúc môn học: 50 % - Điểm cộng cho tham gia thảo luận lớp: tối đa 10% CHƯƠNG TRÌNH MÔN HỌC Phần I: Kỹ thuật sử dụng cho DNA, RNA Chiết tách DNA từ nguồn tự nhiên phân tách phân tử DNA phương pháp điện di: ôn lại kiến thức cũ Kỹ thuật tách dòng phân tử (molecular cloning): tuần Các kỹ thuật PCR ứng dụng chúng phân tích di truyền: tuần Kỹ thuật đọc chuỗi DNA: tuần Kỹ thuật tạo phân tích đột biến DNA: tuần Phần II: Kỹ thuật sử dụng cho protein Tổng hợp protein ghép (fusion protein): tuần Kỹ thuật biểu tinh protein: tuần Kỹ thuật nhận dạng protein: tuần Seminar vào 1-2 tuần cuối KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ - TẦM QUAN TRỌNG • Kỹ thuật (KT) SHPT phần tách rời phát triển chung phát triển SHPT Sự phát triển kỹ thuật cho phép người nghiên cứu sâu hơn, nhanh hơn, với giá thành rẻ vấn đề SHPT Việc nghiên cứu kỹ thuật SHPT trực tiếp đem lại kiến thức, hiểu biết SHPT Tầm quan trọng việc nghiên cứu KT SHPT thể qua việc số giải Nobel khoa học trao cho việc phát triển kỹ thuật SHPT, ví dụ kỹ thuật đọc chuỗi DNA Sanger, kỹ thuật PCR Mullis, v.v KT SHPT yếu tố định phát triển ngành công nghiệp sinh học với giá trị 153,7 tỷ USD vào năm 2006 KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ - NGUỒN THAM KHẢO • Tạp chí, tập san: - Biotechniques,Nature Methods,Methods in Molecular Biology, v.v., • Trên Internet: - http://www.protocol-online.org/prot/ Molecular_Biology/index.html - http://biowww.net/techniques/ • Tại chỗ: 1/ Trần Thị Xô, Nguyễn Thị Lan, Cơ sở di truyền công nghệ gen, NXB KHKT, 2004 2/ Khuất Hữu Thanh, Cơ sở di truyền phân tử kĩ thuật gen, NXB KHKT, 2003 3/ Nguyễn Thị Lang, Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học, NXB Nông nghiệp, TPHCM, 2002 4/ Phạm Trần Vĩnh Phú, tập giảng Kỹ thuật Sinh học Phân tử 1.1 Chiết tách DNA từ loại tế bào • Bước 1: phá vỡ màng mô, tế bào, màng nhân tế bào để thu dung dịch có chứa DNA Cách phá vỡ dùng biện pháp học, hóa học hay kết hợp hai Điều kiện cụ thể tùy loại tế bào • Bước 2: tách DNA khỏi protein, lipid, polysaccharide di kèm dung dịch biện pháp chích ly phenol chloroform, chích ly dung dịch muối bão hòa, hấp phụ rửa DNA chất silicat, v.v • Bước 3: kết tủa cô đặc DNA Ethanol (EtOH), isopropanol, hỗn hợp ethanol-acetate, v.v 1.2 Kỹ thuật điện di DNA ứng dụng nghiên cứu xác định chuỗi gen Nguyên lý chung - Điện di kỹ thuật dùng thí nghiệm để phân tích đại phân tử tích điện dựa theo kích thước (và cấu hình số trường hợp) chúng Việc phân tách DNA thực thông qua trường tĩnh điện cấu trúc gel - Trong PTN CNSH, kỹ thuật điện di dùng để tách ly, phát DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế, DNA sản phẩm PCR - Ứng dụng điện di gel agarose: + Ước lượng kích thước phân tử DNA sau thực phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập đồ hạn chế DNA tạo dòng, v.v.) + Phân tích sản phẩm PCR (ví dụ: chẩn đoán di truyền phân tử in dấu di truyền, v.v.) + Phân tách DNA hệ gen cắt hạn chế - Ưu điểm: Gel rót dễ dàng, không gây biến tính mẫu, mẫu dễ thu hồi - Nhược điểm: Gel agarose bị nóng chảy trình điện di, tiêu hao đệm, dạng khác nucleic acid chạy không ổn định Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di gel agarose Kích thước phân tử DNA Nồng độ agarose Bảng 0.1 Các thông số điện di DNA gel agarose Cấu hình DNA: Nếu phân tử DNA mạch thẳng, độ di chuyển chúng phụ thuộc vào kích thước phân tử Plasmid DNA thường dạng siêu xoắn (vòng đóng) dạng chúng di chuyển NHANH HƠN phân tử mạch thẳng có kích thước Hoặc plasmid DNA dạng vòng đứt (1 nhánh bị cắt, nhánh không cắt), di chuyển CHẬM HƠN phân tử mạch thẳng kích thước 1.2.3 Các bước tiến hành kỹ thuật điện di Hình 0.2 Sơ đồ minh họa bước điện di gel agarose 1.2.3.1 Chế tác gel agarose - Bước 1: Cho đủ lượng agarose cần pha vào dung dịch TAE 1X bình tam giác theo bảng 0.1 để có độ phân li nucleic acid thích hợp - Bước 2: Gia nhiệt cách hấp phút nồi hấp cao áp 1150C vi sóng - Bước 3: Cho vào chậu bảo ôn ~500C dịch gel đạt đến khoảng 50 – 600C cho vào gel lượng dung dịch ethidium bromide để có hàm lượng cuối chất màu 50 µg/ml - Bước 4: Rót gel vào khuôn chắn hai đầu băng dán kẹp, cài sẵn lược (comb) đặt mặt phẳng - Bước 5: Chờ gel rắn hoàn toàn cẩn thận tháo lược khỏi gel 1.2.3.2 Điện di - Bước 1: Tháo gel khỏi kẹp băng chắn, đặt khuôn gel chậu điện di ngang, rót dung dịch đệm vào cho ngập gel, ý đầu có lỗ lược nằm phía cathode - Bước 2: Pha nucleic acid cần điện di với dung dịch Loading dye 6X Dịch màu giúp nucleic acid tải vào lỗ lược nằm gọn có màu rõ ràng Dung dịch màu tải mẫu 6X (dịch nạp mẫu) chứa 30% glycerol, 0,25% bromophenol blue (BPB) 0,25% xylencyanol (XC) - Bước 3: Dùng micropipet hút mẫu DNA nhỏ vào lỗ lược - Bước 4: Bật điện chiều để thực điện di Cường độ dòng điện khoảng 50-150V tùy loại thiết bị điện di Thời gian điện di phụ thuộc vào độ lớn DNA, nồng độ agarose gel cường độ dòng điện Kiểm tra băng DNA - Nếu điện di DNA gel có pha sẵn ethidium bromide chiếu tia tử ngoại phát băng DNA trình điện di sau điện di Kiểu dạng (pattern) băng phụ thuộc vào thành phần DNA có mẫu cần điện di - Nếu không cho trước ethidium bromide sau điện di cần ngâm gel 30 - 60 phút dung dịch thuốc nhuộm nồng độ 0,5 µg/ml - Nếu cần chụp ảnh lưu tư liệu dùng máy ảnh pollaroid với ống kính có phin lọc ánh sáng thích hợp với film pollaroid 667, dùng thiết bị phân tích gel số hóa (gel documentation system) 1.3.1 Điện di acid nucleic Acrylamide (%) 3.5 12 15 20 Hiệu phân tách (bp) 1000-2000 80-500 60-400 40-200 25-150 6-100 1.3.1.1 Chuẩn bị gel polyacrylamide không biến tính Chuẩn bị dung dịch sau: - 30% acrylamide (bao gồm bis-acrylamide) - TBE 1X - 10% ammonium persulphate Lau hai kính dùng làm khuôn gel miếng đệm KOH/methanol ethanol Xử lý bề mặt hai kính dung dịch silicon để ngăn gel dính chặt vào hai kính gây rách gel lúc lấy khỏi khuôn sau điện di xong 3 Tính toán thể tích dung dịch dùng để tạo polyacrylamide gel sở kích thước kính, độ dày miếng đệm Dung dịch Nồng độ gel (%) 30% acrylamide 3.5 11.6 16.6 26.6 15 40 20 66.6 Nước 67.6 62.7 52.7 39.3 12.7 TBE 1X 20 20 20 20 20 Amonium persulphate 10% 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 Polymer hóa acrylamide khoảng 60 phút nhiệt độ phòng, bổ sung thêm dung dịch tạo gel thấy gel co vào nhiều Sau polymer hóa hoàn toàn, rút lược cẩn thận, tháo băng dính khỏi đáy khuôn gel Gắn khuôn gel vào buồng điện di làm đầy buồng điện di đệm TBE 1X, dùng Pasteur pipette để phá bọt khí khỏi đáy gel giếng đệm TBE 1X Trộn mẫu DNA với lượng thích hợp đệm gel-loading dye 6X Đặt mẫu vào giếng micropipette Hamilton syringe Nối buồng điện di với nguồn Polyacrylamide gel không biến tính thường chạy điện di khoảng - V/cm Chạy gel thuốc nhuộm thị dịch chuyển đến vị trí mong muốn Tắt nguồn, lấy khuôn gel đặt lên bàn Tháo kính nhỏ mặt trước ra, kính lớn phía sau dùng làm giá đỡ, chuẩn bị nhuộm gel 1.3.1.2 Phát DNA gel polyacrylamide Nhuộm ethidium bromide - Ngâm nhẹ gel với kính đỡ vào dung dịch nhuộm (0,5 µg/mL EtBr TBE 1X) Cho vừa đủ dung dịch nhuộm phủ hoàn toàn lên bề mặt gel - Sau nhuộm 30-45 phút nhiệt độ phòng, lấy gel kính đỡ ra, cẩn thận thấm khô bề mặt gel giấy thấm Kimwipe Phủ lên bề mặt gel giấy nylon (Saran wrap), tránh tạo bọt khí nếp gấp Saran wrap - Sau lật ngược gel đặt máy soi tử ngoại UV transilluminator, lấy kính đỡ để tiến hành chụp ảnh 3 Phóng xạ tự ghi - Không cố định, làm ẩm gel: Được dùng muốn quan sát kết điện di + Bước : Gói gel với kính đỡ giấy nylon Saran wrap Đánh dấu mực phóng xạ lên bề mặt Saran wrap + Bước : Lật ngược gel ủ với phim X-quang (tiến hành phòng tối) -700C khoảng thời gian thích hợp - Cố định, làm khô gel : + Bước : Ngâm gel với kính đỡ acetic acid 7% phút Lấy gel khỏi thuốc hãm màu cách cẩn thận cách cầm nhẹ kính khỏi chất lỏng + Bước : Rửa nhanh gel nước khử ion Dùng giấy thấm Kimwipe để thấm khô bề mặt gel Bọc gel kính đỡ Saran wrap, thiết kế phóng xạ tự ghi Một cách khác làm khô gel giấy Whatman 3MM cách dùng máy làm khô gel (sấy 800C điều kiện chân không từ 1-2 giờ) Làm khô gel cần thiết gel chứa DNA đánh dấu đồng vị phát xạ yếu 35S lượng nhỏ 32P (cần phải ủ phim 24 lâu hơn) [...]... hợp với film pollaroid 667, hoặc dùng thiết bị phân tích gel số hóa (gel documentation system) 1. 3 .1 Điện di acid nucleic Acrylamide (%) 3.5 5 8 12 15 20 Hiệu quả phân tách (bp) 10 00-2000 80-500 60-400 40-200 25 -15 0 6 -10 0 1. 3 .1. 1 Chuẩn bị gel polyacrylamide không biến tính 1 Chuẩn bị các dung dịch sau: - 30% acrylamide (bao gồm bis-acrylamide) - TBE 1X - 10 % ammonium persulphate 2 Lau sạch hai tấm kính... chuyển CHẬM HƠN phân tử mạch thẳng cùng kích thước 1. 2.3 Các bước tiến hành kỹ thuật điện di Hình 0.2 Sơ đồ minh họa các bước điện di trên gel agarose 1. 2.3 .1 Chế tác gel agarose - Bước 1: Cho đủ lượng agarose cần pha vào dung dịch TAE 1X trong một bình tam giác theo bảng 0 .1 để có độ phân li nucleic acid thích hợp - Bước 2: Gia nhiệt bằng cách hấp 5 phút trong nồi hấp cao áp ở 11 50C hoặc bằng vi sóng... 0 .1 Các thông số điện di DNA bằng gel agarose 3 Cấu hình DNA: Nếu các phân tử DNA đều là mạch thẳng, thì độ di chuyển của chúng chỉ phụ thuộc vào kích thước phân tử Plasmid DNA thường ở dạng siêu xoắn (vòng đóng) và ở dạng này chúng di chuyển NHANH HƠN các phân tử mạch thẳng có cùng kích thước Hoặc nếu plasmid DNA ở dạng vòng đứt (1 nhánh bị cắt, nhánh kia không cắt), thì nó sẽ di chuyển CHẬM HƠN phân. .. tích của các dung dịch dùng để tạo polyacrylamide gel trên cơ sở kích thước tấm kính, độ dày của miếng đệm Dung dịch Nồng độ gel (%) 30% acrylamide 3.5 11 .6 5 8 16 .6 26.6 15 40 20 66.6 Nước 67.6 62.7 52.7 39.3 12 .7 TBE 1X 20 20 20 20 20 Amonium persulphate 10 % 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 4 Polymer hóa acrylamide trong khoảng 60 phút ở nhiệt độ phòng, bổ sung thêm dung dịch tạo gel nếu thấy gel co vào nhiều 5 Sau... và đặt lên bàn Tháo tấm kính nhỏ ở mặt trước ra, tấm kính lớn ở phía sau được dùng làm giá đỡ, và chuẩn bị nhuộm gel 1. 3 .1. 2 Phát hiện DNA trong gel polyacrylamide 1 Nhuộm bằng ethidium bromide - Ngâm nhẹ gel cùng với tấm kính đỡ vào trong dung dịch nhuộm (0,5 µg/mL EtBr trong TBE 1X) Cho vừa đủ dung dịch nhuộm phủ hoàn toàn lên bề mặt gel - Sau khi nhuộm 30-45 phút ở nhiệt độ phòng, lấy gel và tấm... và làm đầy buồng điện di bằng đệm TBE 1X, dùng Pasteur pipette để phá các bọt khí ra khỏi đáy gel và các giếng bằng đệm TBE 1X 6 Trộn các mẫu DNA với một lượng thích hợp của đệm gel-loading dye 6X Đặt mẫu vào trong giếng bằng micropipette hoặc Hamilton syringe 7 Nối buồng điện di với bộ nguồn Polyacrylamide gel không biến tính thường chạy điện di trong khoảng 1 - 8 V/cm Chạy gel cho đến khi thuốc nhuộm... gel vào khuôn đã được chắn hai đầu bằng băng dán hoặc bằng kẹp, đã cài sẵn lược (comb) và đặt trên mặt phẳng - Bước 5: Chờ cho đến khi gel rắn hoàn toàn thì cẩn thận tháo lược ra khỏi gel 1. 2.3.2 Điện di - Bước 1: Tháo bản gel ra khỏi kẹp hoặc băng chắn, đặt khuôn gel trong chậu điện di ngang, rót dung dịch đệm vào cho ngập gel, chú ý đầu có lỗ lược nằm ở phía cathode - Bước 2: Pha nucleic acid cần... lỗ răng lược - Bước 4: Bật điện một chiều để thực hiện điện di Cường độ dòng điện khoảng 50 -15 0V tùy loại thiết bị điện di Thời gian điện di phụ thuộc vào độ lớn của DNA, nồng độ agarose của gel và cường độ dòng điện Kiểm tra băng DNA - Nếu điện di DNA trong gel có pha sẵn ethidium bromide thì khi chiếu tia tử ngoại cũng có thể phát hiện được các băng DNA trong quá trình điện di cũng như sau khi điện... nylon (Saran wrap), tránh tạo ra bọt khí hoặc nếp gấp của Saran wrap - Sau đó lật ngược gel và đặt nó trên máy soi tử ngoại UV transilluminator, lấy tấm kính đỡ ra để tiến hành chụp ảnh 3 Phóng xạ tự ghi - Không cố định, làm ẩm gel: Được dùng khi chỉ muốn quan sát kết quả điện di + Bước 1 : Gói bản gel cùng với tấm kính đỡ trong giấy nylon Saran wrap Đánh dấu bằng mực phóng xạ lên bề mặt Saran wrap... wrap Đánh dấu bằng mực phóng xạ lên bề mặt Saran wrap + Bước 2 : Lật ngược gel và ủ với phim X-quang (tiến hành trong phòng tối) ở -700C trong khoảng thời gian thích hợp - Cố định, làm khô gel : + Bước 1 : Ngâm gel cùng với tấm kính đỡ trong acetic acid 7% trong 5 phút Lấy gel khỏi thuốc hãm màu một cách cẩn thận bằng cách cầm nhẹ tấm kính ra khỏi chất lỏng + Bước 2 : Rửa nhanh gel trong nước khử ion ... số hóa (gel documentation system) 1. 3 .1 Điện di acid nucleic Acrylamide (%) 3.5 12 15 20 Hiệu phân tách (bp) 10 00-2000 80-500 60-400 40-200 25 -15 0 6 -10 0 1. 3 .1. 1 Chuẩn bị gel polyacrylamide không... Dung dịch Nồng độ gel (%) 30% acrylamide 3.5 11 .6 16 .6 26.6 15 40 20 66.6 Nước 67.6 62.7 52.7 39.3 12 .7 TBE 1X 20 20 20 20 20 Amonium persulphate 10 % 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 Polymer hóa acrylamide... agarose - Bước 1: Cho đủ lượng agarose cần pha vào dung dịch TAE 1X bình tam giác theo bảng 0 .1 để có độ phân li nucleic acid thích hợp - Bước 2: Gia nhiệt cách hấp phút nồi hấp cao áp 11 50C vi sóng