DEVELOPMENT OF A NOVEL DRUG DELIVERY SYSTEM — LIPID SUBMICRO-EMULSION OF TRIBUTYRIN SU JIE (M.S., China Pharmaceutical University) A THESIS SUBMITTED FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY DEPARTMENT OF PHARMACY NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE 2005 Acknowledgements First, I want to thank my supervisor A/P Ho Chi Lui, Paul, for his continuous support of my study. A/P Ho was always there to listen and give me advice. He taught me how to ask questions and express my ideas. He showed me different ways to approach a research problem and the need to be persistent to accomplish my goals. He encouraged me when I was doubtful of myself, and provided me guidances when I needed them. Without his encouragements and guidances, I could not have accomplished my study. Thanks are also extends to A/P Li Shu Chuen and Dr Chui Wai Keung, who, as my Ph.D. qualifying examination examiners, had given me many constructive suggestions at the infancy stage of project. I am also grateful to the following lecturers for their teaching on the respective subjects: A/P Li Shu Chuen on “Drug Information, Critical Literature Evaluation and Biostatistics”, A/P Lim Lee Yong on “Advances in Drug Delivery”, Dr Koh Hwee Ling and Dr Seetharama D.S. Jois on “Pharmaceutical Analysis”, Prof Ang How Ghee and A/P Novak Igor on “Research Methodology”, Dr Young Carissa on “English for Graduates (Intermediate Level)”, Dr Wong Lian Aik on “English for Graduates (Speaking/Listening)”, Dr Ho Laina on “English for Graduates (Advanced Level)”. Thanks are also due to Mr Tang Chong Wing and Ms Ng Swee Eng for their help in repairing faulty instruments, and provides countless supports during my project. Let me also say “thank you” to the following people: Ms Ng Sek Eng, Ms Tham-Wong Pheng, Ms Oh Tang Booy, Ms Wong Lai Peng, Ms Ang Li Kiang, Ms Lee Hua Yeong. Also thanks to the graduates ever in our laboratory for being fun to be with: Dr Du Yuhong, Dr Lin Haishu, Mr Chen Yong, Dr Sam Wai Johnn, Mr Wang Lingzhi, Ms Liu Xin, Ms Wu Jinzhu, and Ms Ong Peishi. i ACKNOWLEDGEMENTS Last and but not least, I thank my parents for giving me life in the first place, for educating me with aspects from both arts and sciences, for unconditional support and encouragement to pursue my interests; my wife for her silent and selfless devotion to our family and continuing support to me and her understanding; my lovely son for the happiness he is giving me; my brother’s and sister’s families for their support me, and their numerous treats of delicious meals. I was granted the scholarship from the National University of Singapore during my pursuing Ph.D. Su Jie August 2005 ii Table of Contents CONTENTS PAGE Summary· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · I List of Tables· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · V List of Figures· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · VII List of Symbols· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · XI Chapter Introduction· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 1.1 Butyric Acid from Diet· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 1.1.1 Butyric Acid as a Chemotherapeutic Agent· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 1.1.2 Tributyrin as a Chemotherapeutic Agent· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 1.2 Colloidal Drug Carriers· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 1.2.1 Classification of Drug Delivery Systems· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 1.2.2 Samples of Drug Delivery Systems· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 11 1.3 Lipoproteins· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 13 1.3.1 Structure and Composition of Lipoproteins· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 13 1.3.2 Low-density Lipoprotein Receptor as Drug Delivery Target· · · · · 15 1.3.3 Development of LDL-like Particles· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 17 1.4 Emulsion as Drug Carrier System· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 21 1.4.1 Rationale for Development of Lipid Submicro-emulsion· · · · · · · · 22 1.4.2 Metabolic Pathways of Lipid Submicro-emulsion· · · · · · · · · · · · · · · 25 1.4.3 Factors Affecting the Distribution of Lipid Submicro-emulsion· · 27 1.4.4 Controlled Biodistribution of Lipid Submicro-emulsion· · · · · · · · · 32 1.5 Statement of Purpose· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 35 Chapter Preparation of Tributyrin Emulsion· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 38 iii TABLE OF CONTENTS 2.1 Introduction· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 39 2.2 Materials· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 40 2.3 Methods· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 40 2.3.1 Preparation of Tributyrin Emulsion· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 40 2.3.2 Determination of Particle Size· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 41 2.3.3 Determination of Zeta Potential· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 41 2.3.4 Differential Scanning Calorimetry Measurements· · · · · · · · · · · · · · · 42 2.3.5 Shaking Test· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 42 2.3.6 Statistical Analysis· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 43 2.4 Results and Discussion· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 43 2.4.1 Amount of Emulsifier in Emulsion Formulation· · · · · · · · · · · · · · · · · 43 2.4.2 Properties of Emulsion Prepared with Different Lecithins · · · · · · · 45 2.4.3 Effect of Secondary Emulsifier on the Properties of Emulsion· · · 46 2.4.4 Effect of Cholesterol on the Properties of Emulsion· · · · · · · · · · · · · 48 2.4.5 Comparison of Different Methods for Preparing Tributyrin Emulsion· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 51 2.4.6 Physical Stability Test of the Emulsion· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 52 2.5 Conclusion· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 54 2.6 Sub-summary· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 54 Chapter Interaction of Tributyrin Emulsion with Lipoproteins· · · · · · 56 3.1 Introduction · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 57 3.2 Materials· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 58 3.3 Methods· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 59 3.3.1 Preparation of Tributyrin Emulsion· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 59 3.3.2 Characterization of Tributyrin Emulsion· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 59 iv TABLE OF CONTENTS 3.3.3 Component Analysis of Emulsion· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 60 3.3.3.1 Analysis of Tributyrin and Cholesterols· · · · · · · · · · · · · · · · · · · 60 3.3.3.2 Analysis of Phospholipid· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 61 3.3.4 Preparation of Lipoprotein Fractions· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 61 3.3.4.1 Rotor and Tube Selection for Lipoprotein Fractionation· · · · 61 3.3.4.2 Isolation of LDL and HDL· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 63 3.3.5 Mass Determination of LDL and HDL· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 63 3.3.6 Identification of LDL and HDL by SDS-PAGE· · · · · · · · · · · · · · · · · 64 3.3.7 Interaction of Tributyrin Emulsion with LDL and HDL· · · · · · · · · · 65 3.3.7.1 Agarose Gel Electrophoresis· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 65 3.3.7.2 Electron Micrographs of Emulsion-LDL Complex· · · · · · · · · 66 3.3.7.3 Theoretical Isothermal Binding Equation · · · · · · · · · · · · · · · · · 66 3.3.7.4 Characterization of the Binding Parameters · · · · · · · · · · · · · · · 67 3.4 Results· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 68 3.4.1 Validation of HPLC Assay · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 68 3.4.2 Characterization of Tributyrin Emulsion and Lipoproteins· · · · · · · 72 3.4.3 Interaction of Tributyrin Emulsion with LDL and HDL· · · · · · · · · · 73 3.4.4 Electron Micrographs of Emulsion-LDL Complex · · · · · · · · · · · · · 76 3.4.5 Binding Parameters of Emulsion-LDL Complex· · · · · · · · · · · · · · · · 77 3.5 Discussion· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 80 Chapter Determination of Tributyrin and Butyrate in Rat Plasma by GC/MS· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 83 4.1 Introduction· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 84 4.2 Materials· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 85 4.3 Methods· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 85 v TABLE OF CONTENTS 4.3.1 Selection of Inhibitors and Stability of Tributyrin · · · · · · · · · · · · · · · 85 4.3.2 Sample Preparation for the Assays· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 86 4.3.3 Apparatus and Chromatographic Conditions· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 87 4.3.4 Assay Validation· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 87 4.4 Results and Discussion· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 88 4.4.1 Selection of Inhibitors and Stability of Tributyrin· · · · · · · · · · · · · · · 88 4.4.2 Assay Validation· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 92 4.5 Conclusion· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 97 Chapter Pharmacokinetic Study of Tributyrin Emulsion in Rats· · · · 98 5.1 Introduction· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 99 5.2 Materials and Methods· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 100 5.2.1 Materials· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 100 5.2.2 Animals· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 100 5.2.3 Study Design· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 100 5.2.4 Pharmacokinetic Experiments· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 101 5.2.5 Pharmacokinetic Analysis· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 102 5.3 Results· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 104 5.3.1 Pharmacokinetics of Butyrate and Tributyrin after Oral Administration· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 104 5.3.2 Pharmacokinetics of Butyrate and Tributyrin after Infusion· · · · · · 107 5.4 Discussion · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 109 Chapter Cellular Activity of Tributyrin Emulsion in Carcinoma Cells· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 113 6.1 Introduction· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 114 6.2 Materials and Methods· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 115 vi TABLE OF CONTENTS 6.2.1 Materials· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 115 6.2.2 Cell Culture· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 115 6.2.3 DNA Fragmentation Assay· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 116 6.2.4 LDL Receptors on Caco-2 and HepG2 Cell Lines· · · · · · · · · · · · · · · 117 6.2.5 Growth Inhibition Measured by MTT Assay· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 117 6.2.5.1 Correlation between Cell Numbers and Absorbance· · · · · · · 117 6.2.5.2 MTT Assay· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 118 6.2.6 Competitive Uptake of Lipid Submicro-emulsion and LDL· · · · · · 118 6.3 Results· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 119 6.3.1 DNA Fragmentation Assay· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 119 6.3.2 LDL Receptors in Caco-2 and HepG2 Cell Lines· · · · · · · · · · · · · · · · 120 6.3.3 Correlation between Cell Numbers and Absorbance· · · · · · · · · · · · · 120 6.3.4 Growth Inhibition in Caco-2 and HepG2 Cell Lines· · · · · · · · · · · · · 121 6.3.5 Competitive Uptake of Lipid Submicro-emulsion and LDL· · · · · · 123 6.4 Discussion· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 125 Chapter Pharmacokinetics of ATRA Using Tributyrin Emulsion as a Carrier· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 127 7.1 Introduction· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 128 7.2 Materials and Methods· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 129 7.2.1 Materials· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 129 7.2.2 HPLC Assay· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 129 7.2.3 Preparation of ATRA Solution and Emulsion· · · · · · · · · · · · · · · · · · · 130 7.2.4 Interaction of ATRA Emulsion with Lipoprotein Fractions· · · · · · 131 7.2.5 Animals· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 131 7.2.6 Pharmacokinetic Experiments· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 132 vii TABLE OF CONTENTS 7.2.7 Pharmacokinetic Analysis· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 133 7.2.8 Growth Inhibition in Caco-2 and HepG2 Cells· · · · · · · · · · · · · · · · · · 133 7.2.9 Statistical Analysis· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 134 7.3 Results· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 134 7.3.1 Interaction of ATRA Emulsion and Lipoproteins· · · · · · · · · · · · · · · · 134 7.3.2 Pharmacokinetics· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 136 7.3.3 Growth Inhibition in Caco-2 and HepG2 Cells· · · · · · · · · · · · · · · · · · 138 7.4 Discussion· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 139 Chapter Final Conclusions and Future Studies · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 143 8.1 Final Conclusions· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 144 8.2 Future Studies· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 146 Bibliography· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 148 Publications· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 187 Appendix· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 189 viii Summary Tributyrin is a prodrug hydrolyzed by cellular lipases or esterases. After oral administration, tributryin yields 3-fold more butyric acid than sodium butyrate, which has an elimination half-life of several minutes. As a prodrug, tributyrin produces sustainable plasma level of butyric acid and can overcome the pharmacokinetic drawbacks of natural butyric acid as a drug. The hypothesis for this project was that by formulating tributyrin into a lipid submicro-emulsion (1) could improve its bioavailability, (2) increase its delivery to cancer cells and (3) decrease the dose needed which leads to reduction in toxicity. Structurally, lipid submicro-emulsion resembles the lipid portion of the native low-density lipoprotein (LDL). It can bind to LDL or acquire apolipoprotein(s) from high-density lipoprotein (HDL). This modification enables lipid submicro-emulsion particle to be taken up by the cell via the LDL receptor-mediated pathway. The objectives of the project were (1) to develop an optimal method of preparation of lipid submicro-emulsion and (2) characterize the lipid submicroemulsion of tributyrin (tributyrin emulsion). Lipid submicro-emulsion prepared with 1.2% PC-60 (emulsifier) had a particle size of about 230 nm and a zeta potential of 50 mV. Further increase in the percentage of PC-60 did not reduce the particle sizes. Emulsion with particle size of 260 nm and zeta potential of -30 mV was also produced using Lipoid E80 as an emulsifier. The secondary emulsifier, sodium oleate can further lower the zeta potential of the submicro-emulsion prepared from Lipoid E80 to -40 mV. While it cannot change the zeta potential of the submicro-emulsion prepared from PC-60. Addition of a hydrophilicsurfactant, Pluronic® F68, however, cannot exert an effect of size reduction on the emulsion droplet. Cholesterol, an I BIBLIOGRAPHY Schroder CP, Maurer HR. 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Investigation of tributyrin emulsion with LDL in vitro and pharmacokinetic property in vivo. 17th Singapore Pharmacy Congress, Singapore, 1-4 July 2005. 188 APPENDIX 189 APPENDIX SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) A.1 Stock Solutions and Buffers Acrylamide/Bis (30% T, 2.67% C) Acrylamide 87.6 g N’N’-bis-methylene-acrylamide 2.4 g Make to 300 ml with deionized water. Filter and store at 4°C in the dark (30 days maximum). 10% (w/v) SDS Dissolve 10 g SDS in 90 ml water with gentle stirring and bring to 100 ml with deionized water. 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 Tris base 27.23 g Deionized water 80 ml Adjust to pH 8.8 with N HCl. Bring total volume to 150 ml with deionized water and store at 4°C. 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 Tris base 6g Deionized water 60 ml Adjust to pH 6.8 with N HCl. Bring total volume to 100 ml with deionized water and srore at 4°C. Sample Buffer (SDS Reducing Buffer) 190 APPENDIX Deionized water 3.55 ml 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.25 ml Glycerol 2.5 ml 10% (w/v) SDS 2.0 ml 0.5% (w/v) Bromophenol blue 0.2 ml Store at room temperature. Use: Add 50 μl 2-Mercaptoethanol to 950 μl sample buffer prior to use. Dilute the sample at least 1:2 with sample buffer and heat at 95°C for minutes. 10 × Electrode (Running) Buffer, pH 8.3 Tris base 30.3 g Glycine 144.0 g SDS 10.0 g Dissolve and bring total volume up to 1000 ml with deionized water. Do not adjust pH with acid or base. Store at 4°C. If precipitation occurs, warm to room temperature before use. Use: Dilute 50 ml of 10 × stock with 450 ml deionized water for each electrophoresis run. Mix thoroughly before use. 10% APS (Fresh daily) Ammonium persulfate 100 mg Dissolve in ml of deionized water. A.2 Gel Formulation (10 ml) Prepare the monomer solution by mixing all reagents except the TEMED and 10% APS. Degas the mixture for 15 minutes. 191 APPENDIX Resolving gel (7%) 30% Degassed Acrylamide/Bis 2.3 ml 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 2.5 ml 10% SDS 0.1 ml Double deionized water 5.1 ml Immediately prior to pouring the gel, add: 50 μl 10% APS and μl TEMED. Swirl gently to initiate polymerization. Stacking gel (4%) 30% Degassed Acrylamide/Bis 1.3 ml 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 2.5 ml 10% SDS 0.1 ml Double deionized water 6.1 ml Immediately prior to pouring the gel, add: 50 μl 10% APS and 10 μl TEMED. Swirl gently to initiate polymerization. A.3 Electrophoresis Gel electrophoresis was carried out with Mini-PROTEAN II vertical slab gel apparatus in which two minigels are run simultaneously at 50 V/gel for about hours. The concentration of stacking gel was 4% and the concentration of resolving gel was 7% or 5%. After electrophoresis, minigels are stained for 18-22 hours in tray containing 100 ml (200 ml for larger gels) of 0.25% Coomassie Brilliant Blue R-250 in methanol-water-acetic acid (5:5:1, v/v/v) and destained for 7-8 hours with at least four changes of 150 ml (250 ml for larger gels) of methanol-water-acetic acid (5:5:1, v/v/v). Alternatively, addition of Kimwipe tissue to one corner of the staining tray will help remove Coomassie blue from the gel without changing the destaining 192 APPENDIX solution, minimizing the waste volume generated. The gel can be stored in 5% methanol, 7% acetic acid. To minimize cracking, add 1% glycerol to the last destain before drying the gel. Staining and destaining are done at room temperature and under constant agitation on an orbital shaker. 193 [...]... been directed toward the development of delivery systems which will allow the fate of drugs within the patient to be controlled by modifying these processes Although drug carriers usually act on the second process – drug distribution within the organism – they may also affect absorption, metabolism, and elimination 1.2.1 Classification of Drug Delivery Systems Drug delivery systems can be classified... drug can be administrated orally In phase I study, tributyrin was formulated as white, soft gelatin capsules containing 500 mg of tributyrin without additives [Conley et al., 1998] Therefore, the delivery of a 400 mg/kg dose of tributyrin to a 70 kg patient would involve a total dose of 28 g of 8 INTRODUCTION tributyrin, which would require the ingestion of 56 capsules Clearly this is an unpalatable strategy... suggests tributyrin could be used as a genetic vaccine "enhancer" [Giermasz et al., 2001a] A systemic treatment of mice inoculated with murine Lewis lung carcinoma cells with combination of tributyrin and lovastatin resulted in significant tumor growth retardation [Giermasz et al., 2002] As a prodrug of butyrate, tributyrin does overcome many of the problems of the parent compound Most importantly, the drug. .. concentrations of butyrate and tributyrin in rats after continuous infusion of 5%, 10% or 15% tributyrin emulsion to normal rats or 10% emulsion to rats pre-treated with 17α-ethynylestradiol· · · · · 107 6-1 Induction of DNA fragmentation by incubation of the cells in medium with pure tributyrin or tributyrin emulsion· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 119 6-2 Immunofluorescence images of Caco-2... requiring doses of 400 mg/kg to be ingested two, three, or four times daily It may be that an alternative formulation of tributyrin, such as an oral particulate system, a custard-type preparation, or a spread, would greatly facilitate the delivery of increased doses and more frequent dosing schedules 1.2 Colloidal Drug Carriers The fate of a drug in vivo administration is determined by a combination of several... tributyrin emulsion than pure tributyrin The addition of native LDL in the cell culture medium increased the survival index of the cells treated with the tributyrin emulsion This illustrated the competitive uptake of the emulsion and the native LDL by the LDL receptors on the cell membranes of the Caco-2 and HepG2 cells Finally, tributyrin emulsion was used as a drug delivery system for all-transretinoic... piloted by monoclonal antibodies or other ligands Of course, targeted colloidal carriers will be much more effective if they are also sterically stabilized 1.2.2 Samples of Drug Delivery Systems As far as the physical form of drug delivery systems is concerned, these can be molecular or particulate Molecular carriers include soluble polymers to which drug molecules have been covalently attached, sometimes... effect of pure tributyrin or tributyrin emulsion in Caco-2 and HepG2· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 122 6-5 Inhibitory effect of pure tributyrin or tributyrin emulsion in the presence of LDL in Caco-2 and HepG2· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 124 IX LIST OF FIGURES 7-1 Electrophoretic mobility of. .. emulsion at the dose of 2 g/kg· · · · · · · · · · · · 106 V LIST OF TABLES 5-2 Pharmacokinetic parameters describing butyrate and tributyrin concentrations achieved in rat plasma after infusion of 5%, 10% and 15% emulsion of tributyrin at the dose of 1, 2 and 3 g/kg· · · · · · · · · · · · · · · · · · 109 7-1 Pharmacokinetic parameters of ATRA in rat plasma after intravenous injection of ATRA solution or... to deliver the drug to a site distant from the site of administration 11 INTRODUCTION The widely used microparticulate drug delivery systems normally include liposomes, suspensions (drug particles, microspheres, nanospheres, microcapsules, nanocapsules) and emulsions Liposomes consist of one or more phospholipid bilayers enclosing an aqueous phase They were first proposed as carriers of biologically . DEVELOPMENT OF A NOVEL DRUG DELIVERY SYSTEM — LIPID SUBMICRO-EMULSION OF TRIBUTYRIN SU JIE (M.S., China Pharmaceutical. ······································· 9 1.2.1 Classification of Drug Delivery Systems· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 9 1.2.2 Samples of Drug Delivery Systems· · · · · · · · · · · · · · · · · · ·. 1.4 Emulsion as Drug Carrier System ···································21 1.4.1 Rationale for Development of Lipid Submicro-emulsion· · · · · · · · 22 1.4.2 Metabolic Pathways of Lipid Submicro-emulsion·