... 11 ,73 13 ,59 14 , 13 15 ,43 1, 55 13 ,49 10 15 ,07 1, 99 0,67 15 , 01 14 , 59 11 1, 06 15 , 25 15 ,55 12 0,49 16 ,47 17 ,47 13 17 ,32 16 , 05 1, 39 14 15 ,96 14 , 87 0,96 15 17 ,12 1, 35 15 ,33 16 16 ,53 0,60 17 13 ,59 16 ,55 ... 0,79 15 ,54 1 ,14 17 ,62 0,80 10 16 ,43 1, 27 16 ,22 0, 95 11 13 ,82 2,29 15 ,02 1, 05 12 13 17 ,47 2 ,50 16 ,20 2,04 14 17 , 51 1,04 16 ,80 1, 21 15 17 ,12 0 ,55 16 ,72 1, 02 16 17 ,37 0,26 15 ,82 0,69 17 17 , 41 0, 95 17 ,00... 16 ,55 0,90 14 , 16 18 16 ,38 1 ,14 16 ,27 19 16 ,18 0, 95 20 11 , 91 16 ,53 0, 85 16 ,57 21 15, 65 3,09 15 , 15 22 12 ,89 0,87 13 ,82 23 14 , 22 0,09 15 ,60 24 15 ,00 0,77 15 ,98 25 15 ,89 0,89 16 ,88 26 16 ,00 1, 21 15, 00
p ....... — ............... BÔ Y TÊ m TRÜÔNG DAI HOC DUCJC HÀ NÔI HOANG THI LUYEN NGHIÊN CtJU LÊN MEN SINH TÔNG HOP KHÂNG SINH NHÔ XA KHUAN 14.1.5 (KHOÂ LUÂN TÔT NGHIÊP Dl/OC Sï KHOÂ 1998 - 2003) Ngitùi hixông dan: TS. CAO VÂN THU ThS. KIEU THI HONG Nai thuc hiên: BÔ MON CÔNG NGHIÊP DUÜC Thâi giari thiçc hiên: 02 - 05/ 2003 • o 3: , HA NOI, 05 - 2003 7 3J0.fr " > -.v*.-r\ \■ #V*M ^ i . ' J -• 1 LÙl CÂM ON Vâi long biê't on sâu sac, em xin trân trong güi ldi câm cm tôi TS. Cao Van Thu, ThS. Kiêu Thi Hong dâ tân tinh giûp dâ, huông dân em hoàn thành khoâ luân này. Em xin chân thành câm cfn câc thây cô giâo, ky thuât viên Bô mon Công Nghiêp Duçfc dâ tao dieu kiên cho em trong thdi gian làm khoâ luân. Trong quâ trînh làm khoâ luân, em cüng không trânh khoi nhüng thieu sot kinh mong câc thây, câc cô và câc ban dông gôp y kien. Hà Nôi, thâng 5 nâm 2003 Sinh viên Hoàng Thi Luyen MUC LUC Trang DAT VAN DE.........................................................................................................1 PHAN 1 - TÔNG Q UAN.................................................................................... 2 1.1. Khâng sinh.......................................................................................................2 1.1.1. Dinh nghïa............................................................................................ 2 1.1.2. Phân loai............................................................................................... 2 1.2. Xa khuân (Actinomycetes) ..............................................................................3 1.2.1. Dâc diëm chung và hïnh thâi cüa xa khuân........................................3 1.2.2. Dâc diëm, cü sà phân loai và khâ nàng sinh tong hop khâng sinh cüa chi Streptomyces.......................................... 4 1.3. Câc phirong phâp phân lâp VSV sinh khâng sinh......................................... 7 1.3.1. Lây m âu............................................................................................... 7 1.3.2. Câc phuong phâp phân lâp.................................................................. 7 1.4. Cài tao giong VSV.......................................................................................... 7 1.4.1. Chon loc ngâu nhiên.......................................................................... 8 1.4.2. Dot bien nhân tao...............................................................................8 1.5. Quâ trinh lên m en........................................................................................... 8 1.5.1. Lên men bê m ât................................................................................. 8 1.5.2. Lên men chïm.................................................................................... 9 1.6. Chiét xuât và tinh ch é.................................................................................10 1.6.1. Chiét xuât bâng dung môi hüu co...................................................11 1.6.2. Sâc kÿ................................................................................................11 1.7. Mot so nghiên crïu công nghê sân xuât khâng sinh trong thôti gian gàn dây ........... '..........................................................................12 1.7.1. Khâng sinh milbemycin.................................................................... 12 1.7.2. Actinohivin - khâng sinh chong HIV.............................................. 12 PHÂN 2 - THÜC NGHIÊM VÀ KÉT QUÂ................................................. 14 2.1. Nguyên vât lieu, trang thiét bi và câc phirong phâp thuc nghiêm .............14 2.1.1. Nguyên vât lieu và trang thiét b i................................................... 14 2.1.2. Câc phuong tien thuc nghiêm.........................................................18 2.2. Két quà và nhân x é t................................................................................. ....25 2.2.1. Xâc dinh tên khoa hoc cüa xa khuàn 14.1.5................................ 25 2.2.2. Thü hoat tinh khârig sinh cüa xa khuànsau khi phân lâp..............27 2.2.3. Két quà câi tao giong VSV........................................................... 28 2.2.4. Két quà lên men chîm trong mây lâ c ...........................................33 2.2.5. Két quà thü dô on dinh cüa dich lên men chûa khâng sinh.......33 2.2.6. Két quà chiét xuât và tinh ché......................................................34 PHAN 3 - KÉT LUÂN VÀ DE XUAT.......................................................... 37 3.1. Két luân......................................................................................................... 37 3.1.1. Vê phân loai, dinh tên xa khuàn....................................................37 3.1.2. Vê quà trînh câi tao giong............................................................. 37 3.1.3. Vê nghiên cüu quâ trînh lên m en..................................................37 3.1.4. Vê chiét xuât và tinh ché............................................................... 37 3.2. Dê xuât...... ................................................................................................... 37 PHU LUC TÀI LIEU THAM KHÂO CHÜ GIÂI CHÜ VIÉT TÂT ADN A cid deoxy ribonucleic BC Bacillus cereus ATCC 9946 Bp Bacillus pumilus ATTC 10241 Bs Bacillus subtilis ATTC 6633 EC Escherichia coli ATTC 25922 KS Khâng sinh MT Môi trircmg Pseu Pseudomonas aeruginosa VM 201 Pro Proteus mirabilis BV108 Shi Shigella flexneri DT 112 Strep. Streptomyces STT So thü* tu SL Sarcina lutea ATTC 9341 Sta Staphylococcus aureus ATTC 1228 Typ Salmonella typhi DT 220 VSV Vi sinh vât HIV Human Immunodeficieny virus DAT VAN DE Hiên nay, sir dung khâng sinh bât hop lÿ là nguyên nhân chu yéu dân dén tînh trang vi khuân de khâng lai khâng sinh, do dô bên canh viêc sû dung khâng sinh mot câch hop lÿ, an toàn, hiêu quâ thî nhu càu tîm kiém và sân xuât ra khâng sinh môi và khâng sinh thé hê môi là yêu càu càn thiét. Cuôc dua tranh giüa câc vi khuân khâng khâng sinh và ngành công nghiêp sân xuât khâng sinh dang tiép diên vôi mot quy mô và toc dô ngày càng lôn. Khâng sinh duçfc tao thành tir nhiêu con duông nhu t6ng hop, bân téng hop nhung viêc tîm khâng sinh môi cô nguôn goc VSV vân duçfc thé giôi râ't quan tâm. Trong sô hon 8000 chat khâng sinh dâ biê't trên thê' giôi thî hon 80% cô nguôn gôc tù xa khuân, mà à Viêt Nam vôi khi hâu nhiêt dôi nông âm dâ tao nên mot quàn thê’ VSV sông trong dat râ't phong phü, cô nhiêu loai xa khuân sinh khâng sinh, dô là yéu tô râ't thuân loi dé nghiên cun khâng sinh nguôn goc tîï xa khuân. Tù1nhûng lÿ do trên, chüng tôi lira chon khoâ luân : “ Nghiên cûu lên men sinh tong horp khâng sinh nhà xa khuan 14.1.5 ”, vôi mue tiêu: > Nghiên cun khâng sinh do vi sinh vât duçfc phân lâp à Viêt Nam tao ra. 7 -i- PHAN 1 TÔNG QUAN 1.1. KHÂNG SINH [8] 1.1.1. Dinh nghla Khâng sinh là nhùng sàn phâm dâc biêt tù duoc tù VSV hay câc nguôn thiên nhiên khâc cô hoat tinh sinh hoc cao, cô tac dung kim hâm hoâc tiêu diêt mot câch cô chon loc lên mot nhôm VSV xâc dinh hay té bào ung thir à nông dô thâp. 1.1.2. Phân loai De phân loai khâng sinh cô thé dira vào nguôn gôc hoâc co ché tac dung nhung thuông thi ngucfi ta phân loai theo câu truc hoâ hoc cüa tùng loai, timg nhôm khâng sinh : 1. Câc Beta- Lactam : - Câc Penicilin - Câc Cephalosporin - Câc Monolactam - Câc chat ire ché Beta- lactamase 2. Câc Aminozid : - Dân chât Streptidin : Streptomycin, Dihydrostreptomycin. - Dân chât thé 4, 6 cüa dehydro-2-streptamin: Kanamycin và dân chât, Gentamicin, Sisomycin, Netilmycin - Dân chât thé 4, 5 cüa dehydro-2-streptamin: Neomycin, Paromomycin - Dân chât Streptamin : Streptinomycin 3. Cloramphenicol và dân chât - Cloramphenicol và câc este - Thiamphenicol 4. Câc Tetracyclin - Câc Tetracyclin thiên nhiên - Câc Tetracylin ban tong hofp 5. Câc khâng sinh Macrolid và dông loai Câc Marcrolid : - Câc Marcrolid 14, 15 nguyên tir - Câc Marcrolid 16 nguyên tir 6. Câc Rifamycin 7. Câc Quinolon 1.2. XA KHUAN (Actinomycetes) 1.2.1. Dàc diëm chung và hînh thâi cüa xa khuân [3, 5] * Dâc âiêm chung: - Xa khuân là mot nhôm vi khuân thât (Eubacteria) phân bô rông râi trong tu nhiên, trung binh trong lg dât thuàng cô trên 1 triêu xa khuân. - Xa khuân là câc té bào Gram duong, hiéu khi, hoai sinh, cô câu tao dang soi phân nhânh. Xa khuân duoc nghiên curu do chung cô thë sân sinh nhiêu sàn phâm trao doi chat quan trong. * Dâc âiêm hinh thâi: - Hê soi cüa xa khuân chia ra thành khuân ty ca chatvà khuân ty khisinh, chi Actinomyces và vài chi khâc chîcô khuân ty khi sinh. Loai khuân ty không mang bào tû goi là khuân ty di duông. - Duôrng kmh khuân ty xa khuân tir 0,5|um -r l,5|um. - Câ'u tao té bào : thành té bào vi khuân cô dang két câu luôi, dày 10 20nm, cô tâc dung duy tri hinh dang cüa khuân ty và bâo vê té bào; màng té bào xa khuân dày 7,5 + lOnm. - Sinh sân : bào tir trân là co quan sinh sân chü yéu cüa xa khuân, sinh sân theo phuong thü'c vô tmh. 1.2.2. Dâc diëm, ca sa phân loai và khâ nâng sinh tong hap khâng sinh cüa chi Streptomyces * Dâc diëm hînh thâi [3,5] Streptomyces là mot chi diën hïnh cua ho Streptomycetaceae thuôc lôp phu Actinomycetales vôi câc dâc diëm tiép theo dây: - Khuân lac : + Bê mât khô, xù xi, diroc bao phû bôi mot lôp min nhu bui phân hoâc nhûng soi nhô, bông nhu to. + Khuân lac cô chân vûng châc, khô tâch ra khôi môi trirông nuôi cây. + Khuân ty co chat : bê mât nhân hoàc sân sùi, moc sâu vào môi trucmg nuôi cây. + Khuân ty khi sinh : khuân ty khi sinh là dâc tnmg cüa chi Streptomyces, ducmg kînh 1 -r l,4|um. + Chuôi bào tir cô dang : thang, uôn cong, môc câu, xoân don hay xoân lô xo. - Bào tü : + Co quan sinh sân chu yéu cùa xa khuân là bào tü tràn. + Hînh dang : hïnh càu, bàu duc, hînh que, hînh tru. Hînh dang và kich thuôc cüa bào tü cô vai trô quan trong trong viêc dinh tên Streptomyces. + Bè mât : tron nhân, xù xî, cô gai hoâc cô toc. - Khâ nâng tao sâc tô: tao sâc tô hoà tan, sâc tô khuân ty co chât, sâc tô melanoid, sâc tô cüa khuân lac * Phân loai Streptomyces [13,14] Cô nhiêu khoâ phân loai Streptomyces khâc nhau nhiïng hôi nghi “VSV thé giôi lân X” (duoc to chûc tai Mehico nâm 1970) chon khoâ phân loai cüa E.B.Shirling và D.Gottlieb làm khoâ luân chfnh dë phân loai Streptomyces và dât tên là International Streptomyces Project (ISP). Khoâ phân loai dira trên : - Màu cüa khuàn ty khi sinh - Tao sâc tô melanoid - Màu khuàn ty ca chât - Tao sâc to hoà tan - Hinh dang chuôi bào tü - Bê mât, hinh dang bào tü - Su tiêu thu nguôn Carbon * Khâ nâng sinh tong hop khâng sinh [5,8] Streptomyces là mot chi cô khâ nâng sinh tong hop nhiêu loai khâng sinh thuôc nhiêu nhôm khâc nhau nhu aminosid, tetracyclin, macrolid... trong dô mot sô chât khâng sinh üng dung trong y hoc duoc giôi thiêu à bàng 1 : B ans 1: Khâ nâng sinh tong hop khâng sinh cüa câc Streptomyces s tt 1 Nhôm khâng sinh Aminoglycosid KS dirçrc tao thành Chung Strep. sinh KS Streptomycin griseus Kanamycin kanamycetius Tobramycin tenebrarius Neomycin Parmomycin fradiae rimosus forma paromomycinus Spectinomycin 2 Cloramphenicol và Cloramphenicol spectabilis venezuelea dân chat 3 4 Tetracyclin Macrolid và dông loai 5 6 Lincosamid Tetracyclin viridifaciens Oxytetracyclin rimosus Erythromycin erythreus Oleandomycin antibioticus Lincomycin lincolnensis Dactinomycin antibioticus Daunomycin coeruleorubidus, Chông ung thu peucetius Olivomycin Nystatin 7 olivoreticuli noursei KS chông nâm Amphotericin nodosus 1.3. CÂC PHlTGNG PHÂP PHÂN LÂP VSV SINH KHÂNG SINH [2] 1.3.1. Lây mâu De phân lâp VSV sinh khâng sinh nguôri ta lây mâu tir dât à ruông, dât quanh rê cây, dât nên ôr chuông gia càm, gia suc, bùn, nuôc à sông, ho. Tir câc mâu trên dem phân lâp thuàn khiét nhûng VSV sinh khâng sinh mà ta mong muôn bâng câc phuong phâp dâc trirng trên câc môi trucmg chon loc. 1.3.2. Câc phtfcmg phâp phân lâp VSV sinh khâng sinh * Nguyên tac : - Môi chat khâng sinh duoc tao ra bai mot hoâc vài loài VSV xâc dinh. - Môi loài VSV xâc dinh co thé sinh tong hop ra mot hoâc vài chât khâng sinh theo dâc diëm di truyèn cüa chüng. * Câc phitffng phâp : - Phuong phâp cây dich chiét lên bê mât thach - Phuong phâp cây dât truc tiép lên bê mât thach dâ chûa sân VSV kiëm dinh - Phuong phâp làm giàu dât - Phuong phâp thêm khâng sinh vào môi truông phân lâp - Phân lâp VSV sinh khâng sinh chông ung thu 1.4. CÂI TAO GIÔNG VSV [2,3, 5] Trên thuc té, câc VSV duoc phân lâp tù thiên nhiên thudng cô hoat tmh thâp, de thu duoc câc chüng cô hoat tmh cao nhâm dua vào sân xuât công nghiêp cân cô phuong phâp câi tao giông thich hop. 1.4.1. Chon loc ngâu nhiên Trong quâ trïnh phât triën cüa VSV, chât lieu di truyên (ADN) không phài luôn luôn duoc giü nguyên mà cô su thay doi vôi nhûng tân suât khâc nhau, cân chon nhûng câ thé cô hoat tmh khâng sinh cao nhât de nghiên cüu tiép. Trên thuc té phuong phâp này ît cô giâ tri âp dung vào sân xuât, de thu duoc nhûng chüng cô hoat tmh cao nguôi ta thudng két hop sàng loc vôi dôt bién. 1.4.2. Dôt bien nhân tao Dôt bien nhân tao là dôt bien duôi tac dung cûa câc tâc nhân gây dôt bien. Câc tâc nhân gây dôt bien là : - Tâc nhân lÿ hoc: ânh sâng tü ngoai, tia X ... - Tâc nhân hoâ hoc: H N 02, etylen imin, nitrozo guanidin... - Tâc nhân sinh hoc: câc gen gây dôt bien... * Ca ché gây dôt bien cüa tia tü ngoai â mite dô phân tü : Tia UV cô tâc dung gây chét hoâc dôt bien à VSV. Tia UV tâc dung chu yéu lên acid nucleic, manh nhât là à vùng 260nm, dân dén hiên tuong dime hoâ timin, à dây 2 timin gàn nhau duoc liên két công hoâ tri vôi nhau à nguyên tü C thir 5 và 6. Hâu quâ là sao chép bi sai nhâm vi ADN - polymerase dê lâp mot nucleotid không chînh xâc vào vi tri trên. Do tâc dung cûa tia UV trên soi ADN cüng xuât hiên mot dime pirimidin-pirimidin khâc goi là quang sân phâm 6 - 4, à dây C - 6 cûa pirimidin 5’ (T hoâc X) duoc liên két vôi C - 4 cûa pirimidin 3’ (thuông là X). Sân phâm này là nguyên nhân chü yéu cüa dôt biê'n gây nên bôi tia UV. 1.5. QUA TRINH LÊN MEN [1, 2, 3, 7 , 11] Lên men là quâ trînh VSV sinh tong hop khâng sinh trong môi truàng dinh duông. Ngoài viêc tuyën chon giong tôt thî câc diêu kiên vê thôi gian, môi truàng dinh duông, toc dô khuây, pH ... cô ânh huông nhiêu dên quâ trînh lên men. Cô hai phuong phâp lên men chînh : lên men bê mât và lên men chîm. 1.5.1. Lên men bê mat VSV phât triën trên môi trucmg nuôi cây hâp thu câc chât dinh duông, sü dung oxy trong không khi dé hô hâp. Do vây bê mât phài rông, lôp môi truông không quâ sâu (5 10cm). Vu âiem : don giân, dê thuc hiên. Nhuac âiêm : hiêu suât thâp, dôi hôi diên tich rông, khô tu dông hoâ và co giôi hoâ; do vây chi sü dung trong nghiên crïu câi tao giông à phông thi nghiêm. 1.5.2. Lên men chim. VSV phât triën trong không gian ba chiêu cua môi truông long. Giông VSV sü dung cho quâ trinh lên men phâi là câc té bào sinh duông dang à giai doan phât triën manh và cô khâ nâng dông hoâ cao nhât. Vi vây, truôc khi lên men phâi cô giai doan nhân giông : - Nhân giông câp 1: nuôi cây trong binh non 500ml, trên mây lâc. - Nhân giông cap 2: nuôi cây trong binh 501ft. - Nhân giông câp 3: nuôi cây trong binh 1- 5m3. Tÿ le giông cüa môi trucmg lên men 1- 10%. Quy mô giông phu thuôc vào quy mô cüa binh lên men. Ifu âiêm : hiêu suât sinh khâng sinh cao, sü dung triêt dé môi truông dinh duông. Thiét bi lên men dê co giôi hoâ, tu dông hoâ. Tiét kiêm mât bâng. Nhuac âiêm : yêu câu trang thiét bi chuyên dùng nên dôi hôi von dâu tu lôn. * Lên men giân âoan : Lên men giân doan là mot quâ trinh khép km. Trong thôi gian lên men ngoài viêc cung câp oxy, chât phâ bot, diêu chînh pH ta không càn bô sung gi thêm. Trong quâ trinh lên men giân doan VSV phât triën qua bon pha. Hînhl: Câc giai doan phât triën cüa VSV. Trong dô : 1: pha lag (pha thîch ûng) 2: pha log (pha tàng truông) 3: pha on dinh (pha dùng) 4: pha suy tàn Câc khâng sinh là sân phâm trao dôi thü cap duoc tao thành trong pha on dinh và pha suy tàn, tuy nhiên trong sân xuât nguôi ta thudng két thuc lên men khi quâ trinh sinh tong hop khâng sinh chua dùng nhung dâ châm lai không côn kinh te nùa. * Lên men bo sung: Bo sung thêm mot sô thành phân dé trânh rïc ché trao doi chât cüa VSV nhâm tâng cuông sinh tong hop hoat chât. * Lên men liên tue: Hê thông lên men liên tue hoat dông nhu mot hê thông mô. Trong quâ trïnh lên men vùa bo sung vào môi truông dinh duông dông thôi lây ra dông luong dich lên men dâ bien doi cùng VSV sao cho thé tfch không doi. 1.6. CHIÉT XUÂT VÀ TINH CHÉ [4, 6,10] Khâng sinh là nhung sân phâm trao déi thu" cap, tuy theo dâc tînh cüa loài mà sân phâm dô duoc tiét vào môi truông nuôi cây hay giû lai trong té bào. - 10 - Do dô, de thu lây hoat chât cô dô tinh khiét cao càn tîm phuong phâp chiét và tinh ché thich hop. Thao tâc co bân dâu tien là tâch riêng sinh khôi và dich loc cüa dich lên men, sau dô sü dung câc phuong phâp nhu loc, chiét bàng dung môi h Cru co, hâp phu... chiét lây khâng sinh Kÿ thuât chiét xuât và tinh ché khâng sinh thich hop không nhüng làm cho sân phàm dat chât luçfng cao, bâo quân duoc lâu mà côn làm tâng tÿ le thu hôi và ha giâ thành sân phâm. 1.6.1. Chiét xuât bàng dung môi hûu co Chiét xuât là phuong phâp dùng mot dung môi (don hay hôn hop) dé tâch lây mot chât hay môt nhôm chât tù hôn hop nghiên curu. * Nguyên tâc: dua vào su phân bô chât tan giûa hai pha không dông tan. * Câc phuong phâp chiét long- long : - Chiét don : hiêu suât thâp ton dung môi - Chiét lâp : hiêu suât cao nhung ton nhiêu thôi gian - Chiét nguoc dông : dira trên nguyên tâc cho dung môi chiét và dung dich cân chiét nguoc chiêu nhau, hai pha tiép xüc chât chè, pha trôn và di chuyén nguoc chiêu. 1.6.2. Sac kÿ Sâc kÿ là mot nhôm câc phuong phâp hoâ lÿ dùng dé tâch câc thành phân cûa mot hôn hop trên su phân chia khâc nhau cûa câc chât khâc nhau vào hai pha luôn tiép xüc và không hoà lân vào nhau : mot pha tinh và mot pha dông. Tuÿ theo phuong tien giu pha tinh ta cô : sâc kÿ trên côt, sâc kÿ lôp mông (SKLM), sâc kÿ giây. Sâc kÿ lâp mông : - SKLM thuôfng duoc tién hành trên mot bân mông thuÿ tinh hoâc nhôm cô rai mot lôp mông dinh châc cüa câc hat bôt min. Lôp mông này thuông dùng làm pha tïnh. - Chât hâp phu thucmg dùng là Silicagel loai hat min, nhôm oxyd, kizengua, thach cao. - Dung môi phâi tinh khiét. 1.7. MOT SÔ NGHIÊN CÜU CÔNG NGHÊ SÂN XUÂT KHÂNG SINH TRONG THÔI GIAN GAN DÂY 1.7.1. Khâng sinh milbemycin [15] Milbemycin duoc sân xuât tir Streptomyces hygroscopicus subsp. aurecolacrimosus là khâng sinh thuôc nhôm macrolid, tâc dung trên kÿ sinh trùng nhu giun chî. Trong sân xuât khâng sinh này, viêc nâng câp mô rông quy mô khi sir dung hê thông CM A (thay doi vân toc khuây trôn) bi thât bai. Tien hành câc nghiên cuu lên men trong câc thiét bi quy mô thi nghiêm, pilot và sân xuât, kêt hop viêc üng dung câc hê thông kiëm soât tham sô lên men lân luot CMA (thay doi A), CMB (thay doi làn luot E, A), CMC (thay doi lân luot T, I, E, A), CMD (thay doi lân luot T, E, A, I), CME (thay doi làn luot I, T, E, A), CMF (thay doi lân luot I, E, A, T). Vôi hê thông kiëm soât lên men CMF (thay doi làn luot IEAT = âp suât du, tôc dô câp khi, vân toc khuây trôn và nhiêt dô) dâ thuc hiên thành công câc mè lên men milbemycin trong câc thiét bi sân xuât, dat hiêu xuât 96,5% so vôi khi lên men trong câc thiét bi lên thi nghiêm. 1.7.2. Actinohivin - Khâng sinh chông HIV [13] Glycoprotein làn luçft cô trong luong phân tir là 120kilodalton và 41 kilodalton cüa HIV-1 khi liên két vôi câc thu thé cüa té bào së tao thành câu nôi trung gian cho su dung hop giûa virus và màng té bào. Actinohivin do mot loài Streptomyces tao ra cô câu truc protein gôm 114 acid amin, câu truc gâp nép 3 doan. Mô hinh thü là câc dông té bào tâi té hop Hela/T-env/Tat và Hela/CD4/Lac-Z cho hinh thành dông té bào T và Hela/M-env/Tat và HOS/CD4/CCR%/Lac-Z cho hinh thành dông bào tü M. Khi nuôi cây chung câc dông té bào này, su hinh thành hop bào xây ra sau 8h dén 30h. Actinohivin ûc ché su hînh thành hop bào T và M vôi nông dô ûc ché 50% IC 50 tuong ûng là 60 và 700nM. Hon nûa, actinohivin côn thé hiên hoat tfnh chông HIV manh doi vôi câc chüng HIV-1 và HIV-2 vôi nông dô ûc ché 50% trong khoâng 2 dén 110 nM. Actinohivin cô khâ nâng liên két vôi chuôi saccharid cüa nhiêu glycoprotein khâc nhau. Dé xâc dinh tmh dâc hiêu cüa actinohivin vôi carbonhydrat, tién hành kiém tra vôi nhiêu glycoprotein cô sô liên két nito khâc nhau bâng kÿ thuât gân men ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay). Két quâ là actinohivin cô âi lue vôi câc glycoprotein cô nhiêu oligosaccharid. Nhûng nghiên cûu này cung câp nhûng thông tin quÿ bâu trong viêc phât trién câc khâng sinh chông HIV. PHAN 2 THlTC NGHIÊM VÀ KET QUÂ 2.1. NGUYÊN VÂT LIEU, TRANG THIÉT BI VÀ CÂC PHUONG PHÂP THUC NGHIÊM 2.1.1. Nguyên vât lieu và trang thiét bj * Chüng xa khuan: Chûng xa khuàn 14.1.5 do phong thi nghiêm Vi sinh - Khâng sinh cûa Bô mon Công Nghiêp Duoc Trucmg Dai hoc Duoc Hà Nôi cung cap. * Câc chüng VSV kiém dinh: - Câc vi khuàn Gram duong (Gr(+)): + BC: Bacillus cereus ATCC 9946 + Bp: Bacillus pumilus ATTC 10241 + Bs: Bacillus subtilis ATTC 6633 + SL: Sarcina lutea ATTC 9341 + Sta: Staphylococcus aureus ATTC 1228 - Câc vi khuàn Gram âm (Gr(-)): + EC: Escherichia coli ATTC 25922 + Pro: Proteus mirabilis BV108 + Shi: Shigella flexneri DT 112 + Pseu: Pseudomonas aeruginosa VM 201 + Typ: Salmonella typhi DT 220 * Câc môi truàng (MT) dâ sü dung : - MT phân lâp MT1 : Tinh bot 20,0g; K N 03 1,0g; K2HP04 0,5g; MgS04.7H20 0,5g; NaCl 0,5g; FeS04.7H20 lOmg; Thach 18,0g; Nuôc vira dû 1000ml; pH 6,8 -7,2; lat/30°C. MT sinh khâng sinh: + MT2 : Tinh bôt 20,0g; N aN 03 2,0g; K2HP04 1,0g; MgS04.7H20 0,5g; KC1 0,5g; Thach 18,0g; Nuôc vira dû 1000ml; pH 6,8 - 7,2; lat/30°C. + MT3 : Lactose 30,0g; NH4N 0 3 2,0g; Cao ngô 5,0g; KH2P 0 4 1,0g; MgS04.7H20 0,5g; Na2S04 0,5g; CaC03 30,0g; Thach 18g; Nuôc vùra du 1000ml; pH 6,8 - 7,2; lat/30°C. + MT4 : Glucose 20,0g; Cao ngô 5,0g; KH2P 0 4 1,0g; MgS04.7H20 0,5g; CaC03 4,0g; NH4N 0 3 2,0g; Thach 18,0g; Nuôc vira dû 1000ml; pH 6,8- 7,2; lat/30°C. + MT5 : Bôt ngô 20,0g; Bôt dâu tucfng 10,0g; NaCl 1,0g; CaC03 2,0g; KH2P 0 4 1,0g; CoCl2.7H20 0.002g; Thach 18,0g; Nuôc vira dù 1000ml; pH 6,8- 7,2; lat/30°C. + MT6 : Bôt dâu tuong 15,0g; Tinh bôt 20,0g; (NH4)2S04 2,0g; Cao nam men 5,0g; CaC03 4,0g; CoCl2.7H20 0,002g; Thach 18,0g; Nuôc vira du 1000ml; pH 6,8- 7,2; lat/30°C. + MT7 : Saccarose 30,0g; Bôt dâu tuong 10,0g; (NH4)2S04 2,0g; CaC03 2,0g; NaCl 1,0g; CoCl2.7H20 0,002g; Thach 18,0g; Nuôc vira dû 1000ml; pH 6,8- 7,2; lat/30°C. MT canh thang : Pepton 5,0g; Cao thit 3,0g; NaCl 5,0g; Nuôc vira dû 1000ml; pH 6,8- 7,2; lat/30°C. MT thach thuông : Pepton 5,0g; Cao thit 3,0g; NaCl 5,0g; Thach 18,0g; Nuôc vira dû 1000ml; pH 6,8- 7,2; lat/30°C. MT lên men : + MT1* : Tinh bôt 20,0g; K N 03 1,0g; K2H P04 0,5g; MgS04.7H20 0,5g; NaCl 0,5g; FeS04.7H20 lOmg; Nuôc vùa dû 1000ml; pH 6,8-7,2; lat/30°C. + MT2* : Tinh bôt 20,0g; N aN 03 2,0g; K2H P04 1,0g; MgS04.7H20 0,5g; KC10,5g; Nirôc vira dû 1000ml; pH 6,8-7,2; lat/30°C + MT6* : Bôt dâu tuong 15,0g; Tinh bôt 20,0g; (NH4)2S04 2,0g; Cao nam men 5,0g; CaC03 4,0g; CoC12.7H20 0,002g; Nuôc vira dû 1000ml; pH 6,8-7,2; lat/30°C. - MT phân loai (ISP) [12]: tiêt trùng lat/30°C. Muôi vi luong : FeS04.7H20 0,1g; MnCl2.4H20 0,1g; ZnS04.7H20 0,1g; Nirôc cât vira dû 1000ml; pH 6,8- 7,2. + ISP1 : Pepton 5,0g; Cao nam men 3,0g; Nirôc cât vira dû 1000ml. + ISP2 : Cao nam men 4,0g; Dich chiét Malt 10,0g; Glucose 4,0g; Thach 20,0g; Nuôc cât vira du 1000ml; pH 7,3. + ISP4 : * Dung dich I : Tinh bôt 10,0g; Nuôc cât vira dû 500ml. * Dung dich II : KH2P 0 4 1,0g; MgS04.7H20 1,0g; NaCl 1,0g; (NH4)2S04 2,0g; CaC03 2,0g; Nuôc cât vira dû 500ml. Dung dich I + dung dich II + 20,0g thach + Muôi vi luong 1,0ml; pH 7,0 - 7,4. + ISP5 : L-asparagine 1,0g; Glycerol 10,0g; KH2P 0 4 1,0g; Muôi vi luong lml; Thach 20,0g; Nuôc cât vira dû 1000ml; pH 7,0- 7,4. + ISP6 : Pepton 20,0g; Sât amoni citrat 0,5g; K2H P04 1,0g; Na2S20 3 0,08g; Cao nâ'm men 1,0g; Thach 15,0g; Nuôc vira dû 1000ml; pH 7,07,2. + ISP7 : Glycerin 15,0g; L-tyrosine 0,5g; L-asparagin 1,0g; K2H P040,5g; MgS04.7H20 0,5g; NaCl 0,5g; FeS04.7H20 0,02g; Muôi vi luong 1,0ml; Thach 20,0g; Nuôc vira dû 1000ml; pH 7,2 - 7,4. + ISP9 : Môi truông C sau khi tiêt trùng dé nguôi tôi 60°C thi cho lân luot câc nguôn duông vào sao cho nông dô 1%. * A : Câc nguôn duông dâ tiêt trùng bâng phuong phâp Tyldan: 1-Saccarose 2- 4 - Rhamnose D-Glucose 5- L- arabinose 3- D-Xylose 6- D- fructose 7 - D-fructose 8- Raffinose 9- D-mannitol * B (dung dich muôi B) : CuS04.5H20 0,64g; FeS04.7H20 0,11g; MnCl2.4H20 0,79g; ZnS04.7H20 0,15g; Nuôc câ't vùa dû 1000ml. * C (môi truông thach- muô'i khoâng) : (NH4)2S04 2,64g; KH2P 0 4 2,38g; K2H P04.3H20 5,65g; MgS04.7H20 1,0g; Dung dich muôi B lml; Thach 15,0g; Nuôc vùa dû 1000ml; pH 6,8- 7,0. * Câc dung môi chiét Bçmg2' : Câc dung môi chiét Khoi luong riêng(d) Nhiêt dô soi (°C) Cloroform 1,470 -r 1,480 60 -t- 62 Buthyl acetat 0,880 - 0,885 117 -r 118 n-butanol 0,810 116 -r 118 Ethyl acetat 0,902 77 Dung môi * Vât lieu dùng trong sac ky: - Dung môi: cloroform, buthyl acetat, n- butanol, ethyl acetat, metanol, NH4OH 25%, aceton, etanol... - Bàn mông sâc kÿ: Silicagen 60 F254, Merck * Tac nhân gây âôt bién: ânh sang UV (À, =254nm) nguôn phât Toshiba 60W * Mây môc và trang thiét bi - Mây do pH Metler Toledo MP220 - Mây lâc lên men Taitec Bio-Shaker BR-300LF - Nôi hâ'p Hirayama model HL3030e - Tù sâ'y, tü âm Memmert - Hôp pétri, ong nghiêm, ong dong... - 17 - 2.1.2. Câc phirong phâp thirc nghiêm 1. Phuong phâp nuôi cây giong - Cân dong dây dû câc thành phân cüa môi truông 1 (MT1), dun soi khoâng 2 -r3 phüt roi dong vào môi ong nghiêm 5ml môi truông trên, nüt bàng nüt bông. Sau dô dem hâp tiêt trùng trong nôi hâp à diêu kiên lat/30’ roi dât thach nghiêng. - Dùng que cây dâ tiêt trùng trên ngon lira dèn côn, cây bào tir xa khuàn 14.1.5 trên thach nghiêng môi truông 1 (MT1), ü cho phât triën à 30°C ± 1°C Sau khi phât triën 5 -f 7 ngày tuoi, dem tiên hành nghiên cü’u tiép. 2. Xâc dinh hoat tmh khâng sinh bàng phuong phâp khuyéch tân [2, 9] * Chüng VSV kiém dinh : - Chüng VSV kiëm dinh là nhûng chüng nhay câm, thuàn khiét duoc bâo quân à môi truông thich hop 4 - 10°C. - Lây mot vông que cây chüng VSV kiëm dinh dua vào môi truông canh thang, làc cho bào tü phân tân dêu. - Dë VSV kiém dinh phât triën trong diêu kiên 37°C/24h. * Nguyên tâc : Khâng sinh khuyéch tân vào môi truông thach cô chûa VSV kiëm dinh ûc ché su phât triën cüa VSV kiëm dinh tao câc vông vô khuàn. * Tién hành : - Chuàn bi môi truông kiëm dinh: môi truông thach thuông sau khi hâp tiêt trùng dë nhiêt dô ha xuông côn khoâng 45 4- 50°C, roi cho môi truông canh thang chira VSV kiëm dinh vôi tÿ le Vvsv/Vthach = 2,5/100 (khoâng 105 té bào trong 1ml), lâc dêu roi do vào câc dïa pétri vôi thé tich 20ml/l dïa. Dë nguôi. - Dua mâu thû vào môi truông kiëm dinh bàng câc phuong phâp : dât khôi thach, dât khoanh giây loc, giéng thach. + Phuong phâp dât khôi thach : dât khôi thach chtfa VSV sinh khâng sinh lên môi truông kiém dinh. + Phuong phâp giéng thach : dùng pipet nhô 0,02ml mâu thu (dich chiét hoâc dich lên men) vào câc giéng thach dâ duoc duc trên môi truông kiém dinh. + Phuong phâp dât khoanh giây loc : khoanh giây loc (duông kmh 6mm) duoc hâp tiêt trùng, sây khô roi tâm 3 lân dich loc chùa khâng sinh dât lên môi truông chûa VSV kiém dinh. - De phât triën à 37°C/1 = 24h roi do vông vô khuân. Môi mâu thü duoc dât trên 3 dïa doi vôi môi loai VSV. Do duông kmh vông vô khuân bàng thuôc kep Palmer cô dô chînh xâc 0,02mm. + Két quâ duoc xü lÿ theo công thuc: Z(Di-Df D= n Trong dô : Di : duông kmh vông vô khuân do duoc. D : duông kînh vông vô khuân trung bînh. n : sô thi nghiêm song song S : là dô lêch chuân cô hiêu chînh 3. Câi tao giông VSV * P lurong phâp sàng loc ngâu nhiên - Pha hôn dich bào tü : thao tâc phâi tuyêt doi vô trùng, lây mot vông que cây bào tü 14.1.5 phât triën à 30°C/6 ngày cho vào ong nghiêm chira 10ml nuôc cât vô trùng, lâc de bào tü phân tân dêu trong nuôc, thu duoc hôn dich bào tü pha loàng 10'1. Dùng pipet vô trùng hüt chînh xâc 1ml hôn dich bào tü 10'1 cho vào ong nghiêm chüa 9ml nuôc cât vô trùng thu duoc hôn dich bào tü 10'2, tiép tue pha loâng dén nông dô 10'6. Cây bào tü : Sau dô dùng pipet vô trùng hüt chînh xâc 0,1 ml hôn dich câc bào tir nông dô tùf 10 4 4- 10'6 nhô lên bê mât thach MT1. Sau dô dùng que chang dàn dèu. De phât triën à 30°C/6 ngày. Môi nông dô làm trên 5 hôp pétri. Tien hành sàng loc: chon ngâu nhiên câc khuân lac moc riêng lé, môi khuân lac duoc cây dông thôi vào mot ong nghiêm và mot hôp pétri mue dich trong ong nghiêm dë giu”giông, trên hôp pétri dë thü hoat tmh khâng sinh. Dë phât triën à 30°C/ 6 ngày, thü hoat tmh khâng sinh bàng phuong phâp dât khôi thach. Chon câc khuân lac cô hoat tmh cao dë tien hành nghiên cüu tiép. Tien hành vôi 32 khuân lac. Phuong phâp dôt bien Pha hôn dich bào tü : chüng sàng loc cô hoat tmh khâng sinh cao duoc dem dot bien. Lây mot vông que cây bào tir 14.1.5 sau sàng loc cho vào ong nghiêm chura 10ml nuôc cât vô trùng, lâc dêu dë bào tir phân tan dêu trong nuôc ta cô hôn dich nông dô 1 0 1. Dùng pipet vô trùng hüt 9ml hôn dich bào tir 10'1cho vào hôp pétri tien hành dot bien, 1ml côn lai làm mâu chung. Sü dung tac nhân dot bien : chiêu ânh sâng tü ngoai X = 254nm trong vông 5 - 6 phüt vôi khoâng câch 60cm. Cây câc bào tü sau dôt bien : hôn dich bào tü sau khi tien hành dot bien dë trong toi 2h, roi pha loâng dén nông dô 10'4, 10'5. Pha loâng 1ml hôn dich làm mâu chüng dén nông dô 10'6. Dùng pipet vô trùng hüt chînh xâc 0,1 ml hôn dich bào tü nông dô 10'4, 10'5 cüa mâu dôt biên và hôn dich bào tü 10‘6 cüa mâu chüng nhô lên bê mât thach MT1. Sau dô, dùng que chang dàn dêu, dë phât triën à 30°C/ 6 ngày. Môi nông dô làm 5 hôp pétri. + Dém sô khuàn lac, xâc dinh dô sông sot theo công thûc : % dô sông sot = — *100 % K Trong do : Nm: sô khuàn lac sau dôt bien N0 : sô khuàn lac trong mâu chûng - Tien hành sàng loc câc khuàn lac sau dôt bien tuong tu phuong phâp sàng loc ngâu nhiên. Song song làm mâu chûng. Tien hành thu hoat tmh khâng sinh bàng phuong phâp dât khô'i thach.Chon chùng cô hoat tmh cao dë nghiên cûu tiép. 4. Phuong phâp lên men - Nhân giong câ'p mot : cho vào môi ong nghiêm chûa chûng gôc, chüng sau sàng loc, chûng sau dôt bién dâ phât triën à 30°C/6 ngày 10ml nuôc cât vô trùng, dùng que cây vô trùng cao hét câc bào tu, lâc dêu sau dô cho hôn dich trên sang binh non 500ml chûa 100ml môi truông nhân giong (MT1), lâc trên mây lâc lên men o 30°C/48h, toc dô 180 vông/1 phüt. - Tien liành lên men: lên men trên câc môi truông dé tîm môi truông lên men tôt nhât. Dùng ong dong vô trùng dong 10ml hôn dich giong cap mot cây vào câc binh non 500ml chûa 100ml môi truông lên men MT1*, MT2* và MT6*. Làc trên mây lâc lên men à 30°C/120h, toc dô 180 vông/1 phüt. - Kêt thuc lên men: Ta tién hành loc trên phêu loc Buchner dë lây dich loc. 5. Chiét xuât và tinh ché * PhiMng phâp chiet khâng sinh bàng dung môi hiïu co - Sau khi lên men, dich lên men duoc loc loai sinh khôi, dich loc duoc chînh vê câc pH khâc nhau roi tién hành chiét bàng dung môi hûu co. - Tién hành chiét don, cho dich loc và dung môi vào binh gan theo tÿ le V d u n g m ô , / V d ic h l(?c =1/3, roi lâc manh 3 làn môi làn 1 phüt, dé yên trong lh. Tâch riêng dung môi và dich loc. - 21 - - Thü hoat tmh khâng sinh cüa dung môi và dich loc bàng phuong phâp khoanh giây loc. * Phtiüng phâp sac ky lâp mông - Ban mông sâc kÿ duoc cât thành bân 3cm x 10cm, hoat hoâ ô 110°C/30\ - Dùng micropipet châm dich chiét lên bân mông dâ hoat hoâ sao cho vêt châm dich chiét không cham dung môi khi chay sâc kÿ, dem sây à nhiêt dô duôi 50°C cho khô. - Hê dung môi pha dung tÿ le và cho vào bînh chay sâc kÿ dé bâo hoà, sau dô dât bân mông vào binh sâc kÿ cho dung môi chay 3/4 bân mông, dânh dâu vét dung môi (Dm). - Dânh giâ két quâ : + Soi duôi dèn tü ngoai : phât hiên vét duôi ânh sâng tir ngoai X = 254nm. + Hiên hïnh VSV : dât bân mông sâc kÿ vào dïa pétri vô trùng, dé môi truông thach dâ cây VSV kiém dinh phü lên bê mât cûa bân mông dé phât trién 37°C/24h. Vông vô khuân së xuât hiên nêu cô vêt khâng sinh. + Tmh Rf : do khoâng câch tù diëm xuât phât dén diëm chay cûa câc vét (Dv). Rf duoc tmh theo công thirc : Rf = Dv/Ddm. 6. Xâc dinh ânh huông cüa pH dén dô bên vùng cüa khâng sinh trong dich lên men - Dich lên men duoc phân vào 11 ong nghiêm, môi ong 10ml. Diêu chînh pH trong câc ong nghiêm lân luot tù 2 dén 12, bâo quân trong tü lanh. - Thü hoat tmh khâng sinh cüa dich lên men sau khi diêu chînh pH vê trung tmh bàng phuong phâp duc lô thach. Lân thü thu* nhât sau 1 ngày, lân 2 sau 7 ngày. 7. Xâc dinh khâng sinh nôi bào - Dich lên men sau khi dem loc thu duoc dich loc và phân sinh khoi. Sinh khoi sau khi duoc rira bàng nuôc cât, dem sây à nhiêt dô duôi 50°C cho dén khô. - Tien hành chiét vôi tÿ le Vdm/Vsinh khôj = 5/1. Nghiên kÿ sinh khoi trong coi sir, cho dung môi vào trôn dêu dë dung môi thâm dêu sinh khoi trong khoâng 2h, gan lây dung môi. - Tien hành thur hoat tmh khâng sinh trong dung môi bàng phuongphâp khoanh giây loc. Vông vô khuân së xuât hiên néu co khâng sinh. 8. Phuong phâp phân loai xa khuân (ISP) [13,14] - Chuân bi giông : giông sau khi phân lâp duoc cây trong ong thachnghiêng dû 6 - 1 0 ngày tuoi duoc sir dung làm phân loai. - Xâc dinh dâc diém hînh thâi và sac to : + Màu cûa khuân ty khi sinh : quan sât màu cüa bê mât khuân lac phât triën trên ISP1, ISP2, ISP4, ISP5 sau 7, 14, 21 ngày néu cô màu trâng kÿ hiêu W (white), màu xâm kÿ hiêu Gy (gray), màu dô kÿ hiêu R (red), màu vàng kÿ hiêu Y (yellow), xanh lâ cây kÿ hiêu Gn (green), xanh da trôi kÿ hiêu B (blue), màu tîm kÿ hiêu V (violet) và không cô màu hoâc màu không xâc dinh kÿ hiêu X (not determined). Khi bê mât khuân lac xuât hiên màu trung gian giüa hai khoàng màu thi ta kÿ hiêu cà hai. + Sâc tô melanoid : quan sât su tao thành sâc tô' cüa khuân lac trên ISP6; ISP7; sau 2, 4 ngày néu cô màu trâng kÿ hiêu 1, không xuât hiên sâc tô kÿ hiêu 0. Trong mot sô truông hop, su tao thành sâc tô melanoid bi tri hoân hoâc yéu thi kÿ hiêu v (variable). + Màu cüa khuân ty co chât : quan sât mât sau cüa khuân lac phât triën trên ISP1, ISP2, ISP4, ISP5 sau 7, 14, 21 ngày néu cô màu dâc trung nhu xanh, dô, tfm, vàng; xanh la cây thî kÿ hiêu 1; néu không màu kÿ hiêu 0. Sàc tô hoà tan : quan sât su tao thành sâc tô cüa khuân lac trên ISP1, ISP2, ISP4, ISP5 sau 2, 4 ngày cô sâc tô kÿ hiêu 1; không cô sâc tô kÿ hiêu 0. Hinh dang chuôi bào tü : néu dang chuôi bào tü thang, uôn cong thî kÿ hiêu RF (rectiflexibiles); môc câu thî kÿ hiêu RA (retinaculiaperti); xoân ôc, lô xo thî kÿ hiêu S (spirales); moc thành vông don không xoân, vông don cô xoân, vông dôi không xoân, vông dôi cô xoân thî kÿ hiêu V(verticillati). Khi xuât hiên câ hai dang thî kÿ hiêu câ hai. Bê mât bào tü : dua vào câ'u truc bê mât cüa bào tü néu phâng nhân kÿ hiêu sm (smooth), gai kÿ hiêu sp (spiny), mun corn kÿ hiêu wa (warty), toc kÿ hiêu ha (hairy). Khà nâng tiêu thu nguôn Carbon : * Cây chüng trên ISP9 và dânh gia khà nâng tiêu thu duông à ngày thü 7, thü 14 và ngày thü 21. * So sânh khâ nâng tiêu thu cüa câc nguôn duông vôi duông Glucose : néu cô sü dung nguôn duông (xa khuân phât trién trên môi truông tuong duong so vôi xa khuân phât triën trên Glucose) thi kÿ hiêu +, néu không sü dung duông (xa khuân không moc) thî kÿ hiêu -, néu không rô ràng (xa khuân trên môi truông moc kém hem so vôi xa khuân moc trên Glucose) thî kÿ hiêu ±. 2.2. KÊT QUÂ VÀ NHÂN XÉT 2.2.1. Xâc dinh tên khoa hoc cüa xa khuan 14.1.5 Két quâ dânh giâ : - Màu cûa khuàn ty khi sinh : tràng, xâm. - Sâc to melanoid : không cô. - Màu khuân ty co chât : vàng n h a t, tràng. - Sâc tô hoà tan : không cô. - Hinh dang chuôi bào tü : thang, uôn cong (hinh 2) - Bê mât bào tü : nhân (hînh 3) - Tiêu thu câc nguôn ducmg : sü dung hâu hét câc nguôn duông. Dem dôi chiéu vôi câc dàc diëm cüa chûng xa khuàn 14.1.5 vôi câc loài Streptomyces trong khoâ phân loai ISP ta so bô thây trùng vôi Streptomyces orientalis. Két quâ duoc trînh bày ô bàng 3 : Bans 3: So sânh câc dâc diêm phân loai cûa Streptomyces 14.1.5 voi Streptomyces orientalis Dâc diëm STT Streptomyces 14.1.5 Strep. orientalis Trâng, xâm WGy WGy 1 Màu khuân ty khi sinh 2 Sâc tô melanoid 0 0 3 Màu khuân ty co chât 0 0 4 Sâc tô hoà tan 0 0 5 Hînh dang chuôi bào tü Thâng, uôn cong RF RF 6 Bê mât bào tü Nhân sm sm 7 Arabinose ± + 8 Xylose + + 9 Inositol + + 10 Mannitol + + 11 Fructose + + 12 Rhamnose + + 13 Sucrose + ± 14 Raffinose ± ± Nhân xét : Trong tât cà câc loài cüa chi Streptomyces chüng tôi nhân thây Streptomyces 14.1.5 và Streptomyces orientalis giông nhau ô phân lôn câc dâc diém phân loai, tuy nhiên cô khâc nhau ô phân tiêu thu nguôn Carbon : arabinose và sucrose. Dua vào két quâ trên, so bô két luân Streptomyces 14.1.5 là Streptomyces orientalis. 2.2.2. Thir hoat tinh sinh khâng sinh cua xa khuân sau khi phân lâp Khâ nâng sinh tong hop khâng sinh cüa chüng Streptomyces 14.1.5 trên môi truùng 1 (MT1) Vôi mue dich thü khà nâng sinh tong hop khâng sinh cüa VSV sau khi phân lâp, chüng tôi tien hành thü trên môi trucmg 1 (MT1). Thü hoat tmh khâng sinh theo phuong phâp dât khôl thach. Kêt quà duoc giôi thiêu à bàng 4 Banu 4 : Kêt quâ thü hoat tinh khâng sinh trên MT1 STT VSV kiëm dinh Hoat tinh khâng sinh (mm) BC 15,58 1 2 Bp 17,06 3 Bs 11,08 4 SL 14,62 5 Sta 13,24 6 EC 12,24 7 Pro 21,62 8 Pseu 15,80 9 Shi 18,74 10 Typ 12,82 Nhân xét : Tir bàng trên tôi thây VSV cô khà nâng sinh tong hop khâng sinh üc ché su phât trién cüa VSV kiëm dinh. Tiëp tue tien hành nghiên cüu. * Kêt quâ thü hoat tinh khâng sinh cüa Streptomyces 14.1.5 trên câc môi truùng khâc nhau Nhâm tim môi truông thfch hop dë xa khuân 14.1.5 tong hop khâng sinh manh nhât và kiëm tra khâng sinh dô cô tâc dung tôt trên chüng VSV kiëm dinh hay không, chüng tôi tien hành nuôi cây Streptomyces 14.1.5 trên câc môi trucmg sinh khâng sinh khâc nhau và thir tâc dung khâng khuàn trên nhiêu loai VSV kiëm dinh bàng phuong phâp dat khôi thach. Két quâ giôi thiêu ô bâng 5 : Bans 5 : Kê't quâ thü hoat tinh khâng sinh cüa Streptomyces 14.1.5 trên câc môi truàng khâc nhau Duông kînh vông vô khuân (mm) MT BC Bs Bp SL Sta Pseu Shi Pro EC Typ MT1 13,00 8,84 9,68 11,34 10,10 9,82 13,46 12,62 13,18 10,20 MT2 11,62 7,26 8,04 8,82 10.20 7,80 13,20 11,90 10,62 9,00 MT3 13,40 8,44 9,82 10,60 11,54 10,10 12,30 13,20 16,26 9,52 MT4 10,30 7,86 10,20 9,04 9,16 9,72 8,24 11,12 9,72 7,40 MT5 9,92 9,02 8,62 10,08 10,68 9,90 14,50 12,30 14,52 7,10 MT6 16,60 12,50 10,60 14,02 15,90 13,60 14,12 16,50 15,50 9,12 MT7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Nhân xét: - Xa khuàn 14.1.5 không tong hop khâng sinh trên MT7, do vây câc nghiên cüu tiép theo chüng tôi không chon MT7. - Xa khuàn 14.1.5 phât triën tôt trên MT1 và tong hop khâng sinh manh nhât trên MT6, do vây chüng tôi chon MT1 làm môi truông giû giong và MT6 dé thü hoat tmh sinh khâng sinh. - Xa khuàn 14.1.5 tâc dung manh trên hai chûng VSV kiëm dinh là dôi vôi Gr(+) là Bacillus cereus, Gr (-) là Pseudomonas aeruginosa. Nên chüng tôi chon hai chüng VSV kiëm dinh này cho nhûng nghiên cüu tiép theo. 2.2.3. Két quâ câi tao giong VSV * Két quâ sàng loc ngâu nhiên Sau khi sàng loc, nhàm mue dich giû lai câc bién chüng cô hoat tmh khâng sinh cao chüng tôi tién hành thü hoat tmh khâng sinh cüa câc bién chüng này theo phirang phâp dât khô'i thach. Két quâ sàng loc ngâu nhiên duoc giôi thiêu ô bàng 6. Bans 6 : Két quâ sàng loc ngâu nhiên Hoat tmh khâng sinh Bien chüng Pseu BC D (mm) S D (mm) S 1,57 13,42 1,06 1 14,92 2 0 3 17,24 1,64 17,00 1,74 4 16,12 1,21 17,82 0,96 5 17,68 0,77 17,56 1,24 6 17,34 1,40 16,92 0,67 7 18,86 0,69 17,70 0,55 8 17,63 0,67 16,50 0,79 9 15,54 1,14 17,62 0,80 10 16,43 1,27 16,22 0,95 11 13,82 2,29 15,02 1,05 12 0 13 17,47 2,50 16,20 2,04 14 17,51 1,04 16,80 1,21 15 17,12 0,55 16,72 1,02 16 17,37 0,26 15,82 0,69 17 17,41 0,95 17,00 0,89 18 16,53 1,07 16,02 1,58 19 16,38 2,06 16,34 2,07 20 18,22 1,97 17,68 1,21 0 0 Nhân xét : Nhîn chung, sau sàng loc câc bien chüng dêu co hoat tmh khâng sinh cao hün so vôi chüng gôc, trong dô chüng 7, 8, 14 cô hoat tmh cao hon vôi dô lêch chuân cho phép nên chüng tôi giû lai dë tien hành nghiên cüu tiëp. * Kêt quâ sau khi dôt bien Nhâm nâng cao hon nûa hiêu suât sinh khâng sinh dë dua vào sân xuât, chüng tôi tien hành nghiên cüu câi tao giông bàng phuong phâp dôt bien dôi vôi chüng sàng loc 7. Dânh giâ kêt quâ dôt bien bàng phuong phâp dàt khoi thach. Kët quâ duoc trinh bày à bâng 7. B âns 7: Két quâ thü hoat tinh khâng sinh sau dôt bien Hoat tmh khâng sinh Bien Pseu BC chüng S D (mm) 1 12,67 13,53 1,69 1,01 14,70 2 14,79 3 15,08 14,45 0,49 4 15,62 1,37 15,50 12,64 5 14,47 0,39 6 12,15 0,65 11,37 7 0,60 14,51 14,69 8 0,38 11,73 13,59 14,13 15,43 1,55 9 13,49 10 15,07 1,99 0,67 15,01 14,59 11 1,06 15,25 15,55 12 0,49 16,47 17,47 13 17,32 16,05 1,39 14 15,96 14,87 0,96 15 17,12 1,35 15,33 16 16,53 0,60 17 13,59 16,55 0,90 14,16 18 16,38 1,14 16,27 19 16,18 0,95 20 11,91 16,53 0,85 16,57 21 15,65 3,09 15,15 22 12,89 0,87 13,82 23 14,22 0,09 15,60 24 15,00 0,77 15,98 25 15,89 0,89 16,88 26 16,00 1,21 15,00 27 12,89 1,22 12,00 28 14,08 0,92 13,89 29 15,09 0,64 14,10 Chûng S 0,44 0,51 0,11 0,12 0,64 0,74 0,53 0,55 0,09 1,83 0,89 0,35 0,49 0,79 0,60 1,72 1,73 2,80 1,18 0,15 1,44 2,89 1,65 0,65 0,89 1,00 1,65 2,00 1,21 1,64 Nhân xét : - Qua bàng két quâ trên ta thây khâ nàng sinh khâng sinh cûa câc bién chüng 1, 6, 8, 17, 20, 23, 28, 29 yéu hon so vôi mâu chüng, két quâ dôt bién âm tmh. Không tién hành nghiên cüu nhûng chüng này. - So vôi mâu chüng, câc bién chüng côn lai cô khâ nâng tong hop khâng sinh manh hon, két quâ dôt bién duang tmh, trong dô bién chüng 13, 14 cô hoat tmh manh nhât nên chüng tôi giü lai dé nghiên cüu tiép. - Dô song sot sau dôt bién là 0,60%. * Két quâ lên men cüa câc chüng dâ lua chon trên môi truàng lên men MT6* De dânh giâ quâ trînh câi tao giông chüng tôi tién hành lên men dông thôi chüng goc, chüng sau sàng loc và chüng sau dôt bién. Két quâ duoc kiém tra bàng phuong phâp duc lô thach. Két quâ duoc giôi thiêu ô bàng 8. Bans 8 : Két quâ lên men chim trên mây lâc Hoat tmh khâng sinh BC Bién chüng Pseu S D (mm) 14.1.5 S D (mm) 0 0 14.1.5.7 11,02 0,89 11,89 0,95 14.1.5.8 11,00 0,65 10,22 0,89 14.1.5.14 9,89 1,58 10,00 1,02 7.13 16,94 0,55 15,54 1,02 7.14 15,89 1,55 15,44 0,99 Nhân xét : Qua két quâ trên chüng tôi thây khi lên men trên cùng mot môi truông nhung chüng sau dôt bién cô hoat tmh khâng sinh cao hon so vôi chüng goc và chüng sau sàng loc, co thé kët luân công tac câi tao giông dat kët quâ tôt. 2.2.4. Kët quâ lên men chim trên mây lâc * Kêt quâ thü hoat tinh khâng sinh trên câc môi tru&ng lên men khâc nhau Ngoài câc yëu tô pH, nhiêt dô, toc dô khuây ... thi môi truông dinh duông ânh huông nhiêu dën quâ trinh lên men. De lua chon môi truông lên men thich hop chüng tôi tiën hành lên men dôi vôi chüng dôt biê'n 13 trên câc môi truông lên men khâc nhau. Dânh giâ kët quâ bàng phuong phâp duc lô thach. Kët quâ duoc trinh bày ô bàng 9. Bâng_9: Kê't quâ thü hoat tinh khâng sinh cüa dich lên men trên câc MT khâc nhau. Hoat tinh khâng sinh Bien MT lên chüng men BC Pseu 13 D (mm) D (mm) S S MT1* 12,62 1,22 11,89 0,97 MT2* 10,00 1,49 8,99 0,88 MT6* 16,94 0,55 15,54 1,02 Nhân xêt : - Streptomyces 14.1.5 sinh khâng sinh trên câc môi truông nghiên cüu và khâ nâng manh nhât trên môi truông lên men 6 (MT6*). - Sü dung dich loc cô hoat tmh khâng sinh dé nghiên cüu tiëp vê dô on dinh và câc dung môi chiët thich hop. 2.2.5. Kët quâ thû dô on dinh cüa dich lên men chüfa khâng sinh Dé nghiên cüu su ânh huông cüa pH dën su on dinh cüa dich chiët chüa khâng sinh. Kët quâ duoc trinh bày ô bâng 10. Bâng 10: Két quâ thü dô on dinh cüa dich lên men chûa khâng sinh Hoat tinh khâng sinh Psen pH BC Sau 7 ngày Sau 1 ngày D S D (mm) S Sau 1 ngày D S (mm) (mm) Sau 7 ngày D S (mm) 2 11,00 0,89 0 11,46 1,21 0 3 11,46 0,65 0 10,74 1,89 0 4 11,24 1,32 9,00 1,44 11,00 0,89 8,88 1,02 5 12,22 2,00 12,00 1,09 10,98 0,65 10,00 0,99 6 11,14 0,75 10,00 1,23 11,20 0,99 10,02 1,25 7 11,34 0,98 9,98 2,03 10,22 0,65 9,90 1,23 8 10,60 1,21 9.00 0,89 9,98 1,45 9,00 2,01 9 10,72 1,89 9,00 1,87 9,90 1,45 8,88 0,99 10 9,62 1,00 8,82 0,98 10,00 1,21 9,00 1,17 11 0 12 0 0 0 ! Nhân xét : - Qua bàng trên chüng tôi nhân thây sau mot ngày dich loc mât hoat tmh khâng sinh à pH 11 và 12; bén ô pH acid, trung tmh và hoi kiëm. - Sau mot tuân khâng sinh mât hoat ô pH acid 3 và 4; côn à câc pH khâc hoat lue khâng sinh co giàm so vôi mot tuân truôc dô. - Tir dô chüng tôi rût ra két luân nghiên cü'u chiét xuât khâng sinh à câc pH trong khoâng tir 5 dên 10. 2.2.6. Két quâ chiét xuâl và tinh ché * Két quâ chiét khâng sinh tic dich lên men sang dung môi hüu co Khâng sinh trong dich loc duoc chiét mot lân bàng nhiêu dung môi hûu co ô câc pH khâc nhau de tim pH thïch hop cho môi loai dung môi. Dânh giâ hoat tmh pha dung môi và pha nuôc sau khi chiét bàng phuong phâp khoanh giây loc vôi VSV kiëm dinh là Bacillus cereus. Két quâ duoc trinh bày ô bàng Bàng 11 : Két quâ chiét khâng sinh tù dich lên men sang dung môi hûu co Hoat tmh khâng sinh trên Pseu Dung môi PH Ethyl acetat Buthyl acetat n - butanol Pha nirôc 10,20 0 7 ' 8,14 9,82 9 8,88 0 5 11,60 0 7 13,64 0 9 9,94 0 5 11,00 6,89 7 9,72 0 9 0 0 5 0 10,02 7 0 12,50 9 0 8,98 5 Cloroform Pha dung môi Nhân xét : - Chüng tôi thây ràng cô thé chiét hoàn toàn khâng sinh sang pha dung môi bàng ethyl acetat ô câc pH 5, 7 và 9. - Không sü dung n - butanol dé chiét xuât do khâng sinh vân nàm trong pha nuôc. - Câc dung môi côn lai : Cloroform, buthyl acetat chiét không hoàn toàn. Do vây sir dung dung môi.ethyl acetat dë chiét khâng sinh nôi bào, dich chiét ethyl acetat dë nghiên cüu dich châm chay sâc kÿ. * Kêt quâ chiét khâng sinh nôi bào Dung môi ethyl acetat duoc sir dung dë chiét xuât khâng sinh nôi bào, kiëm tra khâng sinh nôi bào bàng phuong phâp khoanh giây loc. Két quâ duoc trinh bày à bàng 12. Bâng_ 12 : Kêt quâ chiét khâng sinh nôi bào Hoat tmh khâng sinh Mâu thir Dich chiê't BC Pseu D (mm) S D (mm) S 8,74 0,55 9,00 0,45 sinh khoi Nhân xét: Tir bàng trên chüng tôi nhân thay Streptomyces 14.1.5 co khâng sinh nôi bào, tuy nhiên tuy nhiên luong khâng sinh nôi bào là khâ thâp nên chüng tôi không tién hành nghiên cüu tiép. * Kêt quâ sâc ky lâp mông Dich chiét ethyl acetat duoc sü" dung dë châm sâc kÿ. Sau khi tién hành chay sâc kÿ vôi mot sô' hê dung môi khâc nhau nhung chüng tôi chua phât hiên duoc vêt bàng soi tir ngoai và tién hành kiëm tra bàng VSV vân chua xuât hiên vêt khâng sinh. Câc thi nghiêm này cân duoc nghiên cüu tiê'p. PHÂN 3 KÉT LUÂN VÀ DÊ XUÂT 3.1. Két luân Sau khi nghiên cûu chüng tôi dâ hoàn thành mue tiêu dé ra và rüt ra két luân : 3.1.1. Vê phân loai, dinh tên xa khuàn: Xa khuàn 14.1.5 cô rat nhiêu dâc diëm trùng vôi Streptomyces orientalis nên vê co bân két luân râng xa khuàn 14.1.5 cô tên khoa hoc là Streptomyces orientalis. 3.1.2. Vê quâ trînh câi tao giông - Trong câc môi truông dâ khâo sât, MT6 là môi truông mà Streptomyces 14.1.5 cô khâ nâng sinh tong hop khâng sinh manh nhât. - Dôt bién câi tao giông cho câc bién chüng tong hop khâng sinh tâng hon so vôi chûng môi phân lâp. 3.1.3. Vê nghiên cûu quâ trînh lên men: - Trong câc môi truông dâ khâo sât, MT6* là môi truông mà Streptomyces 14.1.5 cô khâ nâng sinh téng hop khâng sinh manh nhât. - Dich loc khâng sinh tuong dôi én dinh à pH = 5-10. 3.1.4. Vê chiét xuât và tinh ché: - Trong câc dung môi dâ khâo sât thi ethyl acetat chiét tôt nhât à câc pH 5, 7, 9. - Sâc kÿ lôp mông chua phât hiên duoc vét khâng sinh. 3.2. Dê xuât 1. Do thôi gian cô han câc thi nghiêm nghiên cûu sâc kÿ chua hoàn thành nên cân tiép tue nghiên cûu thêm dë tim hê dung môi phù hop. 2. Xâc dinh câu trüc hoâ hoc và tâc dung sinh hoc cüa khâng sinh này. 3. Cân nghiên cûu thêm vê chüng xa khuàn này. PHU LUC Hïnh 3: Bê mât bào tir quan sât à dô phông dai 20000 Hinh 4: Thü hoat tinh khâng sinh cüa chüng gôc bàng phuong phâp dât khoi thach trên chüng VSV kiém dinh Bacillus cereus Hinh 5: Thü hoat tinh khâng sinh cüa dich loc sau lên men bàng phuong phâp giéng thach TÀI LIÊU THAM KHÂO * Tài lieu tiéng Viêt: 1. Nguyên Thi Thanh Dung (2002), Luân vân tôt nghiêp truông Dai Hoc Duoc Hà Nôi, Gôp phân nghiên cûu khâng sinh tù chüng Streptomyces 324. 2. Phan Dinh Châu, Nguyên Viêt Huong, Tir Minh Koông, Dô H Cru Nghi (2001), Kÿ thuât Sân xuât Duoc Phâm, Truông Dai Hoc Duoc Hà Nôi, tâp I, trang 142- 159. 3. Nguyên Lân Düng, Nguyên Dinh Quyén, Pham Vân Ty (2000), Vi sinh vât hoc, Nhà xuât bàn Giâo Duc, trang 3 9 -4 1 . 4. Nguyên Vân Dàn, Nguyên Viêt Tuu (1985), Phuong phâp nghiên cûu hoâ hoc cây thuoc, Nhà xuât bàn Y hoc, trang 9 -13. 5. Kiêu Khâc Dôn, Nguyên Le Phi (1999), Vi sinh hoc, Truông Dai Hoc Duoc Hà Nôi, trang 24, 25. 6. Pham Gia Hue, Tràn Tù" An (2002), Hoâ hoc phân tich, Truông Dai Hoc Duoc Hà Nôi, tâp II, trang 49 -54. 7. Nguyên Thi Huong (2001), Luân vân tôt nghiêp truông Dai Hoc Duoc Hà Nôi, Nghiên cûu câi tao giong và phât trién công nghê lên men khâng sinh nhà chüng Micromonospora N°9. 8. Phan Quôc Kinh, Huÿnh Kim Thoa, Tràn Dire Hâu, Thâi Duy Thin, Nguyên Dinh Hiën, Nguyên Vân Thuc (1998), Hoâ duoc, Truông Dai Hoc Duoc Hà Nôi, tâp II, trang 182 - 282. 9. Chu Thi Lôc (1999), Kiém nghiêm thuoc bàng phuong phâp sinh hoc, Truông Dai Hoc Duoc Hà Nôi, trang 2 9 -3 5 . 10. Ho Viêt Quÿ (2001), Chiét tâch, phân chia, xâc dinh câc chât bàng dung môi hûu co, Nhà xuât bân Khoa Hoc Kÿ Thuât, trang 14, 15. 11. Wolfgang Fritsche (1983), Co sâ hoâ sinh cüa vi sinh vât công nghiêp, Nhà xuât bàn Khoa Hoc- Kÿ Thuât, trang 22, 23, 41- 45. * Tài lieu tiéng Anh: 12. Haruo Tanaka, Harumi Chiba, Junji Inokoshi, and Satoshi Omura (2001), “Anti-HIV antibiotic that block viral entry to cells”, Proceedings of Pharma Indochia II, Ha Noi, p.413-416. 13. Hideo Nonomura (1974),' “Key for classification and Identification of 458 Species of Streptomycetes Included in ISP”, J.Ferment. Technol., Vol.52, No.2, p.78-92. 14. E.B Shirling and D.Gottlieb (1966), “Methods for characterization of Streptomyces species”, International Joural o f Systematic Bacteriology, Vol. 16, No.3, p.313-340. 15. Shigetoshi Okada,Sinroku Iwamatu (1997), “Scale up production of Milbemycin by Streptomyces hygroscopicus subsp. aureolacrimosus with Control of Internai pressure, Temperature, Acration and Agitation”, J. Chem. Technol. Biotechnol, Vol.70, p.179-187. [...]... sinh sau dụt bien Hoat tmh khõng sinh Bien Pseu BC chỹng S D (mm) 1 12,67 13 ,53 1, 69 1, 01 14 , 70 2 14 , 79 3 15 ,08 14 , 45 0,49 4 15 ,62 1, 37 15 ,50 12 ,64 5 14 , 47 0,39 6 12 , 15 0, 65 11 ,37 7 0,60 14 , 51 14 , 69 8 0,38 11 ,73 13 ,59 14 , 13 15 ,43 1, 55 9 13 ,49 10 15 ,07 1, 99 0,67 15 , 01 14 , 59 11 1, 06 15 , 25 15 ,55 12 0,49 16 ,47 17 ,47 13 17 ,32 16 , 05 1, 39 14 15 ,96 14 , 87 0,96 15 17 ,12 1, 35 15 ,33 16 16 ,53 0,60 17 13 ,59 16 ,55 ... 16 ,55 0,90 14 , 16 18 16 ,38 1 ,14 16 ,27 19 16 ,18 0, 95 20 11 , 91 16 ,53 0, 85 16 ,57 21 15, 65 3,09 15 , 15 22 12 ,89 0,87 13 ,82 23 14 , 22 0,09 15 ,60 24 15 ,00 0,77 15 ,98 25 15 ,89 0,89 16 ,88 26 16 ,00 1, 21 15, 00 27 12 ,89 1, 22 12 ,00 28 14 , 08 0,92 13 ,89 29 15 ,09 0,64 14 , 10 Chỷng S 0,44 0, 51 0 ,11 0 ,12 0,64 0,74 0 ,53 0 ,55 0,09 1, 83 0,89 0, 35 0,49 0,79 0,60 1, 72 1, 73 2,80 1, 18 0 , 15 1, 44 2,89 1, 65 0, 65 0,89 1, 00 1, 65 2,00... 17 ,70 0 ,55 8 17 ,63 0,67 16 ,50 0,79 9 15 ,54 1 ,14 17 ,62 0,80 10 16 ,43 1, 27 16 ,22 0, 95 11 13 ,82 2,29 15 ,02 1, 05 12 0 13 17 ,47 2 ,50 16 ,20 2,04 14 17 , 51 1,04 16 ,80 1, 21 15 17 ,12 0 ,55 16 ,72 1, 02 16 17 ,37 0,26 15 ,82 0,69 17 17 , 41 0, 95 17 ,00 0,89 18 16 ,53 1, 07 16 ,02 1, 58 19 16 ,38 2,06 16 ,34 2,07 20 18 ,22 1, 97 17 ,68 1, 21 0 0 Nhõn xột : Nhợn chung, sau sng loc cõc bien chỹng dờu co hoat tmh khõng sinh cao hỹn... MT2 11 ,62 7,26 8,04 8,82 10 .20 7,80 13 ,20 11 ,90 10 ,62 9,00 MT3 13 ,40 8,44 9,82 10 ,60 11 ,54 10 ,10 12 ,30 13 ,20 16 ,26 9 ,52 MT4 10 ,30 7,86 10 ,20 9,04 9 ,16 9,72 8,24 11 ,12 9,72 7,40 MT5 9,92 9,02 8,62 10 ,08 10 ,68 9,90 14 , 50 12 ,30 14 , 52 7 ,10 MT6 16 ,60 12 ,50 10 ,60 14 , 02 15 ,90 13 ,60 14 , 12 16 ,50 15 ,50 9 ,12 MT7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Nhõn xột: - Xa khun 14 . 1. 5 khụng tong hop khõng sinh trờn MT7, do võy cõc nghiờn... khõng sinh cao chỹng tụi tiộn hnh thỹ hoat tmh khõng sinh cỹa cõc biộn chỹng ny theo phirang phõp dõt khụ'i thach Kột quõ sng loc ngõu nhiờn duoc giụi thiờu ụ bng 6 Bans 6 : Kột quõ sng loc ngõu nhiờn Hoat tmh khõng sinh Bien chỹng Pseu BC D (mm) S D (mm) S 1, 57 13 ,42 1, 06 1 14 , 92 2 0 3 17 ,24 1, 64 17 ,00 1, 74 4 16 ,12 1, 21 17,82 0,96 5 17 ,68 0,77 17 ,56 1, 24 6 17 ,34 1, 40 16 ,92 0,67 7 18 ,86 0,69 17 ,70 0 ,55 ... nõng sinh tong hop khõng sinh cỹa VSV sau khi phõn lõp, chỹng tụi tien hnh thỹ trờn mụi trucmg 1 (MT1) Thỹ hoat tmh khõng sinh theo phuong phõp dõt khụl thach Kờt qu duoc giụi thiờu bng 4 Banu 4 : Kờt quõ thỹ hoat tinh khõng sinh trờn MT1 STT VSV kiởm dinh Hoat tinh khõng sinh (mm) BC 15 ,58 1 2 Bp 17 ,06 3 Bs 11 ,08 4 SL 14 , 62 5 Sta 13 ,24 6 EC 12 ,24 7 Pro 21, 62 8 Pseu 15 ,80 9 Shi 18 ,74 10 Typ 12 ,82... trucmg sinh khõng sinh khõc nhau v thir tõc dung khõng khun trờn nhiờu loai VSV kiởm dinh bng phuong phõp dat khụi thach Kột quõ giụi thiờu ụ bõng 5 : Bans 5 : Kờ't quõ thỹ hoat tinh khõng sinh cỹa Streptomyces 14 . 1. 5 trờn cõc mụi trung khõc nhau Duụng kợnh vụng vụ khuõn (mm) MT BC Bs Bp SL Sta Pseu Shi Pro EC Typ MT1 13 ,00 8,84 9,68 11 ,34 10 ,10 9,82 13 ,46 12 ,62 13 ,18 10 ,20 MT2 11 ,62 7,26 8,04 8,82 10 .20... Streptomyces 14 . 1. 5 v Streptomyces orientalis giụng nhau ụ phõn lụn cõc dõc diộm phõn loai, tuy nhiờn cụ khõc nhau ụ phõn tiờu thu nguụn Carbon : arabinose v sucrose Dua vo kột quõ trờn, so bụ kột luõn Streptomyces 14 . 1. 5 l Streptomyces orientalis 2.2.2 Thir hoat tinh sinh khõng sinh cua xa khuõn sau khi phõn lõp Khõ nõng sinh tong hop khõng sinh cỹa chỹng Streptomyces 14 . 1. 5 trờn mụi truựng 1 (MT1) Vụi... MgS04.7H20 0,5g; NaCl 0,5g; FeS04.7H20 lOmg; Thach 18 ,0g; Nuục vira dỷ 10 00ml; pH 6,8 -7,2; lat/30C MT sinh khõng sinh: + MT2 : Tinh bụt 20,0g; N aN 03 2,0g; K2HP04 1, 0g; MgS04.7H20 0,5g; KC1 0,5g; Thach 18 ,0g; Nuục vira dỷ 10 00ml; pH 6,8 - 7,2; lat/30C + MT3 : Lactose 30,0g; NH4N 0 3 2,0g; Cao ngụ 5, 0g; KH2P 0 4 1, 0g; MgS04.7H20 0,5g; Na2S04 0,5g; CaC03 30,0g; Thach 18 g; Nuục vựra du 10 00ml; pH 6,8... MT lờn men : + MT1* : Tinh bụt 20,0g; K N 03 1, 0g; K2H P04 0,5g; MgS04.7H20 0,5g; NaCl 0,5g; FeS04.7H20 lOmg; Nuục vựa dỷ 10 00ml; pH 6,8-7,2; lat/30C + MT2* : Tinh bụt 20,0g; N aN 03 2,0g; K2H P04 1, 0g; MgS04.7H20 0,5g; KC10,5g; Nirục vira dỷ 10 00ml; pH 6,8-7,2; lat/30C + MT6* : Bụt dõu tuong 15 ,0g; Tinh bụt 20,0g; (NH4)2S04 2,0g; Cao nam men 5, 0g; CaC03 4,0g; CoC12.7H20 0,002g; Nuục vira dỷ 10 00ml;