Góp phần tiêu chuẩn hóa chế phẩm bột tam hoàng của bệnh viện y học cổ truyền cao bằng

Bằng phưcmg pháp phân tích trên sắc ký lỏng cao áp với sự lựa chọn của dung môi thích hợp, từ dịch chiết thô của Hoàng liên, người ta đã phân lập được 4 alcaloid là: berberin, epiberberi

BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

TRẦN DUY ĐÔNG

GÓP PHẦN TIÊU CHUẨN HOÁ CHÊ PHẨM

CỔ TRUYỂN CAO BANG

( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c SỸ KHOÁ 1997-2002 )

Người hưóng dẫn: PGS.TS.; PHẠM XUÂN SINH

THS.: ĐÀO THỊ THANH HIỀN

Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền

Phòng thí nghiệm vi sinh - kháng sinh

- Bộ môn công nghiệp Dược

Thời gian thực hiện: 22/02/02 - 22/05/02

\ Ằ Ì ố / o

Hà Nội, tháng 5 năm 2002

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc tớ i:

PGS.TS PHẠM XUÂN SINH, Chủ nhiệm Bộ môn Dược học cổ truyền, THS ĐÀO THỊ THANH HlỀN, giáo viên Bộ môn Dược học cổ truyền, là những người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn ban giám đốc BVYHCT Tỉnh Cao Bằng, TS CAO VĂN THU Bộ môn công nghiệp Dược, các thầy cô ở Bộ môn Dược học

cổ truyền, phòng thí nghiệm vi sinh kháng sinh Bộ môn công nghiệp Dược, và cấc phòng chức năng trong trường đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện công trình tốt nghiệp này.

Hà N ộ i , ngày 25, tháng 5, năm 2002.

Sinh viên Trần Duy Đông

ĐẶT VẤN ĐỂ

MỤC LỤC

Trang

PHẦNl TỔNG QUAN 1

1 Xuất xứ Bột tam hoàng của BVYHCT Cao Bằng 1

2 Thành phần trong Bột tam hoàng Cao Bằng 2

2.1 Hoàng liên chân gà 2

2.1.1 Đặc điểm thực vật 2

2.1.2 Phiân bố và trồng hái 2

2.1.3 Thành phần hoá học 3

2.1.4 Tác dụng sinh học 4

2.1.5 Chê biến ! 5

2.1.6 Công năng chủ trị 6

2.2 Hoàng bá nam (Núc nác) 7

2.2.1 Đặc điểm thực vật 7

2.2.2 Phân bố và trồng hái 7

2.2.3 Thành phần hoá học 8

2.2.4 Tác dụng sinh học 9

2.2.5 Chế biến 10

2.2.6 Công năng chủ trị 10

2.3 Hoàng đằng 10

2.3.1 Đặc điểm thực vật 10

2.3.2 Pliân bố và trồng hái 11

2.3.3 Thành phần hoá học 11

2.3.4 Tác dụng sinh học 11

2.3.5 ạ ế b i ế n ; 11

2.3.6 Công năng chủ trị 11

2.4 Đồng Sulphat 12

2.4.1 Tính chất 12

2.4.2 Định tính 12

2.4.3 Thử tinh khiết 12

2.4.4 Định lượng 12

2.4.5 Công dụng trong phương thuốc 12

2.4.6 Bảo quản 12

PHÂN 2

1.

1.1.

1.2.

1.3

1.3.1

1.3.2

1.3.3

2.

2.1.

2.1.1.

2.1.2.

2.1.3

2.1.4

2.2.

2 2 1

2.2.2.

2.2.3

2.3

2.3.1

2.3.2

2.3.3

3

PHẦN 3

1

THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 13

NGUYÊN LỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỤC NGHỆM 13

Nguyên liệu 13

Phương tiện 14

Phương pháp thực nghiệm 14

Hoá h ọ c 14

Thử tác dụng kháng khuẩn 16

Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn hoá Bột tam hoàng 16

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT .16

Nghiên cứu về hoá học 16

Định tính 16

Định lượng Alcaloid 25

Định lượng Flavonoid 28

So sánh về hoá học giữa Hoàng liên SaPa và Hoàng liên thị trường 32

Thử tác dụng kháng khuẩn 33

Chuẩn bị nguyên liệu và môi trường 33

Tiến hành 35

Kết q u ả 36

Góp phần tiêu chuẩn hoá Chế phẩm Bột tam hoàng 38

Nguyên liệu .38

Chế biến 38

Kiểm định 38

BÀN LUẬN 40

KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 41

KẾT LUẬN 41

ĐỂ XUẤT 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHU LUC

Để phát huy tác dụng thuốc cổ truyền và sử dụng có hiệu quả hơn, một trong những điều cần quan tâm là vấn đề tiêu chuẩn hoá của thuốc Hè năm

2001 Trường đại học Dược Hà Nội có tổ chức đợt công tác tăng cường giúp đỡ chuyên môn cho các tỉnh miền núi phía bắc trong đó có tỉnh Cao Bằng Một trong những nội dung giúp đỡ cho tỉnh là tiêu chuẩn một số bài thuốc mà bệnh viện tỉnh đã bào chế: đó là Bột tam hoàng

Theo yêu cầu của bệnh viện, nhóm công tác của Trường đại học Dược

Hà Nội tại bệnh viện sẽ giúp đỡ tiêu chuẩn hoá Bột tam hoàng nói trên

Xuất phát từ ý tưởng đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu Bột tam hoàng của bệnh viện với những mục tiêu sau :

1 Kiểm nghiệm một số thành phần hoá học chính trong Bột tam hoàng

2 Sơ bộ nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của Bột tam hoàng

3 Góp phần xây dựng tiêu chuẩn cho Bột tam hoàng

PHẦN I : TỔNG QUAN

1 XUẤT XỨ BỘT TAM HOÀNG CỦA BVYHCTCB

Những năm gần đây BVYHCTCB có bào chế một chế phẩm Bột tam hoàng dùng cho bệnh nhân sau phẫu thuật thắt trĩ, bài thuốc này có xuất xứ từ phương thuốc Tam hoàng thang kinh điển của đông y:

Với cách gia giảm sáng tạo vận dụng các vị thuốc cổ truyền sẵn có ở Việt Nam BVYHCTCB đã bào chế ra chế phẩm Bột tam hoàng gồm các thành phần :

Hoàng liên chân gà (bột) lOOOg

Hoàng bá nam (b ộ t) lOOOg

Đồng Sulfat (dược dụng ) 100 g

Tất cả được trộn đều, đóng gói 30g trong 2 lần túi polyetylen được dùng ngâm rửa sau phẫu thuật thắt trĩ [phụ lục 1] Theo nhận xét sơ bộ của BVYHCTCB: Bột tam hoàng đã dùng cho 500 bệnh nhân và đã đưa lại kết quả tốt Do đó bệnh viện tiếp tục triển khai sản xuất mặt hàng này

2 THÀNH PHẦN TRONG BỘT TAM HOÀNG CAO BẰNG

2.1 HOÀNG LIÊN CHÂN GÀ

2.1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

Có nhiều loại Hoàng liên chân gà như Coptis chinensis Franch, Coptisteeta Wall, Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao, Coptis quinqueseeta, Coptisomeiensis(ơien) c Y Cheng, họ Hoàng liên: Ranunculaceae

Hoàng liên: Coptis chinensis Franch là cây thuộc thảo, sống nhiều năm,thân rễ màu vàng thường phân nhánh Lá có màu lục, bóng, có cuống dài mọc

tập trung ở gốc, lá dài mảnh chia làm 3 thuỳ chính Mép khía răng không đều,

thuỳ giữa gần giống tam giác cân xẻ thuỳ dạng lông chim,

không đều, hai thuỳ bên giống nhau có cuống

ngắn hơn thuỳ giữa, cụm hoa gồm 3-5 cái mọc tụ

' tán trên 1 cuống chung dài khoảng 25 cm Hoa

nhỏ màu vàng, lá bắc nhỏ, bao hoa màu lục

Năm lá đài hình mác, 5 cánh hoa thuôn dài, nhị

khoảng 20 cái Lá noãn 8-12 cái rời nhau, ra hoa

từ tháng 10-12 Qủa đại màu nâu đen từ tháng

12-4 sang năm, vào mùa xuân tái sinh chồi từ

thân rễ [2,3,4,7,10]

ở Việt Nam, Hoàng liên chân gà là loại cây thuốc hiếm thường mọc

hoang ở vùng núi có độ cao từ 1500-2000 m, nhiệt độ thích hợp từ 20-25°C

Trên dãy Hoàng liên sơn (xã Tả van, San tả hồ, Lao chải) Hoàng liên ưa chỗ mát, ẩm ướt nơi có nhiều cây cổ thụ ở nước ta chỉ có 2 loài: Coptis chinensis Franch và Coptis teeta Wall

Muốn trồng Hoàng liên, chọn các quả già nhưng chưa nứt vỏ, hái về phơi khô, khi nứt vỏ sẽ chọn các hạt mập chắc, có hạt phải tranh thủ gieo ngay

để lâu sẽ mất khả năng mọc Nếu chưa gieo phải lấy đất lẫn cát ẩm trộn với hạt Trong vòng 1 tháng phải trồng, để lâu hạt không mọc.

-Bộ phận dùng: thân rễ (Rhizoma coptidis) là những mẩu cong queo dài 3-5 cm, rộng 0,2-0,5 cm, có nhiều đốt khúc khuỷu và phân nhánh, trông giống hình chân gà nên còn được gọi là Hoàng liên chân gà Mặt ngoài màu vàng nâu mang vết tích của rễ phụ và của cuống lá Thể chất cứng rắn, vết bẻ ngang không phẳng Phần gỗ màu vàng tươi, vị rất đắng tồn tại lâu trong miệng [2,7,10,13]

Berberin tinh khiết kết tinh dạng tinh thể màu vàng, điểm nóng chảy 145°c, tan trong 22 phần nước ở 20°c, tan trong ethanol, ít tan trong cloroírom, benzen, không tan trong ether ethylic

Trong cây berberin tồn tại dưới dạng clohydrat Hàm lượng alcaloid thay đổi tuỳ theo vùng và thời kỳ sinh trưởng của cây ở Nga Vĩ Sơn (Tứ Xuyên ,Trung Quốc), hàm lượng berberin cao nhất vào tháng 9 và tháng 10, thấp nhất vào thời kỳ cây ra hoa[9,1 0]

Bằng phưcmg pháp phân tích trên sắc ký lỏng cao áp với sự lựa chọn của dung môi thích hợp, từ dịch chiết thô của Hoàng liên, người ta đã phân lập được 4 alcaloid là: berberin, epiberberin, palmatin và coptisin [19]

Công thức cấu tạo của 1 số alcaloid phân lập từ thân rễ Hoàng liên:

Berberin R| + R2 = - CH2 - Palmatin R| = R2 = - CH3 Jatrorhizin R[ = -H, R2 = -CH3

2.1.4 TÁC DỤNG SINH HỌC :

-Tác dụng kháng khuẩn: nước sắc Hoàng liên và hoạt chất berberin đều

có phổ kháng khuẩn rất rộng Nước sắc thể hiện tác dụng ức chế vi khuẩn ở các độ pha loãng sau: nồng độl:5120 có tác dụng với Shigella shiga; nồng độ 1:2560 có tác dụng với Shigella dysenteriea ; nồng độ 1: 1640 có tác dụng với Staphylococcus aureus [4,11]

Dung dịch berberin clohydrat dùng phương pháp pha loãng trong ống nghiệm, nồng độ 1:32000 có tác dụng ức chế với Vibrio cholerae; nồng độ 1;

8000 có tác dụng ức chế vi khuẩn đối với Shigella dysenteriae, Streptococcus viridans [4,11]

-Tác dụng đối với đcfn bào: quan sát dưới kính hiển vi berberin với nồng

độ 1:5000 và trên chuột nhắt trắng đã được gây nhiễm amip, cho uống với lượng 50 mg/ kg có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của amip gây bệnh

-Tác dụng kháng nấm gây bệnh: dịch chiết từ Hoàng liên có độ pha loãng 1:30 có tác dụng ức chế sự phát triển 1 số nấm gây bệnh ngoài da.

-Tác dụng kiện vị giúp tiêu hoá: dịch chiết từ Hoàng liên có tác dụng làm tăng nhẹ sự phân tiết dịch nước bọt, dịch vị, dịch mật và tăng cường hoạt động của ruột,dạ dày[2,3,7]-

- Tác dụng lợi mật của Hoàng liên trích giấm rất tốt [1]

- Tác dụng hạ sốt của Hoàng liên trích gừng rất tốt [1]

- Tác dụng hạ huyết áp: Tiêm dưới da dịch chiết của Hoàng liên hoặc berberin trên súc vật thí ngiệm có tác dụng làm hạ huyết áp tức thời, chế phẩm điều chế từ Hoàng liên đã loại bỏ berberin cũng có tác dụng làm hạ huyết áp trên chuột cống trắng [4,10]

Tiêm tĩnh mạch berberin clohydrat với liều lượng 19mg/kg trên chó đã cứu sống được súc vật bị nhiễm trùng huyết do Staphylococcus aureus [19]

2.1.5 CHẾ BIẾN

Hoàng liên có thể chế theo các phương pháp khác nhau [13]

*Hoàng liên chế giấm:

Hoàng liên 10 kg

Giấm 3kg

Nước vừa đủ để ngâm

Ngâm Hoàng liên vào giấm, trộn đều Sau khi mềm, lấy ra thái phiến Phơi khô, sao vàng

*Hoàng liên trích rượu

Hoàng liên lOkg

Rượu 35-40° 2kg

đem Hoàng liên phiến, tẩm rượu, ủ, sao nhỏ lửa đến khô (thường tói lúc đổi màu) thì dừng

*Hoàng liên sao vàng

Cho hoàng liên phiến vào nồi sao nhỏ lửa đến khi có màu vàng đậm

2.1.6 CÔNG NĂNG, CHỦ TRỊ

- Hoàng liên có vị đắng tính hàn qui vào các kinh tâm, can, vị và đại tràng, có tác dụng thanh nhiệt, thanh táo thấp, tả hoả, giải độc Hoàng liên còn được dùng như 1 vị thuốc bổ đắng có tác dụng kiện vị dùng điều trị tiêu hoá kém [2,3,13,14]

- Hoàng liên được dùng để chữa lỵ trực trùng, lỵ amíp ngày dùng từ 3-6

g chia làm 3 lần: uống 7-15 g/ngày dưới dạng thuốc sắc Chữa viêm dạ dày và ruột, uống 3-4g/ngày dạng thuốc sắc hoặc cao lỏng, ơ iữ a đau mắt đỏ (viêm kết mạc), dùng dung dịch Hoàng liên 5-30% nhỏ vào mắt [7]

- Chữa bệnh tăng huyết áp, phòng ngừa xơ vữa động mạch [7,12]

- Chữa viêm tai có mủ: Dùng dung dịch borat hoàng liên:

Hoàng liên lOg

Hoàng liên là vị thuốc có phổ kháng khuẩn rộng, có thể dùng đường uống, làm bột rắc thuốc rửa ngoài, có thể dùng thượng tiêu, trung tiêu và hạ tiêu Ta cần khai thác thế mạnh này

2.2 NÚC NÁC

2.2.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT :

Cây Núc nác còn gọi là So đo thuyền, Lin may, Hồ điệp, Ung ca (Lào- Vientian), K'nôc (Buôn Mê Thuột), Nam hoàng bá, Hoàng bá nam, Thiên tầng chỉ, Bạch ngọc nhi, Thiên trương chỉ (Vân nam), Triển giản (Quảng Tây)

Tên khoa học : Oroxylum indicum (L.)Vent, (Bignonia indica L., Closanthes indica blume.), thuộc họ Chùm ớt Bignoniceae

Cây to cao 7-12m, có thể cao tới 20-25 m,

thân nhẵn, ít phân nhánh vỏ cây màu xám tro,

nhưng khi bẻ có màu xám nhạt Lá to, 2-3 lần kép

lông chim, dài tới 2 m Lá chét hình bầu dục,

nguyên, đầu nhọn, dài 7,5-15cm, rộng 5-6,5 cm

Hoa màu đỏ tím, to thẫm, mọc thành chùm ở đầu

cành, dài tới Im, 5 nhị trong đó có 1 nhị nhỏ hơn

Quả nang to dài tối 50-80 cm, rộng 5-7 cm, ứong chứa

hạt, bao quanh có 1 màng mỏng, bóng và ttong, hơi

thành hình chữ nhật [7,10]

- Bộ phận dùng:

Cây Núc nác cung cấp cho ta 2 vị thuốc :

*vỏ Núc nác (Cortex Oroxyli ) là vỏ thân phơi hay sấy khô của cây Núc nác

*Hạt Núc nác (Semen Oroxyli) là hạt phơi hay sấy khô của cây Núc nác Hạt Núc nác làm thuốc có tên là Mộc hồ điệp[7,10]

2.2.2 Phân bố và trồng hái

Núc nác mọc hoang và được trồng khắp nơi ở nước ta, miền bắc cũng

như miền nam Còn mọc ở Trung Quốc (Phúc Kiến, Quảng Tây, Vân Nam,

Quý Qiâu, Tứ Xuyên, Hải Nam, Quảng Đông), Malaixia, Ấn độ, Lào, Cămpuchia v ỏ núc nác có thể thu hoạch gần như quanh năm, tốt nhất vào

Hình 1.2: Cây Núc nác Oroxylum indicum (L.)

mùa xuân hạ vỏ Núc nác màu nâu nhạt, trên có nhiều sẹo của cuống lá cũ và

có rất nhiều đám nhỏ nổi lên mặt trong khi còn tươi có màu vàng nhạt, không mùi vị đắng, hơi hắc [7,10]

2.2.3 Thành phần hoá học

Vỏ núc nác chứa 1 ít alcaloid, tanin và 1 số flavonoid thường thấy là:

- Oroxyiin A: công thức thô: C16ỈỈ12O5, cấu trúc là 5-7 dihydroxy 6- metoxy flavon, trọng lượng phân tử 284 Tinh tíiể màu vàng chanh độ chảy 230- 232°c, tan trong cồn, axeton, benzen nóng, trong kiềm, ether, acid acetic đặc

Baicalein hay noroxylin: 5-6-7 trihydroxyflavon, công thức thô

C15ỈỈ10O5 trọng lượng phân tử 270,2, tinh thể vàng, hình lăng trụ, độ chảy 264-

265°c, tan trong ethanol, methanol, ether, aceton, ethyl acetat, acid acetic đặc, trong kiềm loãng và cho màu vàng thẫm, trong acid sunfuric đặc cho màu vàng có huỳnh quang lục, ít tan trong cloroform, nitrobenzen

Crysin: 5-7 dihydroxyflavon, công thức thô: C15HJ0O14, trọng lượng phân tử: 254,23; tinh thể màu vàng nhạt chứa trong vỏ rễ, độ chảy 276°c,

không tan trong nước, tan trong dung dịch kiềm, ít tan trong cồn cloroform, ether có thể thăng hoa được

Tetuin: là baicalein kết hợp với glucoza ở vị trí 6, có tinh thể màu vàng nhạt, độ chảy 112-114°c

Các dẫn chất flavonoid có trong vỏ Núc nác từ 3-4 % (túih trên vỏ khô).

Đã chiết xuất được flavonoid toàn phần từ vỏ thân với hiệu suất trung bình từ 2-3 % so với trọng lượng khô, đã phân tích và tách riêng được 2 flavonoid, một chất đã xác định baicalein và chất khác có thể là oroxylin hoặc wegonin [7,10,17]

- Các kết quả nghiên cứu trên thực nghiệm đã xác minh kinh nghiệmnhân dân là vỏ Núc nác có tác dụng chống dị ứng rõ rệt.

- Vỏ Núc Nác tăng sức đề kháng của động vật thí nghiệm đối với 1 sốtác nhân bất lợi từ bên ngoài vào cơ thể Độc tính của vỏ Núc nác rất thấp

- Núc nác làm giảm độ thấm của mạch máu trên chuột đã gây mẫn cảm bằng lòng trắng trứng và không có ảnh hưởng đối với sự thấm của mạch máu trên chuột được gây mẫn cảm bằng huyết thanh ngựa trộn với dầu paraíin

- Núc nác ức chế vết sưng phồng do lòng trắng trứng gây ra Tác dụng chống viêm của Núc nác vẫn còn tồn tại sau khi đã cắt bỏ tuyến thượng thận[7,10]

Bột flavonoid của núc nác có tác dụng chống được choáng phản vệ cho chuột lang và thỏ với độ tin cậy của thí nghiệm từ 95-99%.

Bột flavonoid có tác dụng hạn chế hiện tượng viêm trên thỏ

Bột flavonoid không bảo vệ được choáng gây bởi liều cao histamin.Bột flavonoid không gây hiện tượng độc trên chuột nhắt [17]

trên lâm sàng ờ Bệnh viện Bạch Mai, quân y viện 108, có hiệu quả tốt đối với

một số triệu chứng bệnh như nổi mẩn ngứa ngoài da, mày đay lở sơn, các chứng dị ứng mãn tính như chàm, hen v v [17]

ở Ấn độ, người ta dùng vỏ rễ trị ỉa chảy, lỵ, vỏ thân làm thuốc bổ đắng

và trị tê thấp cấp tính [7]

2.3 HOÀNG ĐẰNG

2.3.1, Đặc điểm thực vật

Còn gọi là Nam hoàng liên, Thích hoàng liên,

tên khoa học: Fibrauria tinctoria Lour (Fibrauria

resica pieư.), thuộc họ tiết dê (Menispermaceae)

Cây Hoàng đằng Fibraurea resica là loại dây mọc

leo, thân rất cứng, to, lá mọc so le, dài 9 - 2 0 cm,

rộng 4-10 cm, cứng, ngắn, phiến lá hình 3 cạnh dài,

phía dưới trơn, có 3 gân chính rõ và 2 gân cong, Hình 1.5: Cây Hoàng đằng

Fibraurea tinctoria Lour

cuống dài 5-14 cm, có 2 nốt phình lên, một ở phía dưới, một ở phía trên Hoa mọc thành chuỳ 2-3 lần, phân nhánh dài 30-40 cm, ở các kẽ lá đã rụng[4,7,9,10].

2.3.2 Phân bố và trồng hái

Cây Hoàng đằng mọc hoang khắp nơi, ở vùng núi nước ta như Cao lạng

(Lạng sơn cũ), Hà sơn bình, Thanh hoá, Hà tuyên, Nghệ tĩnh Mùa thu hoạnh gần quanh năm, có thể thu hoạch cả cây [1 0]

LDgo uống đối với chuột nhắt trắng là 1260mg/kg[4,10]

2.2.5 Chế biến

+ Hoàng đằng phiến: sau khi thu hoạch, rửa sạch đất cát, tạp chất, thái phiến lát dày 1-3 mm, phơi hoặc sấy khô Nếu có rễ và thân khô thì ngâm, rửa sạch, ủ mềm, thái phiến vát như trên rồi phơi khô hoặc sấy khô [13]

2.2.6 Công năng, chủ trị

Hoàng đằng có tác dụng chữa đau mắt, sốt rét, lỵ, bệnh về gan, là thuốc

bổ đắng chữa viêm ruột, dạ dày, ỉa chảy

Palmatin clorua đã được bộ y tế cho sản xuất dưới dạng viên 0,02 g và dạng viên 5mg để chữa lỵ, ỉa chảy cho người lớn và trẻ em

Đơn thuốc có Hoàng đằng :

Hoàng đằng tán bột, làm thành viên 0,10 g, ngày uống 10-20 viên để chữa lỵ amip và trực trùng [1 0]

2.4 ĐỒNG SULFAT KỈĨAN [6]

CUSO4 Phân tử lượng : 159,6

Chế phẩm phải chứa 99,0-101,0% CUSO4, tính theo chế phẩm làm khô

2 4 1 T M CHẤT:

Bột màu xanh, rất hút ẩm Dễ tan trong nước, khó tan trong methanol, thực tế không tan trong ethanol

2.4 2 ĐỊNH TÍNH

Dung dịch: hoà tan 0.50g chế phẩm trong 10 ml nước:

- 2 ml dung dịch thêm vài giọt dung dịch Kali feroxianua (tt) sẽ hiện tủa màu đỏ

- 2 ml dung dịch thêm vài giọt dung dịch amoniac (tt), sẽ xuất hiện tủa xanh lơ, tan trong thuốc thử quá thừa tạo thành 1 một dung dịch có màu xanh lơ thẫm

- 2 ml dung dịch thêm 3-4 giọt dung dịch bari clorua (tt) sẽ xuất hiện tủa trắng, không tan trong acid

2.4.3 Thử tinh khiết: sắt, kim loại kiềm và kiềm thổ

Cân chúửi xác khoảng 2 g chế phẩm, hoà tan trong 60 ml nước, thêm 5 ml acid clohydric loãng (tt) và thêm nước vừa đủ lOOml Qio 1 luồng khí hidro sulfua chạy qua giấy lọc có nếp Lấy 50 ml dịch lọc (Ig chế phẩm) đem cô bốc hoi đến khô và nung tói khối lượng không đổi cắn thu được không quá 0,3%

2 4 4 ĐỊNH LƯỢNG:

Hoà tan 0,125 g chế phẩm trong 50 ml nước, thêm 2ml acid sulfuric đậm đặc (tt) và 3 g Kali iodid (tt) Chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfat0,1 N, chỉ thị là 1 ml hồ tinh bột cho vào cuối phép chuẩn độ

Iml DD Natri thiosulfat 0,1 N tương đương với 15,96 mg CUSO4

2 4 5 CÔNG DỤNG CỦA THUỐC:

Làm săn se, sát khuẩn

2 4 6 BẢO QUẢN:

Trong đồ đựng kín

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM

1.1 NGUYÊN LIỆU

• Chế phẩm Bột tam hoàng của BVYHCTCB.

• Thân rễ Hoàng liên chân gà (Coptis chmensis Pranch.), thu hái trên dãy núi Hoàng Liên Sơn- thôn Séo Mý Tỷ, xã Tả Van, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai.

• Thân rễ Hoàng liên Trung Quốc, mua ở phố Lãn ông, Hà nội.

• Thân rễ Hoàng đằng (Pibrauria tinctoria Lour- Pibraurea resica Pierre.),

họ Tiết dê (Menispermaceae), mua ở phố Lãn ông, Hà nội

• Vỏ thân Hoàng bá nam (Oroxylum indicum), họ Chùm ớt (Bignoniaceae), thu hái ở vườn Thực vật - Trường đại học Dược Hà nội vào

1.2 PHƯƠNG TIỆN

1.2.1 Thiết bị

Máy xác định độ ẩm của dược liệu: "Precisa HA -60" (Thuỵ Sĩ)

Máy cất quay thu hồi dung môi "Buchi"

Berberin chuẩn: từ trung tâm kiểm nghiệm Sở Y Tế Hà nội

Palmatin chuẩn: từ trung tâm kiểm nghiệm Sở Y Tế Hà nội

Vi khuẩn kiểm định do phòng thí nghiêm vi sinh- kháng sinh Bộ môn công nghiệp Dược Hà nội cung cấp

Các nguyên liệu dùng cho nghiên cứu kháng khuẩn như môi trường nuôi cấy vi sinh vật được chế tạo đúng tiêu chuẩn tại phòng thí nghiệm vi sinh- kháng sinh Bộ môn công nghiệp Dược Hà nội

• Nguyên tắc: dựa vào độ tan khác nhau của alcaloid trong dung môi phâncực và không phân cực Định lượng alcaloid theo phương pháp cân.

- Phương pháp 1:

D o Bột tam hoàng có Q1SO4 cho nên không tiến hành định lượng

alcaloid theo phương pháp kiềm hoá bột dược liệu để chiết alcaloid dưới dạng base mà dùng phương pháp chuyển alcaloid sang dạng muối bằng acid

+ Cách tiến hành: Dược liệu được chiết bằng dung dịch H2SO4 0,5%, loại tạp bằng ether ethylic, kiềm hoá, chiết bằng cloroform, tinh chế, sấy cắn đến khối lượng không đổi Cân, tính phần trăm theo dược liệu khô tuyệt đối

- Phương pháp 2:

Do Bột tam hoàng được sử dụng bằng phương pháp hoà và khuấy tan trong nước nóng 80 °c, do đó việc định lượng tiến hành bằng phương pháp khuấy từ vód dung môi là nước nóng (80°C) để khảo sát hàm lượng alcaloid được chiết ( có ý nghĩa trong điều trị cho bệnh nhân sau phẫu thuật thắt trĩ)

+ Cách tiến hành: Bột tam hoàng được chiết bằng nước trên máy khuấy

từ, để lắng, gạn lọc Dịch nước được kiềm hoá, chiết bằng cloroform Tinh chế, sấy cắn thu được đến khối lượng không đổi Cân, tính phần trăm theo dược liệu khô tuyệt đối Kết quả tính theo công thức (1)

1.3.1.3 Định lượng Flavonoid toàn phần bằng phương pháp cân [5,17]:

• Nguyên tắc : dựa vào độ tan của Flavonoid trong dung môi ethyl acetat.

- Cách tiến hành : cân chính xác 1 lượng dược liệu, chiết bằng nước trên máy khuấy từ, loại tạp bằng cồn, chiết bằng ethyl acetat Tinh chế, sấy cắn thu được đến khối lượng không đổi Cân, tính phần trăm theo dược liệu khô tuyệt đối Kết quả tính theo công thức (1)

* K ết quả và xử lý kết quả.

- Hàm lượng Alcaloid và Flavonoid được tính theo công thức;

Trong đó X : Hàm lượng hoạt chất có trong dược liệu (%)

(Trong đó : s là độ lệch chuẩn, ta tra bảng)

Khoảng tin cậy: X ± 8

Mỗi loại định lượng 6 mẫu, tức là n=6 Độ tin cậy 95%, tcc=l,571

vi sinh- kháng sinh -Bộ môn công nghiệp Dược, trường đại học Dược Hà Nội

1.3.3 PHƯƠNG PHÁP XÂY Dự^G TIÊU CHUẨN HOÁ b ộ t t a m h o à n g

Nguyên liệu Cách chế biến Kiểm định

* Định tính alcaloid

2 g bột dược liệu cho vào bình nón thêm 20 ml dung dịch H2SO4 IN đun sồi, để nguội, lọc dịch lọc vào bình gạn 1 0 0 ml, kiềm hoá dịch lọc bằng amoniac 6 N đến phản ứng kiềm (giấy quì)

Lắc với cloroform 3 lần, mỗi lần 10 ml, gộp dịch chiết cloroform cho vào bình gạn lắc với dung dịch H2SO4 IN 3 lần, mỗi lần 5 ml gộp các dịch chiết acid, lấy 3 ống ngiệm, mỗi ống cho 1 ml dịch chiết rồi thêm vào mỗi ống

1 -2 giọt thuốc thử

Ống 1: Thuốc thử Mayer - xuất hiện tủa trắng Phản ứng dương tínhỐng 2: Thuốc thử Bouchardar - xuất hiện tủa nâu Phản ứng dương tínhỐng 3: Thuốc thử Dragendorí - xuất hiện tủa đỏ gạch Phản ứng dương tính

* Định tính các hợp chất Aavonoid

- Qiiết xuất: 2g bột dược liệu cho vào ống ngiệm lớn, thêm 5 ml ethanol 90° Đun cách thuỷ đến sôi trong vài phút, lọc nóng, cô hết dịch lọc đến cắn, thêm 4 ml ethyl acetat hoà tan cắn, lấy dịch ethyl acetat để làm phản ứng

- Phản ứng Cyanidin: cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch ethyl acetat,thêm 1 ít bột magnesi kim loại (khoảng 10 mg), giỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-

5 giọt) thấy xuất hiện màu hồng Phản ứng dương tính

- Phản ứng với kiềm: cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch ethyl acetat,thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, thấy xuất hiện tủa vàng Thêm 1 ml nước cất, tủa tan và màu vàng của dung dịch được tăng thêm Phản ứng dương tính, giỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc, thấy màu vàng của dịch chiết được tăng lên Phản ứng dương tính

- Phản ứng vói FeCl3: cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm vài giọt dung dịch PeClg 5% xuất hiện tủa xanh đen Phản ứng dương tính

Ọ

- Phản ứng với Pb(CH3COO)2 10%: trong ống nghiệm nhỏ, cho 1 ml dịch chiết, thêm 1 ml dung dịch Pb(CH3COO)2 1 0% thấy tủa trắng vàng Phản ứng dưoỉng tính.

* Ta biết rằng 1 số flavonoid có OH ở vị trí 3,5 có phản ứng với một số kim loại nặng do phản ứng đóng vòng (phản ứng càng cua) [22] Trong Bột tam hoàng của BVYHCTCB có thành phần ion do đó chúng tôi đã tiến hành thử phản ứng trên theo cách sau đây:

+Lấy riêng bột hoàng bá nam chiết theo phương pháp trên rồi tiến hành các phản ứng trên đều cho các kết quả dương tính

+Lấy riêng bột hoàng bá nam chiết theo phương pháp trên rồi dùng thuốc thử là CUSO4 1% thấy xuất hiện tủa màu vàng đậm Như vậy có xảy ra phản ứng giữa flavonoid và CUSO4 trong dung dịch

* Định tính anthraglycosid

- Phản ứng bomtraeger: cân 2 g dược liệu cho vào bình nón dung tích

50 ml, thêm 15 ml dung dịch H2SO4 10%, đun cách thuỷ 15 phút, lọc, để nguội cho vào bình gạn, lắc với 10 ml ether ethylic, gạn lấy lớp ether, thêm 8

ml dung dịch NaOH 10% vào lớp ether, lắc, không thấy đổi màu, lớp kiềm hoà lẫn với lớp ether Phản ứng âm tính

* Định tính đường khử

- Cân 2 g dược liệu cho vào ống nghiệm thêm 10 ml nước cất đun cách thuỷ

15 phút, lọc Cho vào 2 ống nghiệm lớn mỗi ống 2 ml dịch chiết dược liệu:

+ Thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling A

+ Thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling B

Đun cách thuỷ vài phút, thấy xuất hiện kết tủa đỏ gạch Phản úng dương tính

- Phản ứng tráng bạc: trong ống nghiệm to, cho 2 ml dịch chiết, thêm 2

ml thuốc thử Tollens Lắc nhẹ, đun cách thuỷ trong 15 phút, quan sát thấy tủa đen ánh bạc bám xung quanh thành ống nghiệm Phản ứng dương tính

- Phản ứng với Chì acetat 10%, xuất hiện tủa bông Phản ứng dương tính.

*Định tính acid hữu cơ

Lấy Ig bột dược liệu, thêm 5 ml nước cất, đun sôi trong vài phút, lọc, lấy 3 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm thêm tinh thể Na2C0 3 Không thấy bọt khí nổi lên Phản ứng âm tính

*Định tính sterol

Lấy khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm

40 ml cồn 25°, ngâm 24 h, gạn dịch chiết, loại tạp bằng chì acetat 30% dư, lọc

bỏ tủa, lắc dịch lọc với cloroform 2 lần, mỗi lần 10 ml trong bình gạn, gạn lấy lớp cloroíorm làm phản ứng:

* K ết q u ả đ ịn h tính thành phần hoá học củ a B ột tam h oàng được trìn h bày ở bảng 1.

Bảng 1: Kết quả định tính thành phần hoá học của Bột tam hoàng

TT Nhóm chất Thuốc thử - phản ứng Kết quả Đánh giá

Phản ứng với thuốc thử Fehling(A và B)

*ĐỊnh tính bằng sắc kí lớp mỏng

• Định tính alcaloid bằng SKLM:

Bản mỏng silicagel G kích thước 5 X 9 cm được hoạt hoá ở 110°c trong Ih

a Dung môi khai triển: