Nghiên cứu hoạt độ một số emzim của hạt đậu tương nảy mầm trong điều kiện áp suất thẩm thấu khác nhau

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt Bảng 1: Tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu tương Bảng 2: Hoạt độ của enzim proteaza Bảng 3: Hoạt độ của enzim lipaza Bảng 4: Hoạt độ của enzim α_amilaza H

khoa sinh - ktnn

**************

bùi thanh tâm

Nghiên cứu hoạt một số

enzim của hạt đậu tương nảy mầm trong điều kiện áp suất

thẩm thấu khác nhau

khóa luận tốt nghiệp đại học

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

hà nội - 2010

Lời cảm ơn

Để hoàn thành bản khoá luận này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sự kính trọng sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Mã đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô Khoa Sinh - KTNN, thầy Nguyễn Văn Mùi_Giảng viên ĐHKHTN Trường ĐHQG Hà Nội, phòng thực hành Sinh lý thực vật, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ - Trường ĐHSP Hà Nội

2 đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em thực hiện đề tài này

Lần đầu làm quen với nghiên cứu khoa học, đề tài của tôi không tránh khỏi những thiếu sót Rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài của tôi được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2010

Sinh viên thực hiện

Bùi Thanh Tâm

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu trong khoá luận này:

 Là kết quả của tôi, được thực hiện tại trường ĐHSP Hà Nội 2

 Hoàn toàn không trùng lặp hoặc sao chép kết quả của người khác

Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2010

Sinh viên

Bùi Thanh Tâm

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt

Bảng 1: Tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu tương

Bảng 2: Hoạt độ của enzim proteaza

Bảng 3: Hoạt độ của enzim lipaza

Bảng 4: Hoạt độ của enzim α_amilaza

Hình 1: Tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu tương

Hình 2: Sự biến đổi hoạt độ proteaza

Hình 3: Sự biến đổi hoạt độ lipaza

Hình 4: Sự biến đổi hoạt độ α_amilaza

Mở đầu

1 Lí do chọn đề tài

Trải qua suốt quá trình lịch sử, loài người đã sử dụng khoảng 3000 loài thực vật để làm lương thực và tối thiểu cũng tới 150 loài thực vật đã trở thành hàng hoá trong đó tập trung vào 30 loại cây trồng những loài này được xem

là “bức tường ngăn cách” loài người với sự nghèo đói Trong đó không thể không kể đến đậu tương

Cây đậu tương (Glicine max L.Merr) là loài cây thuộc họ Đậu (Fabaceae) Cây đậu tương có nguồn gốc Châu á và được trồng cách đây

5000 năm Trong hạt đậu tương hàm lượng protein chiếm 40% đây là nguồn protein thực vật vô cùng quan trọng; hàm lượng lipit 12 - 25%; hàm lượng gluxit 10 -15%; các muối khoáng Ca, Mg, Fe, P, K, Na, S; các vitamin A, B1,

B2 , D, E, F; các enzim, sáp, nhựa, xenlulozơ Trong đậu tương có đủ các axit amin cơ bản: xistin, metionin, lizin, izolơzin, phenylalanin, triptophan, valin, [18]

Đậu tương là nguồn nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành sản xuất công nghiệp nhất là công nghiệp thực phẩm phục vụ trực tiếp cho nhu cầu của con người Hạt đậu tương là sự kết hợp độc đáo các đặc tính làm cho nó trở thành loại thực phẩm đa năng nhất trong các loại thực phẩm Sản phẩm từ hạt đậu tương được sử dụng trực tiếp dạng hạt thô hay dùng để chế biến thành các sản phẩm khác như: sữa đậu nành, bánh kẹo, đậu phụ, bột đậu, Khô dầu đậu tương sau khi ép là nguồn thức ăn tốt cho chăn nuôi [13] Đậu tương còn được dùng trong sản xuất dược liệu với nhiều vị thuốc cổ truyền

có giá trị ở nước ta [8]

Ngoài giá trị kinh tế của đậu tương đối với công nghiệp ép dầu, công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi, cây đậu tương còn có tác dụng tốt trong việc cải tạo đất chủ yếu là nhờ hoạt động cộng sinh của các vi khuẩn Rhizobium

trong các nốt sần ở rễ cây, cung cấp nitơ cho cây và một lượng lớn nitơ cho

đất

Như vậy, phát triển cây đậu tương là việc làm có ý nghĩa trên các mặt

kinh tế, nhân văn, môi trường đồng thời là yếu tố đảm bảo an ninh lương

thực và góp phần phát triển bền vững đất nước Chính vì vậy mà diện tích

đậu tương tăng nhanh trong những năm gần đây

Hiện nay cây đậu tương được trồng trên 200 quốc gia Diện tích trồng

đậu tương tập trung chủ yếu ở các nước như: Hoa Kỳ (45%), Brazil (28%),

Achentina (18%),

ở Việt Nam, đậu tương được trồng sớm nhưng năng suất chưa cao Vấn

đề cơ bản hạn chế năng suất đậu tương ở các nước nhiệt đới nói chung trong

đó có Việt Nam là điều kiện khí hậu và đất đai Nước ta nằm trong khu vực

nhiệt đới gió mùa, lượng mưa phân bố không đều giữa các vùng và các mùa

trong năm nên hạn là yếu tố thường xuyên tác động đến sinh trưởng của cây

trồng Mặt khác, Việt Nam là một quốc gia không giàu về tài nguyên đất

Diện tích đất canh tác chỉ chiếm 21% tổng diện tích đất Đất canh tác đã

hiếm nhưng chất lượng đất lại không cao Không những thế 3/4 diện tích cả

nước là những vùng đồi núi dốc dễ bị xói mòn mà ngay cả vùng đồng bằng

đất cũng có vấn đề về chất lượng Tại khu vực châu thổ các con sông, hơn 3

triệu ha đất bị nhiễm mặn, kiềm hoá, ngập lụt [1] Những vùng đất này phần

lớn chưa được sử dụng vì chưa tìm được loại cây trồng thích hợp

Để tăng năng suất đậu tương một trong các biện pháp là làm tăng khả

năng chống chịu của chúng với ngoại cảnh bằng cải tiến kĩ thuật, chọn tạo

giống mới hoặc lựa chọn những nơi trồng có điều kiện ngoại cảnh thích hợp Vì vậy cần tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu phản ứng của đậu tương

trong các điều kiện áp suất thẩm thấu khác nhau để tìm được giới hạn chịu

hạn của đậu tương và điều kiện mà cây sinh trưởng tốt nhất từ đó tăng năng

suất đậu tương

Cây trồng có phản ứng với sự thiếu nước không giống nhau Cây ở những giai đoạn khác nhau cũng có những phản ứng với sự thiếu nước khác nhau, đặc biệt giai đoạn nảy mầm rất mẫn cảm với sự thiếu nước Giai đoạn nảy mầm là thời điểm quan trọng trong chu trình sống của thực vật nói chung và của đậu tương nói riêng Những biến đổi của giai đoạn này sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển bình thường của cây về sau

Để có thể tồn tại được trong những điều kiện bất lợi trong cây trồng đã hình thành những cơ chế thích nghi khác nhau [3], một trong số đó là hình thành các hợp chất để bảo vệ cây trồng, đặc biệt là các enzim thủy phân phân giải các chất dự trữ

Trên đối tượng đậu tương, đã có một số nhà khoa học nghiên cứu như: James A.Bunce, Miquel Ribas - Carbo, Finnegan, Sheila A.Blackman, [22], [28], [30] tìm hiểu ảnh hưởng của sự thiếu nước đến quang hợp, hô hấp, sinh trưởng

ở Việt Nam, một số tác giả nghiên cứu về đậu tương như: Nguyễn Huy Hoàng, Trần Đình Long, Trần thị Phương Liên, Nguyễn Văn Mã, [3], [5], [7], [9] đánh giá khả năng chịu hạn, quang hợp, chất lượng hạt, nâng cao khả năng chịu hạn

Nghiên cứu về áp suất thẩm thấu và ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu lên thực vật nói chung và đậu tương nói riêng là vô cùng cấp thiết nhưng lại chưa được tiến hành một cách cụ thể

Xuất phát từ những lí do trên tôi lựa chọn và tiến hành đề tài: “Nghiên

cứu hoạt độ một số enzim của hạt đậu tương nảy mầm trong điều kiện áp suất thẩm thấu khác nhau”

2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

2.1 Mục tiêu

Nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ một số enzim của hạt đậu tương nảy mầm trong dung dịch đường sacarôzơ

3 ý nghĩa lí luận và thực tiễn

Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung nguồn tài liệu cho việc xác định nhanh khả năng chống chịu của đậu tương với các điều kiện môi trường khác nhau Trên cơ sở đó lựa chọn và định hướng gieo trồng trong những vùng sinh thái và mùa vụ thích hợp

Chương 1: Cơ sở lí luận của vấn đề nghiên cứu

1.1 Sự nảy mầm của hạt đậu tương

Nảy mầm là giai đoạn quan trọng trong chu trình sinh trưởng và phát triển của thực vật nói chung và đậu tương nói riêng Giai đoạn nảy mầm ảnh hưởng rất lớn tới sinh trưởng của cây sau này

quá trình nảy mầm diễn ra nhiều biến đổi sinh lí, sinh hoá trong hạt với tốc độ cao để chuẩn bị cho sự hình thành một cây non mới

Đậu tương thuộc cây Hai lá mầm nên sự nảy mầm của đậu tương cũng gồm các pha như sự nảy mầm của cây Hai lá mầm:

Pha trương hạt: khi bắt đầu nảy mầm hạt hút nước rất mạnh làm trương hạt

Pha hình thành và hoạt hoá enzim trong hạt có một lượng enzim nhất

định nhưng chủ yếu ở dạng liên kết Khi hạt hút nước enzim mới được giải phóng ở dạng tự do và bắt đầu hoạt động mạnh

Pha tích luỹ chất dinh dưỡng: ngay trong những phút ngâm trong nước đầu tiên độ hấp thụ oxi của hạt tăng lên, đặc biệt chu trình

hexozomonophotphat tăng lên nhiều lần do vậy lượng ATP tích luỹ nhiều

Pha động viên các chất dự trữ và xây dựng các chất hữu cơ đặc trưng cho cơ thể trong giai đoạn nảy mầm: các chất dinh dưỡng trong hạt chủ yếu thuộc 3 nhóm chất hữu cơ là: gluxit, protein, lipit Trong quá trình nảy mầm enzim α_amilaza tác động vào liên kết 1,4_glucozit phân giải tinh bột thành các đextrin tham gia vào quá trình hô hấp ở các dạng sacarôzơ tích luỹ ở các

tế bào trụ phôi Protein được phân giải bởi enzim proteaza thành các axit amin

và các amít Phần lớn các axit amin tạo thành được vận chuyển vào trụ phôi

để tổng hợp các phân tử protein đặc trưng cho cơ thể Enzim lipaza phân giải

lipit thành axit béo và glixerol, ngoài ra lipit được tái chuyển hoá thành gluxit cung cấp năng lượng cho hạt nảy mầm

Sự nảy mầm bắt đầu bằng sự hấp thụ nước nhờ cơ chế hút trương của hạt làm hạt trương lên Sau khi kết thúc sự ngủ nghỉ hạt bắt đầu tăng tính thuỷ hoá của keo nguyên sinh chất, giảm tính ưa mỡ và độ nhớt của keo dẫn đến những biến đổi sâu sắc và đột ngột trong quá trình trao đổi chất của hạt liên quan đế

sự nảy mầm Đặc trưng nhất là tăng mạnh mẽ hoạt tính enzim thuỷ phân phân giải polisacarit, protein và các chất phức tạp khác thành các chất đơn giản dẫn

đến sự thay đổi hoạt động thẩm thấu Các sản phẩm thuỷ phân này dùng làm nguyên liệu cho quá trình hô hấp tăng lên mạnh mẽ của phôi hạt, vừa làm tăng

áp suất thẩm thấu trong hạt giúp cho quá trình hút nước vào hạt nhanh chóng

Sự tăng hoạt tính enzim dẫn đến sự biến đổi các chất dự trữ và mức độ hoạt hoá các enzim riêng biệt phụ thuộc vào tính chất đặc trưng và thành phần hoá học của hạt Đối với đậu tương, hạt dự trữ chủ yếu là protein thì hoạt tính enzim proteaza tăng lên mạnh mẽ hơn các enzim khác Sự tăng hoạt tính enzim có lẽ là do quá trình tổng hợp mới các enzim ở trong lớp alơron hơn là quá trình hoạt hoá các enzim cũ vốn có trong hạt

Sinh trưởng của phôi: khi hạt nảy mầm phôi bắt đầu sinh trưởng Đầu tiên rễ mầm nhô ra để cố định cây, hút nước và thức ăn hoà tan Trụ dưới lá mầm duỗi ra trước khi mầm cành bắt đầu sinh trưởng và tạo cành

1.2 ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu và sự thiếu nước đến đậu tương trong giai đoạn nảy mầm

Nước là điều kiện quan trọng cho sự nảy mầm Nước tham gia vào quá trình trao đổi chất, các phản ứng sinh hoá học trong tế bào, là nguồn nguyên liệu của nhiều phản ứng Nước đảm bảo cho cây tồn tại và phát triển

Hạt khô có hàm lượng nước từ 10 - 14% thì không nảy mầm Nhờ lực hút trương nước của keo nguyên sinh mà hạt hút được nước và khi hàm lượng nước bằng 50 - 70% khối lượng hạt thì các hoạt động sống tăng lên mạnh mẽ

và phôi phát động sinh trưởng hay nảy mầm

áp suất thẩm thấu là lực gây ra sự chuyển dịch của dung môi vào tế bào qua màng sinh chất áp suất thẩm thấu không phụ thuộc vào bản chất của chất tan mà phụ thuộc vào nồng độ phân tử chất tan, nhiệt độ, sự phân li của dung dịch áp suất thẩm thấu bao gồm áp suất thẩm thấu bên trong (áp suất thẩm thấu nội bào) và áp suất thẩm thấu bên ngoài (áp suất thẩm thấu môi trường)

áp suất thẩm thấu bên trong: dịch tế bào có chứa hàm lượng lớn các chất hữu cơ là sản phẩm của quá trình trao đổi chất Các chất này trong dịch tế bào

đã tạo nên áp suất thẩm thấu cao giúp cho quá trình xâm nhập của nước vào trong tế bào bằng con đường thẩm thấu

áp suất thẩm thấu bên ngoài chủ yếu do tính mặn của môi trường gây nên Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lượng muối cao đặc biệt là NaCl, điều đó đã hạn chế khả năng hút nước dẫn đến khó khăn trong việc hút chất dinh dưỡng Nếu cây sinh trưởng trong môi trường không có muối thì nước sẽ dễ dàng thấm qua màng bán thấm để đi vào tế bào chất nhờ hiện tượng thẩm thấu đất

bị nhiễm mặn sẽ gây nên 2 tác hại đối với thực vật:

Tác hại thứ nhất, gây ra hiện tượng hạn sinh lí Hàm lượng muối cao trong đất làm cho áp suất thẩm thấu môi trường lớn Nếu áp suất thẩm thấu nội bào không thắng nổi áp suất của môi trường cây sẽ bị khô héo do nước từ trong tế bào đi ra ngoài thiếu nước nhẹ thì làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo chất nguyên sinh làm tăng quá trình già hoá tế bào khi bị khô kiệt nước nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào và mô bị tổn thương và chết

Tác hại thứ hai, liên quan đến tính gây độc của các ion đối với thực vật

Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lượng cao các ion đặc biệt Na+ và Cl-, ngoài ra còn có các ion khác: SO42-, HCO3-, Li+, hàm lượng cao các ion này đều gây hại cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật

Sự thiếu nước ở thực vật chủ yếu do hạn hán và áp suất thẩm thấu môi trường gây nên Khi thiếu nước thường làm cho tế bào mất sức căng, đỉnh sinh trưởng bị héo và các quá trình sinh lý diễn ra không bình thường, hoạt động của enzim thuỷ phân thường diễn ra nhanh hơn là enzim tổng hợp dẫn đến tế bào mất chất dinh dưỡng, đồng thời cũng gây ảnh hưởng trầm trọng đến quá trình hô hấp Khi thiếu nước cường độ hô hấp tăng nhưng hiệu quả năng lượng

bị giảm sút Thiếu nước gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng và phát triển của cây, cuối cùng ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất của chúng

Thực vật nói chung và đậu tương nói riêng sống trong điều kiện thiếu nước có khả năng chống lại hoặc hạn chế sự mất nước bằng những biến đổi hình thái hoặc những phản ứng hoá sinh phù hợp

Biến đổi hình thái được chú ý nhiều là ở bộ rễ Bên cạnh đó là sự giảm diện tích lá của đậu tương khi gặp hạn nhằm giảm sự thoát hơi nước của lá Các thay đổi hoá sinh thường liên quan đến cơ chế chống mất nước do sinh tổng hợp các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nước điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào thông qua tích luỹ các chất tan, các protein và axit amin nhờ enzim thuỷ phân là cơ chế giúp tế bào duy trì lượng nước tối thiểu Trong điều kiện thiếu nước các phản ứng hoá sinh diễn ra nhằm khử độc các sản phẩm được tạo nên trong quá trình phân giải các hợp chất cao phân tử hoặc xúc tiến phục hồi các cấu trúc bị tổn thương

Về khả năng chịu mặn của thực vật trước hết phải nói đến cơ chế tích luỹ

và duy trì nồng độ cao các chất hoà tan trong tế bào nhằm đảm bảo cạnh tranh nước với môi trường nhiễm muối và chống lại hiện tượng hạn sinh lí Hàm

lượng NaCl cao trong đất nhiễm mặn làm các loài thực vật sống thường xuyên trên đất này phải có khả năng thu nhận và tích trữ Na+, Cl- cao hơn nhiều thực vật vốn có khả năng chịu mặn

Ngoài ra còn có những thay đổi về các phản ứng sinh lí như: hô hấp, quang hợp, thoát hơi nước của lá cho phù hợp với điều kiện thiếu nước của cây

1.3 Đặc điểm một số enzim trong hạt đậu tương nảy mầm

Enzim có bản chất là protein Đến nay đã biết và phân loại được hơn

3500 enzim Ngày nay enzim được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: nghiên cứu cấu trúc phân tử, định lượng các chất trong công nghiệp, nông nghiệp, y học,

Đậu tương đang nảy mầm diễn ra quá trình phân giải các chất hữu cơ cung cấp năng lượng cho cây sinh trưởng và phát triển Enzim hoạt động chủ yếu

trong giai đoạn này là enzim thuỷ phân thuộc nhóm hiđrolaz (các enzim xúc

tác cho phản ứng thuỷ phân) như: proteaza, lipaza, α_amilaza,

Proteaza: xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptit, tạo thành peptit phân tử thấp và các axit amin Khi hạt nảy mầm protein bắt đầu được phân giải thành axit amin dưới tác dụng của enzim proteaza Proteaza trong hạt đậu tương bao gồm nhiều loại, chúng có kích thước phân tử, nhiệt độ tối ưu khác nhau, pH tối ưu là 5 (gần với pH của tế bào) Các axit amin là nguồn nguyên liệu cho quá trình tổng hợp mới các chất đồng thời góp phần tăng áp suất thẩm thấu của tế bào thực vật Proteaza tham gia trong nhiều hoạt động sống quan trọng và được sử dụng rộng rãi trong y học và nhiều ngành công nghiệp khác Foocmanđehit tác dụng với nhóm amin tạo thành dẫn xuất metilen của axit amin Chuẩn độ nhóm cacboxyl bằng kiềm từ đó tính lượng nitơ amin

tương ứng, có thể dựa vào hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu để đánh giá hoạt độ của proteaza

Lipaza: xúc tác phản ứng thuỷ phân triaxilglixerol tạo thành các axit béo

tự do và glixerol Lipaza xúc tác phản ứng thuỷ phân lần lượt từng este trong phân tử chứ không cắt đứt cả 3 liên kết este cùng một lúc Axit béo và glixerol

là nguyên liệu cho hô hấp giải phóng năng lượng và kiến tạo các thành phần của tế bào chuẩn độ lượng axit béo sinh ra bằng kiềm từ đó xác định hoạt độ lipaza

α_amilaza: phân giải liên kết 1,4_glucozit ở giữa chuỗi mạch polisacarit tạo các đextrin phân tử thấp Dưới tác dụng của enzim này dung dịch tinh bột nhanh chóng bị mất khả năng tạo màu với dung dịch iot và bị giảm độ nhớt mạnh Do đó để xác định hoạt độ của enzim α_amilaza người ta thường dựa vào sự biến đổi màu của iot khi cho tác dụng với enzim này

1.4 Tình hình nghiên cứu về ảnh hưởng của áp suất thẩm thẩm môi trường đối với thực vật nói chung và đậu tương nói riêng

Trong vài năm trở lại đây, thời tiết diễn biến bất thường đã gây tác động không nhỏ đối với trồng trọt, đặc biệt là hạn hán và sự xâm thực của nước biển làm diện tích đất nông nghiệp bị thu hẹp Theo đánh giá của ngân hàng thế giới năm 2007, Việt Nam sẽ là một trong năm nước chịu ảnh hưởng nghiêm trọng của biến đổi khí hậu do trái đất nóng lên Nước biển dâng lên 1m sẽ có 2.983 km2 đất bị ngập diện tích đất nhiễm mặn ngày càng tăng [19] Để tìm ra những loại cây trồng phù hợp cho những vùng đất nhiễm mặn, nghiên cứu về

ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đối với thực vật là một yêu cầu bức thiết Những nghiên cứu có liên quan tới áp suất thẩm thấu đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới với nhiều loại cây trồng khác nhau trong đó có đậu tương

Trên thế giới, với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kĩ thuật, đã có nhiều công trình nghiên cứu về tính chống chịu của thực vật như các nghiên cứu của các tác giả: Bates L.S (1973) [20], Barnet N.M., Naylor A.W (1966) [21], Gerelet J và cộng sự (2005) [24], Goyal K., LJ Walton (2005) [25], Ingram J, D Bartel (1996) [26], Thomashow MI (1998) [31], Xiao B., Y Huang, N Tang (2007) [33], Zhao SH và cộng sự (2000) [35], nghiên cứu về tính chịu hạn, chịu mặn và chịu lạnh ở lúa, lúa mì và thực vật nói chung

Về đậu tương cũng có một số tác giả nghiên cứu như: Whitsitt và cộng sự (1997) [32] đã cho thấy lượng nước mất trên 60% thì đậu tương không thể phục hồi được Những nghiên cứu của Matra N, Cushman J,C (1994) [27],

đã nhận thấy rằng cDNA của đehiđrin từ lá đậu tương mất nước bị phân lập,

đehiđrin là một trong những LEA với chức năng bảo vệ tế bào khi mất nước Sheila A.Blackman và cộng sự (1992) [30] đã nghiên cứu protein sốc nhiệt (HSP - heat shock protein) trong phôi mầm hạt đậu tương đang chín ở điều kiện bình thường và dưới áp suất thẩm thấu cao Kết quả nghiên cứu đã khẳng

định HSP tăng lên trong quá trình hình thành hạt và giảm khi hạt nảy mầm HSP hỗ trợ bảo vệ tế bào vào thời điểm oligosacarit chưa được tổng hợp để hỗ trợ tế bào thực hiện chức năng Fernando E P và cộng sự (2000) [23] đã nghiên cứu ảnh hưởng của muối trên hạt đậu tương nảy mầm,

ở Việt Nam, diện tích và năng suất đậu tương chưa cao do tập quán canh tác, điều kiện tự nhiên, biện pháp kĩ thuật So với bình quân chung của thế giới, năng suất đậu tương ở Việt Nam chỉ đạt 57%[18]

Nghiên cứu tính chống chịu của cây trồng ở Việt Nam được tiến hành sâu rộng ở các đối tượng lúa, đậu tương, lạc, thuốc lá, nhãn, [1], [6], [10], [12], [16] trong đó đậu tương là cây trồng được chú trọng khá nhiều Chẳng hạn: nghiên cứu đặc điểm di truyền và khả năng chịu hạn ở con lai đậu tương

F1 (Nguyễn Huy Hoàng) [4], nghiên cứu mối quan hệ giữa tính chịu hạn với

thành phần điện di protein của đậu tương (Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải, ) [7], khả năng chịu hạn của một số giống đậu tương (Nguyễn Văn Mã, Nguyễn Văn Đính, Hoàng Thị Thuỳ Dương, Nguyễn Thị Hồng Thắm) [11], sự biến đổi của hoạt độ enzim proteaza, amilaza và hàm lượng prolin của cây đậu tương khi gặp hạn ở thời kì ra hoa (Nguyễn Thị Thanh Thuỷ, Nguyễn Văn Mã) [17], Các kết quả nghiên cứu đã được ứng dụng trong sản xuất và chọn tạo được nhiều giống đậu tương mới có năng suất cao, phẩm chất tốt phù hợp với điều kiện khí hậu và canh tác của Việt Nam

Tại trung tâm nghiên cứu và thực nghiệm đậu đỗ, Viện khoa học kĩ thuật Nông nghiệp Việt Nam, nhiều giống đậu tương nhập nội và giống địa phương

đã được đánh giá khả năng chịu hạn, chịu nóng bằng một số biện pháp: cho hạt nảy mầm trong dung dịch đường sacarôzơ, phương pháp dùng nhiệt độ cao, Kết quả trên 1000 mẫu giống nhập nội đã phân lập được 185 mẫu giống

có khả năng chịu hạn trồng vụ đông, 68 mẫu giống chịu hạn tổng hợp, 65 mẫu giống chịu nóng khá, 14 mẫu giống vừa chịu nóng chịu hạn tốt và vừa có

nhiều đặc tính kinh tế quan trọng khác [3]

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây đậu tương thuộc giống DT96 do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp

Giống đậu tương DT96 do nhóm tác giả Viện Di truyền Nông nghiệp chọn tạo bằng phương pháp lai hữu tính giữa 2 giống phổ biến trong sản xuất

là DT90 và DT84 DT96 kết hợp được nhiều đặc tính tốt của 2 giống: chịu nóng tốt như DT84 và chịu lạnh như DT90 Ngoài ra còn nhiều đặc điểm ưu việt hơn nhiều lần DT84 và DT90 về chất lượng hạt thương phẩm, tính kháng sâu bệnh

DT96 có thời gian sinh trưởng ngắn (90 - 98 ngày), phù hợp trồng thuần Cây cao 45 - 58cm, thân có 12 - 15 đốt, sinh trưởng hữu hạn, phân cành vừa phải, lá hình tim nhọn, màu xanh sáng, lông nâu Hạt màu vàng sáng, rốn hạt màu trắng, hạt to, khối lượng 1000 hạt đạt 190 - 220g, tỉ lệ protein 42,86%, dầu béo 18,34%

Giống có khả năng chống chịu tốt, hiện nay đã được đưa vào cơ cấu cây trồng ở diện rộng với tổng diện tích khoảng trên 2.200 ha

Chọn hạt giống đều, khoẻ, có phôi sáng, không nấm mốc Khử trùng khay, bình, tay, bằng cồn Giấy lọc được sấy 130oC trong vòng 1 giờ, hạt

được khử trùng bằng dung dịch KMnO4 1% trong 5 phút

Gieo trên khay có giấy thấm, chia thành 2 phần:

+ Phần 1: cho hạt nảy mầm trong nước cất (lô đối chứng)

+ Phần 2: cho hạt nảy mầm trong dung dịch đường sacarôzơ với áp suất thẩm thấu từ 1 atm đến 12 atm (lô thí nghiệm)

Hạt nảy mầm trong dung dịch đường dễ nhiễm nấm cần bổ sung thêm kháng sinh nistatin 1/2 viên trong 1/2 lít Hàng ngày bổ sung lượng nước hoặc dung dịch đường ở các lô như nhau

2.2.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu

* Hoạt độ của enzim proteaza

- Xác định hoạt độ proteaza theo Phạm Thị Trân Châu [2]

Hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu được tính theo công thức:

X=

Trong đó:

X: Hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu

V: Số ml dung dich mẫu

V1: Số ml dung dịch NaOH 0,2N chuẩn độ bình đối chứng

V2: Số ml dung dịch NaOH 0,2N chuẩn độ bình thí nghiệm

V3: Số ml dịch lọc đem chuẩn độ

g: Số gram mẫu phân tích

f: Hệ số điều chỉnh NaOH 0,2N

* Hoạt độ của enzim lipaza

- Xác định hoạt độ của enzim lipaza theo Nguyễn Văn Mùi [15]

Hoạt độ của lipaza được biểu thị bằng số ml NaOH 0,1N trong 10g hạt theo công thức:

X=

w

f b

( 

Trong đó:

X: Là hoạt độ enzim lipaza

a: Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm b: Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình đối chứng f: Hệ số chỉnh lí NaOH 0,1N

w: Khối lượng hạt

g V

f V V

V

.

82 , 2 ).

(

3 1

* hoạt độ của enzim α_ amilaza

- Xác định hoạt độ enzim α_amilaza theo Nguyễn Văn Mùi [15]

Lượng tinh bột bị thuỷ phân tính theo công thức:

889 , 6

Trong đó :

X: là hoạt độ α_amilaza c: lượng tinh bột bị thuỷ phân (g) w: Lượng chế phẩm enzim phân tích (mg) 100: Là hệ số chuyển mg thành gam 6,889; 0,029388: là các hệ số phương trình tính hoạt độ thu

được bằng phương pháp xử lí số liệu thực nghiệm

1 , 0 ) (

1

2 1

OD OD

OD 