Chuong 2 sinh học phân tử

CHƯƠNG NGUYÊN LÝ VÀ KỸ THUẬT TÁCH DÒNG Nguyên lý: Quá trình phân tách đoạn DNA định trước thu nhận nhiều phiên in vitro Mục đích: • Thiết lập ngân hàng gen • Thiết lập ngân hàng cDNA • Sản xuất protein, enzyme, vaccine, kháng sinh, v.v Cách tiến hành dòng hóa - Bước 1: Tách chiết xử lý đoạn DNA cần tạo dòng - Bước 2: Chọn xử lý vector - Bước 3: Tạo vector tái tổ hợp (DNA tái tổ hợp), thiết kế vector-DNA nhân dòng - Bước 4: Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào vật chủ - Bước 5: Nuôi cấy, tạo dòng xác định dòng cần tìm - Bước 6: Kiểm tra thu nhận sản phẩm gen tái tổ hợp Bước 1: Tách chiết xử lý đoạn DNA cần tạo dòng • Các DNA cần tạo dòng thường đoạn DNA chứa gene phần gene, phân đoạn DNA gene, oligonucleotides tổng hợp hóa học Sản phẩm tạo dòng phân lập lại đưa vào vector mới, trình gọi tạo dòng “thứ cấp” (subcloning) • Xác định DNA cần tạo dòng theo mục đích sử dụng cụ thể sản phẩm tạo dòng Ví dụ để nghiên cứu đặc tính hay tạo sản phẩm protein gene định, hay để giải mã gene 2.1 Tạo dòng cho gene định • Vấn đề: Tách gene cần thiết khỏi DNA khác gene nghiên cứu Æ Không đơn giản A/ Biết thông tin chuỗi DNA gene Ví dụ biết vị trí gene gene giải mã Æ tìm sở liệu gene thông tin chuỗi DNA gene khu vực “đầu nguồn” “cuối nguồn” Hoặc chuỗi DNA gene tương tự sinh vật “họ hàng” hay chuỗi protein mã hóa gene 2.1 Tạo dòng cho gene định A/ Biết thông tin chuỗi DNA gene (tiếp) Æ Thiết kề mồi PCR đặc hiệu để nhân xác khu vực (chuỗi DNA) gene nghiên cứu từ tách khỏi đoạn DNA khác (Sẽ học kỹ phần kỹ thuật PCR) 2.1 Tạo dòng cho gene định B/ Chưa biết thông tin chuỗi DNA gene ÆXây dựng thư viện DNA (DNA library): thu nhận phân đoạn DNA từ sinh vật nghiên cứu tạo dòng cho phân đoạn vector thích hợp Thư viện DNA tập hợp dòng (clones), dòng chứa phần gene sinh vật nghiên cứu Mảnh DNA chứa gene cần nghiên cứu tìm qua trình tìm kiếm, chọn lọc dùng thư viện DNA Thư viện DNA cần đủ lớn để đảm bảo có dòng chứa gene ta quan tâm 2.1.1 Xây dựng thư viện DNA • Có loại thư viện bản: genomic (bộ gene) cDNA (complementary DNA- DNA tương thích) 1/ Thư viện genomic DNA: tập hợp dòng tái tổ hợp đại diện cho toàn bộ gene sinh vật định Thư viện không chứa khu vực mã hóa protein gene mà chứa khu vực DNA gene có vai trò điều khiển hoạt động gene 2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA Toàn bộ gene DNA sinh vật thu nhận, phân cắt mảnh nhỏ tạo dòng cho mảnh nhỏ Thư viện genomic DNA Vector BamHI Bộ gene 2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA • Phân cắt gene để xây dưng thư viện a/ phương pháp học (DNA shearing) dùng lực học (thông qua lực thủy động học, vi sóng) để phân cắt phân tử DNA mảnh nhỏ ngẫu nhiên Nhược điểm: có khoảng phân bố kích thước mảnh DNA rộng, làm hỏng cấu trúc hóa học mảnh DNA, độ lặp lại thấp, khó ghép thẳng vào vector (do tạo đầu tù mảnh DNA) Một số thiết bị phương pháp thực nghiệm khắc phục nhược điểm 2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA b/ Phân cắt gene enzyme giới hạn: Các yếu tố cần ý để tạo dòng cho gene: • Số dòng: xác định thư viện cần dòng để đảm bảo có chứa gene ta quan tâm Tính xác suất: N= ln(1-P)/ ln(1- f/g) (1) đó: N- số dòng, P- xác suất gene có mặt, f- kích thước trung bình mảnh DNA, g- kích thước gene f – phụ thuộc vào kích thước điểm nhận dạng enzyme giới hạn 2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA b/ Phân cắt gene enzyme giới hạn: Công thức (1) giả sử phần khác gene có hội tạo dòng thành công Do số nguyên nhân( ví dụ xuất ngẫu nhiên điểm giới hạn nên gene nằm mảnh DNA kích thước lớn dẫn đến có khả xuất thư viện DNA), giả định thường sai người ta phải chuẩn bị số dòng thư viện gấp 2-3 lần số dòng lý thuyết cần có để đảm bảo có sác xuất cao tìm thầy gene cần thiết 2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA b/ Phân cắt gene enzyme giới hạn: • dùng phân cắt không toàn bộ: Nếu gene cần nghiên cứu chứa hay nhiều điểm nhận dạng enzyme giới hạn dùng để xây dựng thư viện, gene bị chia cắt thành hay nhiều dòng không phát chọn lọc từ thư viện Do đó, thư viện genomic DNA thường xây dựng cắt phân cắt không toàn enzyme giới hạn 2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA • dùng phân cắt không toàn bộ: B: điểm giới hạn enzyme BamHI, S: điểm giới hạn enzyme Sau3AI (a)- phần gene có chứa gene có điểm B S; (b)- thư viện tạo phân cắt toàn dùng enzyme BamHI; (c)- thư viện tạo phân cắt không toàn dùng enzyme Sau3AI 2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA • dùng phân cắt không toàn bộ: Để thực việc phân cắt không toàn phản ứng giới hạn diễn điều kiện không tối ưu để enzyme giới hạn không cắt hết tất điểm giới hạn Thường người ta giảm nồng độ enzyme thời gian phản ứng giảm hai yếu tố 2.1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA • Ưu điểm thư viện genomic DNA: Có khả thu nhận đầy đủ đại diện gene, thường đảm bảo tạo dòng cho gene cần nghiên cứu yếu tố điều khiển • Nhược điểm thư viện genomic DNA: - Đòi hỏi số dòng tạo tương đối lớn, chi phí cao thực gene lớn gene sinh vật bậc cao - Các mảnh DNA thu từ sinh vật có nhân tế bào thường có chứa intron không biểu biến nạp vào vi khuẩn nên đòi hỏi biện pháp chọn lọc đặc biệt 2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA • Để khắc phục nhược điểm thư viện genomic DNA, người ta xây dựng thư viện DNA từ mRNA Chỉ phần gene phiên mã thành mRNA loại tế bào định giai đoạn phát triển định mRNA intron (nếu có) loại bỏ • Không thể tạo dòng trực tiếp từ mRNA, mRNA có nhánh nucleic acid gắn trực tiếp vào vector (vì chất enzyme DNA ligase) 2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA • Các bước xây dựng thư viện cDNA: a/ thu nhận mRNA b/ tổng hợp phiên DNA mRNA –tạo DNA tương hợp (cDNA) c/ cDNA gắn vào vector biến nạp vào sinh vật chủ (ví dụ E.coli) để tạo thư viện a/ thu nhận mRNA: trình: phá vỡ tế bào Æ loại bỏ tạp chất Æ phân lập toàn RNA tế bào Æ phân tách mRNA khỏi loại RNA khác tRNA, rRNA 2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA a/ thu nhận mRNA: Để phân tách mRNA khỏi loại RNA khác, người ta tận dụng đặc điểm mRNA từ sinh vật có nhân tế bào phần đuôi (đầu 3’) chúng có đoạn poly-A nên phân tách mRNA cách cho RNA tổng số tế bào chẩy qua cột có oligonucleotide poly-T gắn cố định 2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA a/ thu nhận mRNA: (a) toàn RNA tế bào chẩy qua cột có chứa oligonucleotide polyT cố định; (b) đuôi polyA mRNA gắn với polyT cố định cột; (c) RNA khác rửa khỏi cột; (d) mRNA tinh rửa khỏi cột dd đệm với nồng độ muối loãng 2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA b/ tổng hợp cDNA: (a) dùng mồi oligonucleotide polyT để bắt đầu phản ứng tổng hợp cDNA dùng mRNA làm khuôn xúc tác Reverse transcriptase; (b)enzyme RNAse H thêm vào để loại bỏ phần nhánh mRNA; (c) phần nhỏ RNA lại mồi cho phản ứng tổng hợp nhánh DNA DNA polymerase I cac mồi RNA bị loại bỏ enzyme này; (d) DNA ligase dùng để nối kết vị trí cắt cón sót lại tạo nhánh DNA hoàn chỉnh (e) 2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA c/ gắn cDNA vào vector: Điểm khác cDNA so với mảnh DNA phân cắt đa số enzyme giới hạn cDNA đầu dính, khó gắn trực tiếp vào nhiều loại vector Một giải pháp thường dùng cho vấn đề gắn thêm đoạn nối (linker) đoạn thích ứng (adaptor) vào hai đầu cuối cDNA 2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA c/ gắn cDNA vào vector: • gắn đoạn nối (linker): điểm giới hạn BamHI gắn linker ligase cắt BamHI (a) linker tạo nhánh oligonucleotide tương hợp lai tạo thành phân tử nhánh đầu tù (b) có chứa điểm giới hạn; (c) pha trộn với dd có nồng độ cao mảnh DNA đầu tù (cDNA) nhiều linker nối vào đầu phân tử DNA; (d) cắt phân tử tạo enzyme giới hạn loại bỏ linker dôi tạo sản phẩm có đầu tù Nhược điểm: mảnh cDNA có chứa điểm giới hạn bị phân cắt 2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA c/ gắn cDNA vào vector: • gắn đoạn thích ứng (adaptor): điểmđầu giớitùhạn củaBamHI BamHI (a) adaptor tạo oligonucleotide giống nhóm 5’ P để chúng không nối đuôi vào (b) phân tử lai tạo cắt enzyme giới hạn để tạo phân tử adaptor có đầu tù đầu dính (c); (d) adaptor nối vào đầu tù cDNA 2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA • Nhược điểm thư viện cDNA: Không có yếu tố điều khiển trình giải mã gene nên có khó biểu gene cần nghiên cứu sinh vật chủ khác [...]... bởi 2 nhánh oligonucleotide tương hợp lai tạo thành phân tử 2 nhánh đầu tù (b) có chứa điểm giới hạn; (c) pha trộn với dd có nồng độ cao các mảnh DNA đầu tù (cDNA) nhiều linker sẽ được nối vào mỗi đầu của phân tử DNA; (d) cắt phân tử mới tạo ra bằng enzyme giới hạn sẽ loại bỏ các linker dôi ra và tạo ra sản phẩm có đầu tù Nhược điểm: nếu trong mảnh cDNA cũng có chứa điểm giới hạn thì nó cũng bị phân. .. bị phân cắt 2. 1.1 .2 Xây dựng thư viện cDNA c/ gắn cDNA vào vector: • gắn đoạn thích ứng (adaptor): điểmđầu giớitùhạn củaBamHI BamHI (a) adaptor tạo bởi 2 oligonucleotide giống nhau và không có nhóm 5’ P để chúng không nối đuôi vào nhau (b) phân tử lai tạo được cắt bởi enzyme giới hạn để tạo ra phân tử adaptor có 1 đầu tù và 1 đầu dính (c); (d) adaptor được nối vào đầu tù của cDNA 2. 1.1 .2 Xây dựng thư... dựng bằng cắt phân cắt không toàn bộ bằng enzyme giới hạn 2. 1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA • dùng phân cắt không toàn bộ: B: điểm giới hạn của enzyme BamHI, S: điểm giới hạn của enzyme Sau3AI (a)- một phần của bộ gene có chứa 2 gene có các điểm B và S; (b)- thư viện tạo ra bằng phân cắt toàn bộ dùng enzyme BamHI; (c)- thư viện tạo ra bằng phân cắt không toàn bộ dùng enzyme Sau3AI 2. 1.1.1 Xây dựng... các loại RNA khác như tRNA, rRNA 2. 1.1 .2 Xây dựng thư viện cDNA a/ thu nhận mRNA: Để phân tách mRNA khỏi các loại RNA khác, người ta tận dụng đặc điểm của mRNA từ các sinh vật có nhân tế bào là phần đuôi (đầu 3’) của chúng có đoạn poly-A nên có thể phân tách mRNA ra bằng cách cho RNA tổng số của tế bào chẩy qua cột có các oligonucleotide poly-T gắn cố định 2. 1.1 .2 Xây dựng thư viện cDNA a/ thu nhận... nhận dạng từ 1000 bp trở lên Loại II Phổ biến Cắt 2 nhánh DNA ở 1 vị trí nhất định là điểm nhận dạng (cỡ 4-8bp) Ứng dụng rất nhiều Loại III Hiếm gặp Cắt 1 nhánh DNA, ở vị trí 24 26 bp phía dưới điểm nhận dạng Ít ứng dụng 2. 1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA • Phân cắt bộ gene để xây dưng thư viện b/ bằng enzyme giới hạn: Tác động của enzyme giới hạn EcoRI 2. 1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA • Phản ứng... nhánh DNA mới hoàn chỉnh (e) 2. 1.1 .2 Xây dựng thư viện cDNA c/ gắn cDNA vào vector: Điểm khác của cDNA so với các mảnh DNA được phân cắt bởi đa số enzyme giới hạn là các cDNA không có đầu dính, do đó khó gắn trực tiếp vào nhiều loại vector Một giải pháp thường dùng cho vấn đề này là gắn thêm các đoạn nối (linker) hoặc đoạn thích ứng (adaptor) vào hai đầu cuối của cDNA 2. 1.1 .2 Xây dựng thư viện cDNA c/... enzyme DNA ligase) 2. 1.1 .2 Xây dựng thư viện cDNA • Các bước xây dựng thư viện cDNA: a/ thu nhận các mRNA b/ tổng hợp phiên bản DNA của các mRNA –tạo ra các DNA tương hợp (cDNA) c/ các cDNA được gắn vào vector và biến nạp vào sinh vật chủ (ví dụ E.coli) để tạo ra thư viện a/ thu nhận mRNA: quá trình: phá vỡ tế bào Æ loại bỏ các tạp chất cơ bản Æ phân lập toàn bộ RNA của tế bào Æ phân tách mRNA khỏi... chuẩn bị số dòng trong thư viện gấp 2- 3 lần số dòng lý thuyết cần có để đảm bảo có sác xuất cao tìm thầy gene cần thiết 2. 1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA b/ Phân cắt bộ gene bằng enzyme giới hạn: • dùng phân cắt không toàn bộ: Nếu gene cần nghiên cứu chứa 1 hay nhiều hơn điểm nhận dạng của enzyme giới hạn dùng để xây dựng thư viện, thì gene đó sẽ bị chia cắt thành 2 hay nhiều dòng và sẽ không được... tạo ra tương đối lớn, do đó chi phí cao nhất là khi thực hiện đối với các bộ gene lớn như bộ gene của các sinh vật bậc cao - Các mảnh DNA thu được từ sinh vật có nhân tế bào thường có chứa intron và sẽ không được biểu hiện khi biến nạp vào vi khuẩn nên đòi hỏi biện pháp chọn lọc đặc biệt 2. 1.1 .2 Xây dựng thư viện cDNA • Để khắc phục các nhược điểm trên của thư viện genomic DNA, người ta có thể xây.. .2. 1.1.1 Xây dựng thư viện genomic DNA • Phân cắt bộ gene để xây dưng thư viện b/ bằng enzyme giới hạn: Enzyme giới hạn – các endonuclease loại II Chúng nhận biết và cắt các điểm nhất định trong chuỗi DNA Phân loại Mức Phổ biến Điểm tác dụng Ứng dụng trong công nghệ DNA tái tổ hợp Loại I Ít hơn loại II Cắt 2 nhánh DNA ở vị trí Ít ứng dụng không nhất định