thành tựu nuôi cấy mô tế bào thực vật trên hoa lan

Trong những năm gần đây kinh tế nước ta dần dần đi lên để hội nhập vào nền kinh tế trong khu vực và thế giới, hiện nay với nhiều mặt hàng nông nghiệp xuất khẩu như: Cà phê, tiêu, điều, cao su, gạo… sản xuất nông nghiệp đã đóng góp một phần quan trọng trong nền kinh tế quốc dân, cùng với những thành tựu to lớn đạt được trong sản xuất nông nghiệp, ngành sản xuất hoa lan có những bước tiến đáng kể. Ở một số nước trên thế giới ngành trồng hoa cây cảnh nói chung và hoa Lan nói riêng là một ngành sản xuất công nghiệp đem lại hiệu quả kinh tế cao. Hoa lan là loài hoa vương giả,với vẻ đẹp kiều kỳ,huyền bí,có giá trị sử dụng và giá trị kinh tế cao.Hiện nay ở nước ta,hoa lan được nhiều người quan tâm và nghiên cứu.Hàng năm có nhiều giống hoa lan được lai tạo và nhập nội, nhiều tiếnbộ kỹ thuật mới được nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất nên qui mô trồng hoa lan ngày càng được nâng cao 4

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết của vấn đề nghiên cứu

Trong những năm gần đây kinh tế nước ta dần dần đi lên để hội nhập vào nền kinh tế trong khu vực và thế giới, hiện nay với nhiều mặt hàng nông nghiệp xuất khẩu như: Cà phê, tiêu, điều, cao su, gạo… sản xuất nông nghiệp đã đóng góp một phần quan trọng trong nền kinh tế quốc dân, cùng với những thành tựu to lớn đạt được trong sản xuất nông nghiệp, ngành sản xuất hoa lan có những bước tiến đáng

kể Ở một số nước trên thế giới ngành trồng hoa cây cảnh nói chung và hoa Lan nói riêng là một ngành sản xuất công nghiệp đem lại hiệu quả kinh tế cao

Hoa lan là loài hoa vương giả,với vẻ đẹp kiều kỳ,huyền bí,có giá trị sử dụng

và giá trị kinh tế cao.Hiện nay ở nước ta,hoa lan được nhiều người quan tâm và nghiên cứu.Hàng năm có nhiều giống hoa lan được lai tạo và nhập nội, nhiều tiếnbộ kỹ thuật mới được nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất nên qui mô trồng hoa lan ngày càng được nâng cao [4]

Từ xưa tới nay, Lan được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa của bậc vua chúa vương giả Lan ở Việt Nam đẹp vẻ thanh cao lại chưa đựng nhiều ý nghĩa Cùng với sự phát triển của ngành trồng Lan trong thời gian qua, loài hoa quý này không chỉ làm đẹp hơn hình ảnh của Việt Nam trong con mắt du khách đến với nước xứ sở nhiệt đới này mà còn mang lại hiệu quả kinh tế cao

Chính vì thế, ngày nay đã có nhiều người biết chơi hoa Bắt kịp thị hiếu này, hiện nay đã xuất hiện nhiều cơ sở kinh doanh hoa Lan với nhiều chủng loại, giá cả khác nhau Do đó việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in –vitro tạo ra hàng loạt các cây con giống có năng suất và phẩm chất như bố mẹ chọn lọc Từ một cây

mẹ ban đầu có thể nhân ra hàng ngàn cây con có kích thước và chất lượng đồng đều như nhau, giúp việc nhân giống được nhanh hơn Mặt khác cây con ổn định về

1

mặt di truyền đồng thời giảm tác hại cho cây giống và và giá cả phải chăng là vô cùng hữu ích

Nuôi cấy mô đã mở ra nhiều khả năng nhân giống cây hoa lan trong suốt hơn nửa thế kỉ qua, chất lượng hoa được cải thiện, nhiều giống hoa lan lai tạo mới

ra đời mang lại nhiều nguồn lợi nhuận khổng lồ

Vì những lí do trên nên tôi tiến hành chọn nghiên cứu vấn đề “ Thành tựu nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào trên cây hoa Lan”.

1.2 Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thé giới

+ Nhân giống bằng phương pháp hữu tính: Là sự kết hợp giữa hai giao tử, giao tử đực và giao tử cái tạo hợp tử sau đó phát triển thành hạt và từ hạt phát triển thành cây con Thực tế trên thế giới việc nghiên cứu về cây phong lan đã được biết đến từ năm 1973, song đến năm 1844, Newman một nhà vườn pháp mới làm nảy mầm hạt lan bằng cách rắc hạt lên các cục đất quanh gốc cây lan to và sự thành công này được lan rộng nhưng chưa có lời lý giải cụ thể Năm 1904, Noel Bernard thực hiện phương pháp gieo hạt cộng sinh với nấm để gây sự nảy mầm, ông nhận thấy rằng các cây lan con nảy mầm trong rừng đều bị nhiễm nấm, ông đã cô lập các nấm ở rế cây lan con và cấy vào hạt lan, chính bằng cách này ông là người đầu tiên làm cho 100% hạt lan nảy mầm Năm 1909, Hán Burff đã làm nảy mầm được hạt của Laclio Cattleya trên môi trường dỉnh dinh dưỡng 0.33% đường saccarose trong điều kiện hoàn toàn bóng tối, năm 1972, Lewis Krusdo, một nhà khoa học người Mỹ lại thành công trong việc gieo hạt ở môi trường thạch và ông nhận thấy rằng sự nảy mầm của hạt còn phụ thuộc vào thời gian hái quả Dựa vào phương pháp nhân giống hữu tính người ta có thể lai tạo để tạo ra các con lai mang những

gian cây mọc đến khi ra hoa kéo dài, mặt khác đặc tính di truyền của con lai không

ổn định do đó phương pháp này chỉ được áp dụng trong chọn lọc mới

+ Nhân giống vô tính cây hoa lan, trên thế giới việc nhân giống vô tính hóa lan bằng hình thức tách chiết thông thường rất ít được áp dụng, do đó kĩ thuật phát triển mạnh nên nhân giống vô tính cây hoa lan bằng nuôi cấy mô tế bào ra đời, từ một tế bào với các tác nhân nhân tạo có thể tạo ra một cơ thể hoàn chỉnh, phương pháp này có thể nhân giống lan nhanh với tốc độ cao Ban đầu Morel khám phá ra phương pháp nuôi cấy mô thành công loài lan đa thân Năm 1970, N.vajrabhaya và

T vajrabhaya đã cấy mô thành công loài lan đơn thân Năm 1974 các nhà khoa học

đã cấy mô thành công hầu hết các loại lan thuộc nhóm đơn thân khác và cũng nhờ

có phương pháp nuôi cấy mô tế bào các cây lan đã chọn lọc từ phương pháp lai hữu tính được nhân với tốc độ cao có thể đáp ứng nhu cầu sản xuất, kinh doanh, môi trường có vai trò rất quan trọng trong quá trình nuôi cấy, nó cung cấp chất dinh dưỡng đảm bảo cho sự sinh trưởng của mô cấy Môi trường dinh dưỡng thích hợp cho việc nuôi cấy là môi trường MS ( Marushige – shoog, 1962), V W ( Vacine – went, 1949), KC ( Knudsone)…

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Việt Nam là nước có khí hậu gió mùa nóng ẩm, được thiên nhiên ưu đãi vì khắp vùng rừng núi từ Nam chí Bắc, từ đồng bằng đến tận Cao Nguyên, nhiều vùng nổi tiếng có nhiều giống lan quý hiếm được thế giới công nhận chính vì vậy

đã có những nghiên cứu về lan ở Việt nam từ rất sớm

1.2.1.1 Nghiên cứu về thu nhập, chọn tạo và đánh giá nguồn gen.

Nghiên cứu về cây lan ở Việt Nam những buổi ban đầu không rõ rệt lắm, nhiều tác giả cho rằng người đầu tiên có khảo sát về lan ở Việt Nam là Gioalas Noureiro, Nhà truyền giáo người Bồ Đào Nha, ông này đã mô tả cây lan ở Việt

3

Nam lần đầu tiên vào năm 1789, trong cuốn “ Flora cohin chinensis” và sau này đã được Bentham và Hooker ghi lại trong cuốn “ Genera Planterum” ( 1862 – 1883) Sauk khi người pháp đến Việt Nam đã công bố những công trình nghiên cứu đáng

kể là F.Gagnepain và A Gnilaumin mô tả 70 chi gồm 101 loài cho 3 nước Đông Dương Trung bộ “ Thực vật Đông Dương chí” do H Lecomte chủ biên, xuất bản năm 1932 -1934, có một số tác giả khác cũng đề cập đến lan Việt Nam như : schumid, Tixer và Guanna Seidenfaden ( 1975) Bên cạnh đó cũng có một số nhà khoa học Việt Nam cũng có bước đầu nghiên cứu về lan như GS Phạm Hoàng Hộ với 289 loài được mô tả và vẽ hình trong cuốn “ Cây cỏ Việt Nam” năm 1991, phân viện sinh học Đà Lạt đã tổ chức thu nhập các loại lan rừng được TS L Vaveryano thực hiện, đến nay ở Lâm Đồng nói riêng đã xác định được tên khoa học của 217 loại, thuộc 64 chi, trong số 239 loài lan của bộ sưu tập danh mục 217 loài đã xác định tên khoa học và được ghi nhận có hai loài mới của Việt Nam là Liparis compress Lindl và Thriv spermum Leucarachne Ridl…

1.2.1.2 Những nghiên cứu về nhân giống cây hoa lan ở Việt Nam

* Nhân giống bằng phương pháp gieo hạt

Đối với hoa lan việc tự thụ phấn là rất khó khăn, trong thực tế việc thụ phấn xảy ra nhờ con người hoặc nhân tạo bởi con người, nhân giống bằng hạt không phải là mới mẻ song do hạt lan rất khó nảy mầm nên phương pháp này cũng không được áp dụng phổ biến ở Việt Nam Năm 1990 các cán bộ kỹ thuật Đà Lạt

đã bắt đầu thực hiện các phép lai đầu tiên trên cơ sở chọn lọc những cây bố mẹ mang các đặc tính ưu việt , nhóm phong lan được chọn là cây trong chi

Renanthera và Vanda, đã đáp ứng được một phần nào các yêu cầu ngày càng đa

dạng về mặt sưu tập và từng bước tạo tiền đề cho việc khai thác kinh tế hoa lan cắt cành

* Nhân giống bằng phương pháp tách chiết

Là phương pháp đơn giản dễ làm không tốn kém, tuy nhiên hệ số nhân giống kaf không cao Nguyễn Việt Thái cho ( 2002) [] cho rằng bất kể tháng nào trong năm cũng có thể tách chiết lan để trồng, tuy nhiên thời điểm tốt nhất cho việc tách

là đầu tháng mùa mưa, khí trời mát mẻ, cây đang phát triển, cũng theo Việt Chương, Nguyễn Việt Thái ( 2002) [] đối với lan đơn thân kinh nghiệm cho thấy phần ngọn được tách ra trồng mau ra hoa hơn là các lan đơn thân ở phần thân…

* Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Công nghệ invitro, trong thời gian ngắn có thể sản xuất được một số lượng các giống khỏe, đồng đều và sạch bệnh và trường Đại học Nông Nghiệp I là một trong những cơ sở chính nghiên cứu về nuôi cấy mô nói chung, theo PGS.TS Nguyễn Quang Thạch và cộng sự ( 2005) [] cây lan dễ nhân trong ống nghiệm và

có hệt số nhân giống cao, môi trường chính cho nuôi cấy lan là môi trường Knudson C…Tác giả Hoàng Ngọc Thuận và cộng sự ( 2007) cho rằng: ngày nay, việc nhân giống lan bằng hạt trong môi trường invitro khá phổ biến ở nhiều phòng thí nghiệm Việt Nam với các ưu điểm sau: thời gian cho cây con nhanh, hệ số nhân giống cao, giá thành hạ…[4]

Ngoài ra còn có một số vấn đề nghiên cứu khác đối với hoa lan: như nghiên cứu về các biện pháp kỹ thuật trong sản xuất lan, nghiên cứu về sâu bệnh hại lan

PHẦN 2: NỘI DUNG 2.1 Giới thiệu khái quát về hoa lan [4]

2.1.1 Đặc điểm sinh học

Trong số những cây cho hoa có hơn 16000 loài và 70 – 800 giống thuộc họ orchidaceae đã được xác định và rất nhiều loài lai giống nhân tạo Họ lan chiến vị tri thứ 2 sau họ cúc (Asteraceae) và họ lớn nhất trong lớp một lá mầm Riêng ở Việt Nam được biết gồm 750 loài khác nhau

Khác với cây trồng cạn, trồng trong môi trường nước các loài phong lan lại

có đời sống kí sinh, bì sinh nhờ bộ rễ “ ăn nổi” bám vào cây rung nhiệt đới hoặc hút chất dinh dưỡng từ mùn hữu cơ đang hoại mục Nhìn chung, họ lan bao gồm các loài thân thảo, sống lâu năm Chúng sống ở đất, nơi hốc, vách đá…Căn cứ vào cấu trúc thì có 2 nhóm: nhóm đơn thân như giống vanda, Mokara… Và nhóm đa thân như giống Cattleya… Ngoài ra cây lan còn mang một số đặc tính: hạt vô cùng nhỏ, số lượng nhiều và hầu hết không có chất nuôi dưỡng

a Rễ

- Lan là họ sống phụ ( bì sinh) bám, treo lơ lửng trên các cây thân gỗ khác Các dạng thân gỗ nạc dài, ngăn, mập hay mảnh mai đưa cơ thể bỏ đi xa hay chụm lại thành các bụi dày

- Rễ làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng, chúng được bao bởi lớp mô hút dày,

ẩm bao gồm những lớp tế bào chết chứa đầy không khí, do đó nó ánh lên màu xám bạc Với lớp mô xốp đó, rễ có khả năng hấp thu nước mưa chảy dọc dài trên vỏ cây, lấy nước lơ lửng trên không khí

7

b Thân

- Lan có 2 loại thân: đa thân và đơn thân

- Ở các loài lan sống phụ có nhiều đoạn phình lớn thành củ giả ( giả hành) Đó là

bộ phận dự trữ nước và các chất dinh dưỡng để nuôi cấy invitro

c Lá

- Hầu hết các loài phong lan là cây tự dưỡng, nó phát triển đầy đủ hệ thống lá

- Hình dạng của lá thay đổi rất nhiều, từ loại lá mọng nước đến loại lá phiến mỏng

- Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo các gân vòng cng hay chỉ gấp lại theo gân hình chữ V

- Màu sắc lá thường xanh bóng, nhưng có trường hợp 2 mặt lá khác nhau Thường mặt dưới có màu xanh đậm hay tía, mặt trên lại khảm nhiều màu sặc sỡ

d Hoa

- Hoa đối xứng qua một mặt phẳng

- Bên ngoài có 6 cánh hoa, trong đó có 3 cánh ngoài cùng là 3 cánh đài, thường có màu sắc và kích thước giống nhau Một cánh đài nằm ở phía trên hay phía sau của hoa gọi là cánh đài lý, hai cánh đài nằm ở hai bên gọi là cánh đài cạnh, Nằm kế bên trong và xen kẽ với 3 cánh đìa là 3 cánh hoa, chúng giống nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc khác hẳn với các cánh còn lại gọi là cánh môi Cánh môi quyết định giá trị thảm mỹ của hoa lan

- Ở giữa hoa có một trụ nổi lên, đó là bộ phận sinh dục của cây, giúp cây duy trì nòi giống Trụ gồm nhị và nhụy Sauk hi thụ phấn, các cánh hoa héo, cuống hoa hình thành quả lan

e Quả và hạt.

- Quả lan thuộc quả nang, nở ra theo 3 -6 đường nứt dọc, quả có dạng cải dài đến hình trụ ngắn phình ở giữa Khi chin, quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc

- Hạt lan rất nhiều, hạt liti Hạt chỉ cấu tạo bởi một lớp chưa phân hóa, trên mỗi mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí Hạt trưởng thành sau 2 -18 tháng

2.1.2 Sự phân bố

Họ lan phân bố từ cực Bắc như Thụy Điển xuống tận các đảo cực Nam của Ostralia Tuy nhiên trung tâm phân bố của họ này ở trên các vĩ đỗ nhiệt đới, đặc biệt ở Châu Mỹ và Đông Nam Á Theo nghiên cứu ở vùng nhiệt đới Châu Á có tới

6800 loài Riêng ở Việt Nam có tời 800 loài

2.2 Nhân giống hoa lan bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

2.2.1 Giới thiệu khái quát về phương pháp nhân giống invitro.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật ( nuôi cấy invitro) là phạm trù khái niệm để chỉ chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng

Nhân giống invitro là quá trình sản xuất một lượng lớn cây hoàn chỉnh từ các bộ phận, cơ quan như chồi, mắt ngủ, vảy củ, đoạn thân, lá… của cây mẹ ban đầu thông qua kĩ thuật nuôi cấy invitro [6]

Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào là một phần quan trọng trong sản xuất nông nghiệp công nghệ cao, một mảng của nghành công nghệ sinh học hiện đại Sau hơn nửa thế kỷ nghiên cứu và phát triển, ngày nay công nghệ nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã được ứng dụng rộng rãi ở hầu

9

hết các nước nông nghiệp phát triển và đang phát triển Ở nước ta sau gần 30 năm nghiên cứu, ứng dụng, đến nay hầu hết các tỉnh đã có phòng thí nghiệm invitro, tuy nhiên việc áp dụng rộng rãi công nghệ tiên tiến này trong sản xuất còn rất nhiều hạn chế Nhiều phòng thí nghiệm đã không phát huy được hiệu quả, thậm chí phải giải thể, nhất là các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào của các tỉnh miền núi phía bắc, và một số tỉnh miền Trung, gần đây là ở Nam Bộ

Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào có một số ưu việt sau:

- Hệ số nhân giống cao hơn rất nhiều lần so với nhiều phương pháp nhân giống khác

- Cây con có khả năng sinh trưởng mạnh, giúp phục tráng một số giống đã bị thoái hóa do nhân giống vô tính lâu đời , tạo cây giống sạch bệnh, nhất là các bệnh vius

- Rút ngắn các quá trình chọn lọc một số dòng, giống trong chọn tạo các giống mới -Tạo một số dòng bất dục trong công tác tạo giống ưu thế lai, tạo một số biến dị soma, và lai soma tế bào trần

- Góp phần quan trọng trong việc duy trì, bảo tồn và phát triển nguồn gen các giống loài thực vật, dùng trong công tác tạo giống và nhân giống [11]

2.2.2 Quy trình cơ bản về nhân giống Lan bằng phương pháp nuôi cấy mô in – vitro

1 Chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy:

Tách các vảy hành ra từ cây, bóc lần các lá già cho đến khi xuất hiện các mầm chồi bên mang đỉnh sinh trưởng Cắt bỏ gốc của mỗi mầm, sau đó khử trùng bằng cách ngâm trong cồn 70% trong 30 giây, rửa sạch bằng nước cất vô trùng

ngâm trong dung dịch Ca(OCl)2 2% trong 25 phút, việc khử trùng được tiến hành trong tủ cấy Mô được rửa lại với nước cất vô trùng 4 - 5 lần

Mỗi mầm được đặt trong đĩa petri vô trùng và cẩn thận tách các lá non Sau mỗi lần tách, nhúng mầm vào cồn 700 trong 1 giây và rửa với nước cất vô trùng Chuyển sang một đĩa petri vô trùng khác, tách các lá mầm bằng dao nhọn vô trùng Dùng kìm nhọn tách các lớp lá, cắt đỉnh sinh trưởng ra khỏi mô và cấy vào môi trường nhân giống ban đầu

2 Nhân giống:

Môi trường nhân giống thường là môi trường MS (Murashige Skoog, 1962)

có bổ sung các chất điều hoà tăng trưởng (auxin, cytokinin,…) với tỷ lệ phù hợp tùy loài nhằm tạo điều kiện cho quá trình nhân chồi Nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng nên giảm dần trong các lần cấy chuyền sau đó Các chất chiết trái cây cũng được đề nghị dùng như nước cốt cà chua, nước dừa, nước chuối, nước khoai tây nhưng chúng chỉ có hiệu quả trong các lần cấy chuyền và thể tích cũng không quá 10% thể tích môi trường

Nhiệt độ lý tưởng để nhân giống Lan là 220C - 260C và tuỳ vào mỗi loài.Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn gọi là thể chồi Thể chồi được lấy ra khỏi môi trường cấy ban đầu, dùng dao nhọn cắt làm 4-6 miếng tuỳ kích thước của chồi Lát cắt được chuyển vào môi trường duy trì (môi trường phát triển chồi) Mỗi đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển ra một thể chồi mới sau khoảng 4 tuần, có thể cắt tiếp và cấy chuyền sang môi trường mới

3 Tái sinh cây hoàn chỉnh in-vitro:

Khi đạt đến số cây giống cần thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ (môi trường có lượng auxin tăng lên để kích thích ra rễ) Sau 4 -5tháng, các thể chồi sẽ phát triển thành cây con

4 Chuyển cây ra vườn ươm:

11