Nghiên cứu tổng hợp n acetylcystein

Tinh chat cüa câc acid amin: • Tinh tan: câc acid amin dê tan trong dung môi phân eue nuôc, ethanol, không tan trong dung môi không phân eue benzen, hexen, ether [3]... • Phân ûng hoâ h

BƠYTÉ TRÜƠNG BAI HOC DÜOC HÀ NƠI

NGUYÊN THIMINH HÀ

NGHIÊN CÜU TƠNG HOP

N-ACETYLCYSTEIN

(KHÔ LUÂN TƠT NGHIÊP DlTOC Si KHÔ 2002-2007)

Ngucfi huơng dân: TS Nguyên Dinh Luyên Nai thirc hiên: Bơ mon Cơng Nghiêp Diroc,

trirợig Dai hoc Diroc Hà Nơi Thơi gian thiic hiên: 3 - 5/2007 _

LOI càM ON

Dâu tiên, tôi xin duçfc bày tô su kinh trong cùng long biét on sâu sâc tôi

thây Nguyên Dînh Luyên, ngudi truc tiê'p huông dan tôi thuc hiên khoâ luân

tôt nghiêp Vôi su giûp dd hét süc tân tinh cüa thây, tôi dâ hoàn thành dé tài tôt nghiêp vâi mue dich và nôi dung de ra trong thdi gian quy dinh.

Tôi xin chân thành câm an câc thây cô giâo trong Bô mon Công nghiêp Duçfc, anh Phan Tien Thành và câc ban dong mon dâ giûp dâ tôi tân tïnh suô't thdi gian thuc hiên khoâ luân.

Xin kinh chûc câc thây cô luôn luôn manh khoé và ngày càng thu duçfc nhiêu thành tich trong công tâc nghiên cûu cûng nhu trong gidng day.

Hà Nôi, ngày 22 thâng 05.nam 2007

Sinh viên Nguyên Thi Minh H à

MUC LUC

DAT VAN DE 1

PHANI: TÔNG QUAN 3

1.1 Tong quan vê acid amin 3

1.1.1 Acid amin 3

1.1.2 Phân loai acid amin 3

1.1.3 Tinh chat cüa câc acid amin 4

1.2 Tong quan vè N-acetylcystein 5

1.2.1.Câ'u trûc hoâ hoc cüa N-acetylcystein 6

1.2.2 Tinh chat 7

1.2.3 Dinh tinh, dinh luçfng, xâc dinh eau trûc 8

1.2.4 Mot so dang bào chécüa N-acetylcystein trên thi truùng 1 0 1.2.5 Tâc dung dtiûc ly 10

1.3 Phiromg phâp tong hop 12

1.3.1 Ccf chéacyl hoâ 13

1.3.2 Ccf chékhü hoâ 13

1.3.3 Câc phuctng phâp tong hçtp 14

PHAN II: THITC NGHIÊM VÀ KÊT QUÂ 17

2.1 Nguyên vât lieu và phirong phâp nghiên cüti 17

2.1.1 Nguyên vât lieu 17

2.2.2 Tong hop N-acetylcystein 22

2.2.3 Südung câc phuangphâp vât ly, hoâ hoc, hoâ ly âétâch

và tinh ché N-acetylcystein 28 2.2.4 Xâc dinh eau trûc hoâ hoc và dô tinh khiét

cüa sân pham âtiçtc tong hop 32

2.3 Bàn luân 36

PHAN III: KÉT LUÂN VÀ DÊ XUAT 39 TÀI LIEU THAM KHÂO

PHU LUC

DÂT VAN DE

Dâ tir lâu, N-acetylcystein (NAC) dugc biét dén vôi tac dung chu yéu là

mot loai thuôc tiêu dàm, giâi dôc khi ngô dôc paracetamol và dieu tri bênh

khô mât [6 ] Gàn dây, no dâ duac phât hiên thêm mot vài tac dung moi dâng

liai y và co tmh thcri su nhu: làm thuôc hô trg dieu tri HIV-AIDS, cai nghiên,

diêu tri nâm, chông lâo hoâ và chông ung thu [13] Vi vây N-acetylcystein (NAC) luôn giü môt vai trô quan trong trong diêu tri bênh, bâo vê sïrc khoè con nguôi

N-acetylcystein là dân xuât N-acetyl cüa L-cystein cô tên khoa hoc là:

acid L-a-acetamido-{}-mecaptopropionic [19].

N-acetylcystein dugc tong hop tir L-cystin, môt acid amin thuôc nhôm

co chira liru huÿnh và dugc câu tao tir hai phân tir cystein liên kêt vôi nhau qua câu nô'i disulfid L-cystin chiêm tÿ lê cao trong thành phân cüa toc, long, mông, sùng (12-14%) [10]

Van dê tong hop N-acetylcystein tir nguôn nguyên lieu ban dàu là toc, mông, sùng rât dirçfc câc nhà sân xuât quan tâm, do nhu câu sur dung cao mà trong nirofc lai chua truc tiêp sân xuât duac Ô nirac ta, N-acetylcystein làm thuôc dêu phài nhâp tùr nuôc ngoài vôi giâ rât cao, trong khi dô nguôn nguyên lieu phuc vu cho sân xuât lai rât dôi dào và giâ lai ré Néu câc nhà sân xuât co thé tân dung duçfc nguôn nguyên lieu sân cô trong nirôrc thi së tiét kiêm duac chi phi sân xuât, giâm giâ thành sân phâm, dem lai nhiêu lai ich han cho ngirdi tiêu dùng Ké hoach nghiên cün sân xuât hoâ duac tür 2003-2010 cüa Bô Công Nghiêp dâ dàt ra cho ngành Duac Viêt Nam môt mue tiêu quan trong là tâng cudng tu sân xuât thuôc tùf nguyên lieu tu nhiên

De gôp phân nghiên ciru, tân dung tiêm nâng tu sân xuât duac phâm trong nuôc, chüng tôi tiên hành thuc hiên dê tài:

"Nghiên cûu tong hop N-acetylcystein "

Vôi nhüng mue tiêu sau:

1 Tong hop N-acetylcystein dat tiêu chuân tùr L-cystin tir diêu ché dugc

2 Xâc dinh câc diêu kiên toi uu cho quâ trînh tong hgp N- acetylcystein tùr L-cystin

3 Nghiên crïu câc phuong phâp tâch và tinh ché N-acetylcystein

4 Chûng minh câu truc cûa N-acetylcystein tong hgp dugc

2

PHAN I: TÔNG QUAN

1.1 Tong quan vê acid amin

Câc a-aminoacid cô công thuc câu tao chung nhu sau:

Tât câ câc a-aminoacid thiên nhiên (trùf glycin R=H) dêu cô Ca là carbon bât dôi làm quay mât phang ânh sang phân eue [3]

Ô nuôc ta hiên nay, da sô câc ché phâm acid amin phâi nhâp tuf nuôc ngoài trong khi nhu câu sü dung câc ché phâm này làm thuôc lai rât lôn Do vây, viêc nghiên cüu vê acid amin dông mot vai trô quan trong và cô nhiêu ÿ nghïa trong thuc té

1.1.2 Phân loai acid amin:

• Do eau truc phân tü trong do vi tri cüa nhôm amin (-NH2) so vôi nhôm cacboxyl (-COOH) cô thé khâc nhau, nguôi ta phân loai acid amin thành câc nhôm: a, P, y, 5, co [3].

P

R —CH— CH2— COOHI

n h2

• Théo câu tao hoâ hoc cüa nhôm R, nguôi ta phân L-a-acid amin thành 7 nhôm [4]:

- Nhôm acid amin mach thang: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin

- Nhôm acid amin chüa gôc hydroxyl (OH): Serin, Threonin, Tyrosin

- Nhôm acid amin chüa luu huÿnh: Cystein, Methionin

- Nhôm acid amin acid (chüa cacbonyl hay amid): Acid aspartic, Asparagin, acid glutamic, Glutamin

- Nhôm acid amin kiêm (chüa nhôm base): Arginin, Lysin, Histidin

- Nhôm acid amin chüa nhân thüm: Histidin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan

- Nhôm imino acid: Prolin

1.1.3 Tinh chat cüa câc acid amin:

• Tinh tan: câc acid amin dê tan trong dung môi phân eue (nuôc, ethanol),

không tan trong dung môi không phân eue (benzen, hexen, ether) [3]

4

• Câc amino acid là nhüng chat két tinh, không bay hai, nông chây và phân huÿ

à nhiêt dô tuong dôi cao Diëm chây thuông cao (>200°C) do lue ion cüa mang

két tinh

• Câc amino acid cô tmh luông tmh (vùa mang trnh base vira mang tinh acid)

• Phân ûng hoâ hoc dâc trung cüa acid amin:

Do trong câu truc cüa acid amin cô chüa nhôm -COOH và -NH2 nên cô câc phân üng dâc trung cho câc nhôm amin và cacboxyl nhu phân ûng acetyl hoâ, phân ûng formyl hoâ hay este hoâ

- Phân ûng vôi Ninhydrin:

Nguyên tâc: Ninhydrin là chat oxy hoâ manh, khi dun nông cô khâ nàng khû nhôm amin và nhôm cacboxyl cüa a-aminoacid tao ninhydrin khü, C02,

NH3 và aldehyd Sau dô Ninhydrin và Ninhydrin khü lai phân ûng tiép vôi NH3 tu

do tao thành phûc hop màu tim cô dô hâp thu eue dai à À,=570nm Cuông dô màu

phu thuôc vào nông dô cüa acid amin

- Phân ûng vôi Fluorescamin:

Nguyên tâc: Tao sân phâm huÿnh quang vôi a-amin cüa acid amin, dây là phân ûng rât nhay, cho phép phât hiên acid amin tôi hàng ngàn nano gram

- Phân ûng Biure:

Nguyên tâc: Trong môi truefng kiêm câc liên két peptid trong protein két

hop vôi ion Cu++ tao phûc hop màu tim à duôi dang anion Phân ûng này tao phûc

cô màu bên vüng và ôn dinh dugc dùng de djnh lugng protein

- Phân ûng Foin xâc dinh acid amin chüa luu huÿnh:

Nguyên tâc: Acid amin chüa luu huÿnh (nhu L-cystin và L-cystein) khi dun nông trong môi truông kiêm së phân ûng vôi muôi chi tao sulfid chî (PbS) màu den xâm [3]

1.2 Tong quan vê N-Acetylcystein:

N-acetylcystein (NAC) là dân chat N-acetyl cüa L-cystein, mot acid amin tir nhiên [14] NAC dâ dugc nghiên cüu vê câu truc, tmh châft, phuong phâp tong hgp, bân tong hop cüng nhu câc phuong phâp bào ché thành câc thành phâm sü dung trong dugc phâm Dù dâ xuât hiên tù lâu trên thi trucmg nhung hiên nay NAC vân dành dugc nhiêu su quan tâm cüa câc nhà nghiên curu

1.2.1 Câu trûc hoâ hoc cüa N-acetylcystein:

Công thiîc câu tao:

O

OCông thûc phân tü: C5H9NS03

Phân tü lugng: 163,2

Thành phân:

C: 36,80% H: 5,56% N: 8,58% O: 29,41% S : 19,65%

Tên khoa hoc: Acid L-a-acetamido-P-mecaptopropionic [19]

N-acetylcystein là môt a-amino acid, cô nhôm thé gân vào C à vi tri a Tât

câ câc a-amino acid dêu cô dông phân quang hoc do cô carbon bât dôi (Ca), trùr glycin, tunng tu së cô câu truc cüa công thuc hînh chiéu nhu sau:

1.2.2 Tinh chat:

a) Tmh chat vât lÿ:[2]

Két tinh tôt trong nuôc à dang bot màu trâng hoâc tinh thë không màu.

Dê tan trong H20 và ethanol Thuc té không tan trong dichloromethan

Dô tan trong H20 à 20°C là 200g/l.

Dung dich 1% côpH = 1,5 - 2,5

[a]D= +21° - +27° (à nông dô 50g/l).

Nhiêt dô nông chây: 109 - 110°C

b) Tinh chât hoâ hoc:

Trong câu truc cüa N-acetylcystein cô câc nhôm carboxylic (-COOH),

amin bâc 2 (-NH-), amid (-NHCO-), thiol (-SH) nên nô cüng mang tmh chât

tucng ûng cüa câc nhôm chûc dô

• Vôi câu trûc cô chûa câ hai nhôm -COOH và nhôm -NH- nên

N-acetylcystein cô nhüng tmh chât hoâ hoc co bân cüa mot amino acid

• Câc phân ûng cüa nhôm amid:

Nhôm amid cô thë bi khü hoâ bôi LiAlH4, tham gia phân ûng thoâi

phân duôi tâc dung cüa hypohalogenid (NaOX)

• Tmh chât cüa nhôm thiol: [3,14]

> Do S và O thuôc cùng mot nhôm trong bâng tuân hoàn câc nguyên tô (nhôm VI) nên chûng cô mot sô thuôc tmh liên két hoâ hoc tuong tu nhau Vî

thé câc tmh chât hoâ hoc cüa câc hop chât chûa nhôm thiol là tuong tu nhu cüa

alcol: câc thiol tao ra câc thioete, thioacetal, thiocetal, thioeste

Vî du:

Tao thioete khi tâc dung vôi alcol:

R- SH + R'OH -> R- S - R + H20

Tao thioeste khi tâc dung vôi acid:

(Thiocetal)

> Dê bi oxy hoâ:

Khi oxy hoâ nhe nhàng thiol bai oxy cüa không khi thî tao thành dialkyl disulfid:

2R-SH + 1/2 02 -► R-S -S -R + H20

( dialkyl disulfid)Khi oxy hoâ manh thiol vôi acid nitric tao ra alkyl sulfonic:

- Do nâng suât quay eue: dô quay eue riêng tù +21°- +27° (trong môi truong dung dich dêm phosphat vôi pH=7 ,0 ), dung dich NAC cô nông dô 50mg/ml.

- Nhiêt dô nong chây: 104-110°C

- Do phô hêng ngoai: so sânh vôi chât chuân

- Bang sâc kÿ long hiêu nâng cao (HPLQ: so sânh thôi gian luu vôi chât chuân

- Thêm 0,05ml dung dich Natri nitroprussiat (50mg/ml) và 0,05ml amoniac dâc vào 0,5ml dung dich ché phâm 5%, së tao phûc không ben cô màu tim sim [7]

• Dinh luong:

> Dinh luong N-acetylcystein bâng phuong phâp sâc kÿ long hiêu nâng cao (HPLC) [20]

> Dinh luong N-acetylcystein theo Duoc diën Anh 2005 [1 1]:

Hàm luong N-acetylcystein phâi dat tù 98,0 - 102,0% tmh theo khôi luong ché phâm dâ làm khan

- Câch tién hành:

Hoà tan chlnh xâc 1,40 g NAC trong 60ml nuôc trong bïnh non, thêm dung dich acid HC1 và làm lanh bînh trong nuôc dâ, thêm 10ml dung dich Kl vào binh Sau dô, dem chuân dô bàng dung dich iod 0,05M vôi 1ml chî thi hé tinh bôt, dinh luong dén khi màu chuyën sang màu xanh thâm thi ngùng chuân dô Ghi thë tfch dung dich iod 0,05M dâ dùng ( V ml )

- Công thûc tmh két quâ dinh luong:

%NAC = V x 10' 3 x 16,32/ m ( m: khôi luong cân NAC )( 1 ml dung dich iod 0,05 M tuong duong vôi 16,32 mg C5H9NS03)

• Xâc dinh câu trûc:

Hiên nay viêc xâc dinh câu truc co thë sur dung phuong phâp do pho: pho

hông ngoai, tü ngoai, pho khôi, pho công huông tù

1.2.4 Môt so dang bào ché cüa N-Acetylcystein trên thi tru&ng:

Bdng 1 : Môt so ché phâm cüa N-acetylcystein trên thi truàng

Acetylcystein 2 0 0 mg Hôp lOvîxlOviên nang - Công ty CPDP - Mekophar

Nam Hà

N-acetyl-L-cystein 600mg Lo 60 viên Longevita Science

Parvolex 2 0 0 mg/ml Lo 10ml (IV) Glaxo Smith Kline

1.2.5 Tâc dung duac ly:

N-acetylcystein giû môt vai trô quan trong trong diêu tri bênh và bâo vê

suc khoè con nguôi Nô duoc xép vào danh mue thuôc thiét yéu cüa Viêt Nam

(04-1999) [6 ],

Tâc dung cüa N-acetylcystein:

• Acetylcystein duoc dùng làm thuôc tiêu chât nhây trong bênh nhây nhôt (xo nang tuyên tuy), bênh lÿ hô hâp cô dôm nhây quânh (viêm phé quan

câp, man tinh) Thuôc làm giâm dô quânh cüa dôm ô phoi cô mü hoâc không

bâng câch tâch dôi câu nôi disulfur (-S-S-) trong mucoprotein, vî vây tao thuân

loi de tong dôm ra ngoài bàng phân xa ho, dân liïu tu thé hoâc bàng phuong phâp

co hoc [6 ]

• Tâc dung làm thuôc giâi dôc: dùng dé bào vê và chông dôc cho gan khi quâ liéu paracetamol, bàng câch duy tri hoâc khôi phuc nông dô glutathion cüa gan Glutathion là chât càn thiêt de làm bât hoat chât chuyën hoâ trung gian cüa paracetamol (trong dô cô N-acetylbenzoquinon imin - môt chât rât dôc vôi gan) Glutathion giûp chuyën hoâ tiép N-acetylbenzoquinon imin thành chât không dôc và dào thâi ra ngoài Khi quâ lieu paracetamol (6-10g/ngày vôi nguôi bînh thuông và 3-4g/ngày vôi nguôi cô bênh vê gan), môt luong lôn chât chuyën hoâ này duoc tao ra vï duông chuyën hoâ chûih (liên hop glucuronid và sulfat) trô thành bâo hoà Acetylcystein chuyën hoâ thành cystein, kfch thfch gan tong hop glutathion và do dô no cô thë bâo vê dugc gan nêu bât dâu diêu tri trong vông 1 2 giô sau khi quâ liêu paracetamol [6 ,8 ]

• Thuôc này cüng dugc su dung tai chô dë diêu tri bênh không cô nuôc mât (do thiêu màng mông nuôc mât) hay côn goi là hôi chûng khô mât [6 ]

• N-acetylcystein dugc su dung két hgp vôi Gliotoxin giûp diêu tri

nam Candida sp [17].

• N-acetylcystein dugc coi nhu môt chât bâo vê dë chông lai gôc tu do rât hiêu quâ, nhu dôi vôi môt sô chât nguy hiëm sau: acrolein (tïm thây trong thit dông vât quay hoâc nuông, trong thuôc lâ, trong khi thâi tù dông co), bromobenzen, paraquat (chât dôc trong thuôc diêt cô) N-acetylcystein cô thë

cô tâc dung chông lâo hoâ bàng viêc tâng nông dô glutathion trong gan, phoi, thân, tuÿ xuong [13]

• N-acetylcystein dùng phôi hgp vôi 1 sô thuôc khâc cô tâc dung hô trg trong diêu tri bênh nhân nhiêm HIV/AIDS và cô thë giüp cai nghiên cocain [13]

Glutamid

! Cystein

1.3 Phirong phâp tong hop:

N-acetylcystein cô thë duac diêu ché tù L-cystein bàng câch acetyl hoâ truc tiép nhôm -NH2 cüa L-cystein [2]

- Acetyl hoâ nhôm -NH2 cüa L-cystin

- Khü hoâ dë cât dût lien két disulfid (-S-S-)

Tâc nhân acyl hoâ cô công thûc chung nhu sau:

Q °

R“ c - xTrong dô X cô thé là -OH, -OR, -NH2, -OCOR, -X

Tâc nhân acyl hoâ [10]: Acid cacboxylic (acid acetic)

Este (methyl acetat) nhung ît dùng

Câc amid (carbamid)

Anhydrid acid (anhydrid acetic)

Halogenid acid (acetyl chlorid) và xeten

Co ché acyl hoâ N-acetylcystein: xây ra theo c a ché ai diên tù

© © R.NH,

R C O X ^ - RCO + X - ► R C O N R i + H X

Nhôm acyl thuông dë bi phân eue do dôi diên tù lêch vê phia nguyên tù oxy cô dô âm diên lôn han Néu X lai cô tâc dung hüt diên tù manh thî tâc nhân acyl dë bi phân ly tao thành câc cation acyli (RCO+) Nguyên tù C cüa nhôm acyl

là tâc nhân âi diên tù do mang diên tich duong [1 ]

1.3.2 Ca ché khü hoâ:

Khâi niêm khü hoâ duoc hiêu là quâ trînh nhân thêm diên tù cüa môt nguyên

tü hoâc môt ion nào dô Trong hoâ hoc hüu ccf, nguôi ta côn goi khü hoâ là quâ trînh làm giâm dô oxy hoâ cüa chât dem khü Trong dô hop chât hüu co lây thêm nguyên

tù hydro, loai khôi nô câc di tô (thuông là oxy) hoâc nhân thêm diên tù

Phân üng khü hoâ không cô môt co ché chung mà môi loai tâc nhân khü hoâ cô ca ché phân ûng riêng [1 ]

Khü hoâ liên két disulfid -S -S - vôi tâc nhân là kim loai ( Fe, Zn, Sn ) trong môi truông acid xây ra theo ca ché sau:

Trong môi tnrông acid, lien két disulfid -S -S - lây hai diên tü cüa kêm, dông thôi lây thêm hai proton làm dut liên két -S -S - tao thành hai nhôm thiol.

1.3.3 Câc phuong phâp tong hop:

a) Phuctng phâp cüa H A Smith và G Gorin -1961: [18]

Hoà tan 20g L-cystin trong dung dich cüa 12g NaOH vào 200ml nuôc Làm lanh khôi phân üng bàng nuôc dâ Sau dô vùa khuây vira nhô tù tù 40ml dung dich anhydrid acetic vào dung dich trên trong 30 phüt sao cho nhiêt dô không quâ 5°C Giû khôi phân üng ô nhiêt dô phông trong 1 giô Sau dô nâng nhiêt dô dén 55°C và cho thêm bôt këm vào khôi phân üng, khuây tiép trong 15 phüt, làm nguôi, loc loai bô këm thùa Thêm dung dich chi acetat 1M vào dich loc dë tao tüa chi mecaptid Két tüa chi mecaptid dugc loc, rüa và phân huÿ bôi khi hydrosulfid (H2S) Loc bô chi sulfid (PbS), dich loc dem bôc hoi, thu dugc sân phâm thô vôi khôi lugng 13g (hiêu suât 48%).

Sân phâm thô dugc tinh ché bàng câch hoà tan trong isopropanol nông, cho thêm ether khan, loc loai bô két tüa tràng roi bôc hoi dich loc dén khô Sau 3 lân tinh ché së thu dugc sân phâm tinh khiét cô nhiêt dô nông chây tù 107-107,5°C

Hoà tan két tüa tràng à trên trong ether và dem do UV së cho két quâ

tuong tu cüa thiazolin

b) Phuong phâp cüa N W Pirie và T Sh Hele -1933: [16]

Làm lanh hôn hgp gôm 20g L-cystin vôi 130ml dung dich NaOH 0,6N Sü dung keten (theo phuong phâp cüa Ott - 1931) làm tâc nhân acyl hoâ Khôi phân üng dugc giû lanh trong 30 phüt, sau dô thêm vào 30ml dung dich NaOH 2,5N Giû khôi phân ûng ô nhiêt dô phông trong 1 giô, thu dugc dung dich acid yéu Thêm vào dung dich này 20ml acid acetic bàng và môt ît bôt këm dông thôi nâng nhiêt dô dung dich lên 50-60°C Sau dô làm lanh tù tù, khuây liên tue khôi phân ûng, roi lçc thu lây dich loc

Thë tfch dich lgc thu dugc khoâng 400ml Thêm tù tù dung dich chï acetat vào dich loc cho dén khi không xuât hiên thêm két tüa Loc rüa tüa bàng dung dich chi acetat 1% Hoà két tüa thu duoc vào nuôc tao hôn dich roi tién hành

phân huÿ bàng khi H2S Loc bô chï sulfid, bôc hai dich loc, thu duac sân phâm vôi khôi luong 21,5g và nhiêt dô nông chây 1 1 1°C Sân phâm diêu ché theo câch này sach và tinh khiét han theo phuang^iâp cü.

c) Phuong phâp cüa T A Martin và C W Waller-1965: [15]

Trong dung dich dêm chüa lmol anhydrid acid thi cystein và muôi amoni (-NH4+) hay muôi kim loai kiêm cüa nô dêu bi N-monoacyl hoâ Sân phâm thu duoc së duoc nguôi ta sü dung dë diêu tri câc bênh thuôc duông hô hâp

Khuây hôn dich gôm 35,2g L-cystein hydrochlorid monohydrat trong 87ml tetrahydrofuran 91%, sau dô thêm 54,4g Natri acetat trihydrat (Na0Ac.3H20) vào khôi phân ûng Sau dô 20 phüt, khôi phân ûng duoc làm lanh dén 3-6°C roi duoc thêm vào 20ml anhydrid acetic Dua khôi phân ûng vê nhiêt dô phông và khuây trong 6 giô dâu, dë yên trong 15 giô tiép theo, rôi lai tiép tue khuây thêm 4 giô Sau dô thêm vào khôi phân ûng 8 g acid HC1, dua vê nhiêt dô 5-10°C, loc lây sân phâm Sân phâm cuôi cùng cô hàm luong N-acetylcystein là 80,4% và cô nhiêt

dô nông chây: 109-110°C

16

PHAN n: THUC NGHIÊM VÀ KÊT QUÂ

2.1 Nguyên vât liêu và phuong phâp nghiên curu:

2.1.1 Nguyên vât lieu:

• Nguyên liêu:

Nguyên liêu dë tong hop N-acetylcystein là L-cystin, duoc diêu ché tir toc theo phuong phâp thuÿ phân Phân ûng thuÿ phân toc duoc chung tôi tiên hành theo tài liêu tham khâo [91

Toc duoc thu mua tai câc hiêu cât toc, rüa sach, cât nhô roi dem thuÿ phân

• Hoâ chât và thuôc thu:

- Acid clohydric, acid sulfuric, anhydrid acetic (Trung Quôc)

- Natri acetat, NaOH, chi acetat (Trung Quôc)

- Bôt këm (Trung Quôc)

- Na2S: diêu ché tù NaOH và luu huÿnh

- Ethylacetat, isopropanol, dimethylether (Trung Quôc)

- Côn tuyêt dôi, nuôc cât (Viêt Nam)

- Than hoat (Viêt Nam)

• Thiét bi và mây môc:

- Sinh hàn hoi luu

- Bïnh câu 1000ml, 200ml, 50ml

- Binh câu 3 c6 500ml

- Nhiêt ké thuÿ ngân (Trung Quôc)

- Phêu loc Buchner

- Mây khuây tù IKA (Dûc)

- Mây cât quay Buchi B480 (Thuy Sÿ)

- Cân phân tich Mettler Toledo AB204S (Thuy Sÿ).

- Cân kÿ thuât Sartorius BP2001S (Duc)

- Mây do nhiêt dô nông chây Gallenkamp (Anh)

- Phân eue ké A-KRUSS P1000 (Dire)

2.1.2 Phuong phâp nghiên cûu:

y Thuÿ phân toc, diêu ché L-cystin.

Cô nhiêu câch dë diêu ché L-cystin nhung phuong phâp thuÿ phân L-cystin

tù protein vân don giân và cô ÿ nghïa thuc té hon câ Qua nghiên cùu cho thây L- cystin cô tî le cao trong keratin, vî thé phuong phâp mà chung tôi lua chon dë diêu ché L-cystin là thuÿ phân toc trong môi truông acid [9] Quâ trinh diêu ché L-cystin tù protein nhin chung dua theo so dô nguyên lÿ sau:

„ H+,OH",enzym, t° pH=5 T ^ i

Keratin - -> acid amin — - > L - Cystm -l

> Tong hop N-acetylcystein

Trong môt sô phuong phâp diêu ché N-acetylcystein, chung tôi lua chon phuong phâp cüa Smith và Gorin [181 dë phù hop vôi diêu kiên và quy mô phông thi nghiêm cüa truông

18

Tien hành khâo sât thay doi môt sô diêu kiên phân ûng dë quâ trînh dat hiêu suât cao nhât:

- Khâo sât luong këm sur dung trong phân ûng khü hoâ

- Khâo sât thôi gian khü hoâ

- Khâo sât pH sau khi suc khi H2S giâi phông NAC tù hop chât mecaptid chi

> Sü dung câc phuong phâp hoâ hoc, vât lÿ, hoâ lÿ dë tâch và tinh ché N- acetylcystein

> Xâc dinh câu truc và dô tinh khiét cüa sân phâm:

- Do nhiêt dô nông chây

- Do nâng suât quay eue [20]

- Dinh luong bàng phuong phâp iod [11]

- Do câc pho hông ngoai, phô khôi, pho công huông tù cüa sân phâm tong hop duoc so vôi mâu chuân

2.2 Thuc nghiêm - két quâ - nhân xét:

2.2.1 Diêu ché L-cystin:

Chüng tôi tong hop N-acetylcystein tù nguyên liêu L-cystin Vï vây cân diêu ché L-cystin dâm bâo vê sô luong và chât luong bàng phuong phâp thuÿ phân tù tôc Chüng tôi thuc hiên diêu ché L-cystin tù tôc theo phuong phâp sau [9,21]

Câch tiê'n hành: Cân 200,0g tôc cho vào bînh câu ba co, thêm vào 400,0ml

acid chlorhydric 20% Dun hoi luu ô nhiêt dô 120°C cho dén khi thu phân ûng Biure cô két quâ âm tinh (khoâng 23 giô) Tây màu bàng khoâng 12,0g than hoat, loc nông, cô dâc dich loc Hoà tan dich cô trong 100,0ml nuôc cât, thêm tù tù dung dich Natri acetat 50% cho dén khi dung dich cô pH= 4-5 Dë hôn hop ô nhiêt dô phông trong ba ngày Loc lây tüa, rüa tüa bàng 50,0ml nuôc cât ô 60°C

Tinh ché sân phâm bàng câch hoà tan trong 300,0ml acid HQ 1 M và tây màu bàng 5,0g than hoat Néu dich loc vân co màu vàng nhat, tiép tue tây màu bàng 5,0g than hoat Diêu chinh dich loc dén pH= 3- 4 bàng Natri acetat 50% (su dung hê't 110 ml dung dich tuofng duong vôi mNatri aCetat-55,0g ) Dë hôn hop ô nhiêt dô phông trong khoâng 5-6 giô cho két tüa hét Loc lây tüa, rüa tüa bàng 20,0ml nuôc cât ô 60°C Sây sân phâm ô nhiêt dô 65°C trong 2- 3h.

Khi HQ thoât ra tù phân ûng thuÿ phân duoc rüa qua môt bînh rüa dung dung dich NaOH loâng

Két quâ: Thuc hiên nhiêu lân qui trînh diêu ché L-cystin này, chüng tôi

thu duoc két quâ nhu sau:

Ban g 2: Két quâ dieu ché L-cystin

Thi nghiêm Luong tôc (g) L-cystin (g) Hiêu suât (%)

Ta cô hiêu suât Irung bînh là 4,1%

Sân phâm thu duoc cô: t°nc=259-261°C

nâng suât quay eue [a]D20= - 220,5°

Nhân xét: Bâng 2 cho thây, hiêu suât phân ûng khâ ôn dinh Vôi nhüng

diêu kiên phân ûng dâ xâc dinh së cho ta hiêu suât phân ûng khoâng 4,1% Sân phâm L-cystin thu duoc cüng dat dô tinh khiét cân thiét cho quâ trînh tong hop tiép theo

Quâ trînh thuÿ phân tôc tao L-cystin cô thë duoc biëu diên theo so dô sau:

20

Hinh 1 : Scf dô diêu chéL-Cystin

2.2.2 Tong hop N-acetylcystein:

1 (CH3C0)20/0H

2 Zn/H+ *

COOHI

2 CH—NHCOCH,I

CH2— SH (NAC)Quâ trînh tong hop: Gôm 3 giai doan

Giai doan 1: acyl hoâ bàng anhydid acetic trong 30 phüt ô 8-10°C, sau

1 giô giû ô nhiêt dô phong

Giai doan 2: khü hoâ bàng bôt këm ô 55 °C trong môi truông acid

Giai doan 3: quâ trînh tâch và phân lâp NAC bàng chî acetat, dùng khi H2S phân huÿ chi mecaptid dë thu lai duoc NAC

cao nhât, chüng tôi tien hành khâo sât mot sô yéu tô sau:

a) Khâo sât luorng këm cân sü dung trong phân ûng khü hoâ:

Câch tien hành:

Hoà tan 2,0g L-cystin ( 0,0083 mol) trong dung dich cüa 1,2g NaOH trong 20,0 ml nuôc Làm lanh khôi phân üng dén 8 -1 0 °C bàng nuôc dâ, dông thôi vùa khuây vùa nhô tù tù 4,0ml anhydrid acetic ( 0,032 mol) vào khôi phân üng trong 30 phüt Sau dô giû dung dich phân üng ô nhiêt dô phông trong 1 giô Nâng nhiêt dô phân üng lên 55°C, thêm dan bôt këm vào vôi câc luong khâc nhau theo tmh toân cüa câc thi nghiêm cân khâo sât Duy tri khôi phân ûng ô nhiêt dô 55°C

và khuây liên tue trong 15 phüt Loc loai bô këm thùa Thêm vào dich loc dung dich chî acetat 1M (cho dén khi luong két tüa không dôi), khuây kï Loc thu tüa

22

chî mecaptid trên phëu Buchner, rira tüa bàng 10,0ml dung dich chî acetat 1% Hoà tüa thu duoc vào 50,0ml nuôc thành hôn dich, sau dô tien hành suc khi H2S qua hôn dich Khôi phân üng sau khi suc khi duoc loc trên Buchner loai bô chî sulfid két tüa, thu dugc dung dich NAC Dung dich NAC dugc xü lÿ bàng câc phuong phâp vât lÿ, hoâ lÿ dë thu dugc NAC tinh khiét, xâc dinh khôi lugng NAC tinh khiét và tinh hiêu suât phân üng.

Két quâ: dugc trînh bày trong bàng và biëu dô sau dây.

Bâng 3: Két qua khâo sât litçfng këm sü dung dén hiêu suât phân ûng

STT ^këm

(g) ^L-cystin

(g)

Tÿ lê mol këm/L-cystin mNAC

H2S04, CH3COOH Vai trircmg hop này thî phân ûng khû hoâ xây ra vôi tâc nhân

là këm trong môi truông acid acetic

Bâng 3 cho ta thây khi tâng dan luong këm phân ûng thî hiêu suât phân ûng cüng tâng dan Tÿ lê mol këm tàng dan tù 1,1 dén 1,5 so vôi lmol nguyên lieu thî hiêu suât tàng tù 32% dên 38,6%; tù 1,5 dên 2mol këm so vôi lmol nguyên lieu thî hiêu suât cô tàng (38,9%) nhung không nhiêu Vî thé, de vùa dam bâo thu duoc hiêu suât tôt, vùa tiét kiêm chi phi thî luong këm sû dung phù hop nhât là: l,5mol këm/1 mol nguyên lieu

b) Khâo sot ânh huâng cüa thâi gian khühoâ dên hiêu suât tong hop:

Câch tien hành: Hoà tan 2,0g L-cystin ( 0,0083 mol) trong dung dich cüa

1,2g NaOH trong 20,0 ml nuôc Làm lanh khôi phân ûng dén 8-10°C bàng nirôc

dâ, dông thôi vùa khuây vùa nhô tû tù 4,0ml anhydrid acetic ( 0,032 mol) vào

khôi phân ûng trong 30 phüt Sau dô giü dung dich phân ûng à nhiêt dô phong

trong 1 giô Nâng nhiêt dô khôi phân ûng lên 55°C roi thêm vào bot këm vôi

luçmg toi uu dâ khâo sât à phân truôc ( 0,81g tuong duang 0,0125mol) Phân ûng khü hoâ duoc thuc hiên à câc thcri gian khâc nhau theo tmh toân cho môi thi

nghiêm Loc loai bô këm thùa Thêm vào dich loc dung dich chî acetat 1M (cho dén khi luçfng két tua không doi), khuây kï Loc thu tüa chi mecaptid trên phêu

24